การสลายตัวด้วยด่าง
การสลายด้วยด่างเป็นกระบวนการแยกและสกัดกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) จากพลาสมิด และแหล่ง นอกโครโมโซมอื่นๆที่มีอยู่ในเซลล์ เช่น เซลล์แบคทีเรีย เป็นวิธีการมาตรฐานที่ใช้ในชีววิทยาโมเลกุลเพื่อแยก DNA พลาสมิดโดยไม่ได้รับDNA โครโมโซมหรือจีโนมการสลายด้วยด่างครั้งแรกดำเนินการโดย Birnom และ Doly ในปี 1979 [ 1 ]มีขั้นตอนที่หลากหลาย แต่กระบวนการสลายด้วยด่างโดยทั่วไปสามารถสรุปได้ด้วยขั้นตอนต่อไปนี้: การก่อตัวของเซลล์ที่ตกตะกอน การแขวนตะกอนในสารละลายการสลาย เซลล์ การทำให้เป็นกลางและการปั่นเหวี่ยง [ 2 ] การสลายด้วยด่างใช้ประโยชน์จากองค์ประกอบทางกายภาพที่เล็กและขดตัวของ DNA พลาสมิดเมื่อเทียบกับ DNA โครโมโซม พร้อมกับความสามารถในการเชื่อมต่อ DNA สองสายใหม่ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม ทำให้สามารถแยก DNA พลาสมิดออกจาก DNA โครโมโซมและส่วนประกอบอื่นๆ ของเซลล์ได้
วิธี
การสลายด้วยด่างมักเป็นขั้นตอนเริ่มต้นในการทดลองทางชีววิทยาโมเลกุล ซึ่งช่วยให้สามารถสกัดและทำให้บริสุทธิ์โมเลกุล DNA เฉพาะ เพื่อนำไปใช้ในขั้นตอนต่อไปได้ เมื่อดำเนินการอย่างถูกต้อง การสลายด้วยด่างจะให้ DNA บริสุทธิ์จากพลาสมิดของแบคทีเรียเท่านั้น พลาสมิดเป็น โมเลกุล DNA วงกลมขนาด เล็ก ที่พบได้ตามธรรมชาติในเซลล์บางชนิด โดยส่วนใหญ่พบในเซลล์แบคทีเรีย และสามารถจำลองตัวเองได้อย่างอิสระจากโครโมโซมหรือจีโนม DNA ของเซลล์ พลาสมิดยังพบได้ใน เซลล์ อาร์เคียและยูคาริโอตได้ เช่นกัน แต่พบได้น้อยกว่า พลาสมิด มักมีข้อมูลทางพันธุกรรมที่เป็นประโยชน์ต่อเซลล์เจ้าบ้าน เช่น ยีนที่ให้ความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะหรือปัจจัยก่อโรคพลาสมิดสามารถถูกดูดซึมเข้าสู่เซลล์แบคทีเรียจากสิ่งแวดล้อมได้อย่างง่ายดาย และสามารถส่งต่อระหว่างเซลล์ได้โดยการส่งผ่านในแนวนอน หลายรูปแบบ เช่น การถ่ายทอดทาง พันธุกรรม (transduction) การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม ( transformation ) และการผสมพันธุ์ (conjugation ) รวมถึงการส่งผ่านในแนวตั้งจากพ่อแม่สู่ลูก เนื่องจากความสามารถรอบด้านและการจัดการที่ค่อนข้างง่าย พลาสมิดจึงเป็นที่สนใจของนักวิทยาศาสตร์และกลายเป็นเครื่องมือมาตรฐานในห้องปฏิบัติการที่ใช้ ในการนำ ดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่เซลล์และจีโนมโดยวิธีการประดิษฐ์
กระบวนการพื้นฐานของการสลายตัวด้วยด่างประกอบด้วยขั้นตอนต่างๆ ซึ่งสามารถดำเนินการได้ในห้องปฏิบัติการ:
ขั้นตอนที่ 1: การก่อตัวของกลุ่มเซลล์
ขั้นตอนแรก นำตัวอย่างที่มีเซลล์แบคทีเรีย ซึ่งมักจะเพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการมาปั่นเหวี่ยงเพื่อให้เซลล์ตกตะกอนอยู่ที่ก้นหลอดทดลอง การปั่นเหวี่ยงช่วยแยกเซลล์แบคทีเรียออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อและเศษสิ่งสกปรกอื่นๆ ที่อาจมีอยู่ในตัวอย่าง จากนั้นจึงทิ้งอาหารเลี้ยงเชื้อส่วนบน เหลือไว้เพียงเซลล์ที่ตกตะกอนอยู่ที่ก้นหลอดทดลอง
ขั้นตอนที่ 2: การแขวนลอยใหม่
จากนั้นตะกอนจะถูกแขวนลอยใหม่ในสารละลายบัฟเฟอร์ที่มีEDTA , Tris-HCl , กลูโคสและไรโบนิวคลีเอส กรดเอทิลีนไดอะมีนเตตระอะเซติก (EDTA) เป็นสารคีเลตที่จับกับไอออนโลหะ โดยส่วนใหญ่เป็นไอออนสองวาเลนต์หรือสามวาเลนต์ ในขั้นตอนนี้ EDTA ถูกเติมเข้าไปเพื่อจับกับไอออนแคลเซียมและแมกนีเซียม ซึ่งพบได้ตามธรรมชาติในเซลล์และถูกใช้โดย เอนไซม์ DNaseในการตัด DNA สองสาย การกักเก็บไอออนเหล่านี้ด้วย EDTA จึงป้องกันไม่ให้ DNase ย่อยสลาย DNA พลาสมิด Tris-HCl เป็นสารละลายบัฟเฟอร์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายซึ่งช่วยรักษาระดับ pH ให้คงที่และปกป้องความสมบูรณ์ของ DNA [ 3 ] Tris-HCl มีความจำเป็นเนื่องจากสภาพแวดล้อมที่มี pH สูง (ด่าง) ที่ต้องสร้างขึ้นชั่วคราวเพื่อเปิดเซลล์และปล่อยสารภายในออกมา กลูโคสเป็นออสโมไลต์ซึ่งเป็นโมเลกุลที่ช่วยควบคุมความเครียดจากออสโมซิส มีการเติมเอนไซม์นี้เพื่อป้องกันไม่ให้เซลล์แตกตัวอย่างควบคุมไม่ได้และทำให้ดีเอ็นเอเสียหาย เอนไซม์อาร์เอ็นเอเซสเป็นเอนไซม์ที่ย่อยสลายโมเลกุลอาร์เอ็นเอ ป้องกันการปนเปื้อนของพลาสมิดดีเอ็นเอด้วยโมเลกุลอาร์เอ็นเอใดๆ ที่อาจมีอยู่ในเซลล์
ขั้นตอนที่ 3: การสลายเซลล์
จากนั้นจึงใช้โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) และโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) ในการสลายเซลล์ โซเดียมไฮดรอกไซด์เป็นเบสที่แรงซึ่งจะเพิ่มค่า pH ของสารละลายอย่างมาก ทำให้เกิดสภาพแวดล้อม ที่เป็นด่างซึ่งจะไปทำลายชั้นฟอสโฟลิปิดสองชั้นที่ประกอบเป็นเยื่อหุ้มเซลล์ และทำลายพันธะไฮโดรเจนระหว่างสายคู่ของดีเอ็นเอโครโมโซมแบบสองสาย ทำให้กลายเป็นสายเดี่ยว แม้ว่าดีเอ็นเอพลาสมิดจะเป็นแบบสองสายและสามารถแยกตัวออกเป็นสายเดี่ยวได้เช่นกัน แต่ลักษณะที่เป็นเกลียวแน่นมากของมันจะป้องกันไม่ให้สายแต่ละสายแยกออกจากกันในสารละลาย ทำให้พวกมันสามารถกลับมารวมตัวกันใหม่ได้ในภายหลัง โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตเป็น สารลด แรงตึงผิวประจุ ลบ ที่แทรกตัวเข้าไปในชั้นฟอสโฟลิปิดสองชั้น ทำลายปฏิกิริยาไฮโดรโฟบิกที่ประกอบเป็นเยื่อหุ้มเซลล์ ดังนั้น โซเดียมไฮดรอกไซด์และสารซักฟอก SDS จึงทำงานร่วมกันเพื่อสลายเซลล์เจ้าบ้านและปลดปล่อยสารภายในเซลล์ ซึ่งรวมถึงโมเลกุล DNA ทั้งโครโมโซมและพลาสมิด ออกมาสู่สารละลาย
ขั้นตอนที่ 4: การทำให้เป็นกลาง
คุณสมบัติหนึ่งของ DNA คือความสามารถในการกลับมาเชื่อมต่อกันเป็นโมเลกุลสองสายเมื่อสภาวะ pH เป็นกลาง ภายใต้สภาวะที่เป็นกลาง พันธะไฮโดรเจนจะก่อตัวขึ้นใหม่ระหว่างคู่เบสที่เสริมกัน เนื่องจากพลาสมิดขดตัวแน่นและมีขนาดเล็กก่อนที่จะเกิดสภาวะด่าง จึงสามารถกลับมาเชื่อมต่อกันได้ง่าย อย่างไรก็ตาม DNA ของโครโมโซม เนื่องจากมีสายยาว จึงไม่สามารถกลับมาเชื่อมต่อกันได้[ 1 ]
ขั้นตอนที่ 5: การปั่นเหวี่ยง
เมื่อดีเอ็นเอพลาสมิดรวมตัวกันเป็นโมเลกุลสองสาย มันจะละลายในสารละลายโพแทสเซียมอะซิเตตทำปฏิกิริยากับผงซักฟอก SDS ไอออนแมกนีเซียม และไอออนแคลเซียมที่มีอยู่ในสารละลายอยู่แล้ว และก่อตัวเป็นโพแทสเซียมโดเดซิลซัลเฟต (KDS) ซึ่งเป็นของแข็งสีขาวที่ไม่ละลายน้ำ และ ตกตะกอนออกจากสารละลาย[ 4 ]สายดีเอ็นเอโครโมโซมที่เหลือ โปรตีน ที่เสียสภาพและสารเคมีที่เติมเข้าไปจะเกาะติดกันและตกตะกอนออกมาพร้อมกับ KDS อย่างไรก็ตาม ดีเอ็นเอพลาสมิดยังคงละลายอยู่ในสารละลายเหลว โดยปกติแล้วจะนำสารละลายไปปั่นเหวี่ยงเพื่อเก็บตะกอนที่ไม่ละลายน้ำไว้ในก้อนตะกอนที่ด้านล่างของหลอดตัวอย่าง และแยกตะกอนเหล่านั้นออกจากสารละลายส่วนบน
สารเคมี
- โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS)
- โซเดียมไฮดรอกไซด์
- กรดเอทิลีนไดอะมีนเตตระอะเซติก (EDTA)
- ไตรส์ไฮโดรคลอไรด์ (HCl)
- กลูโคส
- โพแทสเซียมอะซิเตท
แอปพลิเคชัน
กระบวนการทรานส์ฟอร์เมชันเกี่ยวข้องกับการใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะเพื่อตัดพลาสมิดในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจง เพื่อให้สามารถแทรกยีนที่สนใจเข้าไป ได้ จากนั้นพลาสมิด ลูกผสมจะถูกนำเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย ซึ่งจะสามารถจำลองตัวเองได้อย่างอิสระ ทำให้แบคทีเรียสามารถแสดงออกของยีนที่สนใจได้ พลาสมิดเหล่านี้สามารถนำไปใช้ในการโคลนยีนหรือเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนได้
การผลิตโปรตีนลูกผสมเป็นกระบวนการที่ทำการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมโดยใช้ดีเอ็นเอลูกผสมที่เข้ารหัสโปรตีนจำเพาะ เมื่อพลาสมิดลูกผสมถูกนำเข้าไปในเซลล์เจ้าบ้านแล้ว เซลล์เจ้าบ้านก็จะผลิตโปรตีนนั้นออกมา การประยุกต์ใช้กระบวนการนี้เป็นเรื่องปกติในวงการแพทย์ เช่น การผลิตอินซูลิน ฮอร์โมน และปัจจัยการเจริญเติบโต
การบำบัดด้วยยีนคือการดัดแปลงยีนของแต่ละบุคคลเพื่อรักษาโรคหรือความผิดปกติ การบำบัดด้วยยีนโดยใช้พลาสมิดเป็นทางเลือกการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับบุคคลที่มียีนทำงานผิดปกติซึ่งก่อให้เกิดความผิดปกติ ดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ของสำเนาที่ทำงานได้ของยีนที่บกพร่องสามารถรวมเข้ากับเซลล์โฮสต์พลาสมิดได้ ซึ่งจะทำให้เซลล์โฮสต์มียีนที่ทำงานได้เพื่อรักษาความผิดปกติ[ 5 ]
วัคซีน DNAเป็นวัคซีนประเภทหนึ่งที่ใช้พลาสมิด DNA เพื่อกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในร่างกาย[ 6 ]พลาสมิด DNA จะเข้ารหัสแอนติเจนซึ่งระบบภูมิคุ้มกันจะตรวจพบว่าเป็นสิ่งแปลกปลอม ระบบภูมิคุ้มกันจะทำการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันซึ่งจะสร้างภูมิคุ้มกัน หากไวรัสจริงที่ใช้เป็นวัคซีนเข้าสู่ร่างกาย ระบบภูมิคุ้มกันจะคุ้นเคยกับวิธีการโจมตี วัคซีน DNA สามารถปรับให้เหมาะสมกับไวรัสได้โดยอาศัยพลาสมิด DNA ลูกผสม