เทคโนโลยี Bulk RNA barcoding and sequencing ( BRB-seq ) เป็นเทคโนโลยี bulk 3' mRNA-seqที่มีความเร็วสูงมากซึ่งใช้การสร้างบาร์โค้ดตัวอย่างในระยะเริ่มต้นและตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMIs)เพื่อให้สามารถรวมตัวอย่างได้มากถึง 384 ตัวอย่างในหลอดเดียวในช่วงเริ่มต้นของขั้นตอนการเตรียมไลบรารีสำหรับการจัดลำดับ เทคโนโลยีทรานสคริปโตมิกนี้เข้ากันได้กับเครื่องมือจัดลำดับแบบอ่านสั้นของ IlluminaและMGI ^{[ 1 ]}

ในRNA-seq มาตรฐาน จะต้องเตรียมไลบรารีการจัดลำดับสำหรับตัวอย่างRNA แต่ละตัวแยกกัน ^{[ 2 ]}ในทางตรงกันข้าม ใน BRB-seq ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกรวมเข้าด้วยกันตั้งแต่ช่วงต้นของเวิร์กโฟลว์เพื่อการประมวลผลพร้อมกัน เพื่อลดต้นทุนและเวลาในการทำงานที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนการเตรียมไลบรารี^{[ 1 ]}

เนื่องจาก BRB-seq เป็นเทคนิค 3' mRNA-seq จึงสร้างการอ่านสั้นๆ เฉพาะบริเวณ 3' ของโมเลกุล mRNA ที่มีโพลีอะดีนิเลต แทนที่จะเป็นความยาวเต็มของทรานสคริปต์เหมือนใน RNA-seq มาตรฐาน ซึ่งหมายความว่า BRB-seq ต้องการความลึกของการลำดับ ที่ต่ำกว่ามาก ต่อตัวอย่างเพื่อสร้างข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์ทั่วทั้งจีโนม ซึ่งช่วยให้ผู้ใช้สามารถตรวจจับจำนวนยีนที่แสดงออกและยีนที่แสดงออกแตกต่างกันได้ใกล้เคียงกับวิธีการ Illumina TruSeq มาตรฐาน แต่มีต้นทุนที่ถูกกว่าถึง 25 เท่า หรือใกล้เคียงกับการทำโปรไฟล์ยีนสี่ตัวโดยใช้RT-qPCR [ ^{1 ] BRB} -seq ยังมีความทนทานต่อคุณภาพ RNA ที่ต่ำกว่า (RIN <6) มากขึ้น ซึ่งทรานสคริปต์จะเสื่อมสภาพลง เนื่องจากต้องการเพียงบริเวณ 3' ในการเตรียมไลบรารีเท่านั้น^{[ 1 ]}

เทคนิค BRB-seq ได้รับการตีพิมพ์ครั้งแรกในเดือนเมษายน 2019 ในวารสารวิชาการGenome Researchในบทความชื่อ 'BRB-seq: การถอดรหัสพันธุกรรมแบบความเร็วสูงราคาประหยัดพิเศษที่เปิดใช้งานโดยบาร์โค้ดและลำดับ RNA จำนวนมาก^{[ 1 ]}ภายในสิ้นปี 2019 บทความนี้ติดอันดับ 1 ใน 10 บทความที่มีคนอ่านมากที่สุดในวารสารและได้รับการอ้างอิงมากกว่า 150 ครั้ง^{[ 3 ]} (เมษายน 2024)

เทคนิคนี้ได้รับการพัฒนาที่École Polytechnique Fédérale de Lausanneในสวิตเซอร์แลนด์ ในห้องปฏิบัติการของศาสตราจารย์ Bart Deplancke และผู้ร่วมงาน ในเดือนพฤษภาคม 2020 บริษัทชื่อ Alithea Genomics ได้ก่อตั้งขึ้นเพื่อให้บริการ BRB-seq ในรูปแบบชุดอุปกรณ์สำหรับนักวิจัยหรือในรูปแบบบริการเต็มรูปแบบ^{[ 4 ]} BRB-seq สร้างขึ้นจากความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีในด้านการถอดรหัสพันธุกรรมระดับเซลล์เดี่ยวซึ่งการติดบาร์โค้ดให้กับตัวอย่างทำให้สามารถทำการวิเคราะห์เซลล์เดี่ยวหลายร้อยถึงหลายพันเซลล์ได้ในระยะแรก การวิเคราะห์ตัวอย่างแบบมัลติเพล็กซ์ช่วยให้นักวิจัยสามารถสร้างไลบรารีลำดับเดียวที่มีตัวอย่างที่แตกต่างกันหลายตัวอย่าง ลดต้นทุนการทดลองโดยรวมและเวลาในการทำงานลง ในขณะเดียวกันก็เพิ่มปริมาณงานได้อย่างมาก^{[ 5 ]}

BRB-seq นำความก้าวหน้าเหล่านี้มาใช้ในการติดบาร์โค้ดตัวอย่างและ mRNA กับ mRNA ที่ได้จากประชากรเซลล์จำนวนมาก เพื่อให้สามารถศึกษาแบบอัลตร้าไฮทรูพ ซึ่งมีความสำคัญต่อการค้นพบยาการศึกษาประชากรหรือการวิจัยพื้นฐาน^{[ 1 ] [ 6 ]}

องค์ประกอบพื้นฐานของ BRB-seq คือไพรเมอร์บาร์โค้ดตัวอย่างที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม ลำดับนิวคลีโอไทด์บาร์โค้ดแต่ละลำดับประกอบด้วยอะแดปเตอร์สำหรับการจับคู่ไพรเมอร์ บาร์โค้ดความยาว 14 นิวคลีโอไทด์ที่กำหนดตัวระบุเฉพาะให้กับตัวอย่าง RNA แต่ละตัว และ UMI ความยาว 14 นิวคลีโอไทด์แบบสุ่มที่ติดแท็กโมเลกุล mRNA แต่ละตัวด้วยลำดับเฉพาะเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างทรานสคริปต์ mRNA ดั้งเดิมและสำเนาที่เกิดจากอคติการขยายสัญญาณ PCR BRB-seq ช่วยให้สามารถรวมตัวอย่าง RNA ที่มีบาร์โค้ดได้มากถึง 384 ตัวอย่างลงในหลอดเดียวในช่วงเริ่มต้นของเวิร์กโฟลว์เพื่อลดขั้นตอนใน การเตรียม ไลบรารี cDNAและการจัดลำดับใน ภายหลัง ^{[ 1 ] [ 7 ] [ 8 ]}

ข้อกำหนด RNA ขาเข้า

ตัวอย่าง RNA ทั้งหมดที่แยกได้ต้องมี RIN ≥ 6 และอัตราส่วน A260/230 ˃ 1.5 เมื่อวัดปริมาณด้วย Nanodrop  แนะนำให้ใช้ RNA บริสุทธิ์ระหว่าง 10 ng ถึง 1 μg ต่อตัวอย่างสำหรับ BRB-seq มาตรฐาน เพื่อให้มั่นใจถึงความสม่ำเสมอของไลบรารีและการกระจายตัวของลำดับการอ่านที่สม่ำเสมอสำหรับแต่ละตัวอย่างหลังจากการเรียงลำดับ ความเข้มข้นของ RNA ต่อตัวอย่างอินพุต ค่า RIN และค่า 260/230 ต้องมีความสม่ำเสมอมากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้^{[ 1 ]}

ขั้นตอนการทำงาน

ขั้นตอนการทำงานของ BRB-seq เริ่มต้นด้วยการใส่ตัวอย่าง RNA ที่แยกได้ลงในแต่ละหลุมของเพลท 96 หรือ 384 หลุม จากนั้นแต่ละตัวอย่างจะผ่านกระบวนการถอดรหัสย้อนกลับแบบบาร์โค้ดแยกกัน หลังจากเติมไพรเมอร์ oligo(dT) ที่มีบาร์โค้ดเฉพาะตัว ไพรเมอร์เหล่านี้จะติดแท็กหาง 3' poly(A) ของโมเลกุล mRNA อย่างเฉพาะเจาะจงในระหว่างการสังเคราะห์ cDNA สายแรก ข้อมูลสายจะยังคงอยู่ เนื่องจากแต่ละตัวอย่าง RNA มีบาร์โค้ดเฉพาะตัว ตัวอย่างทั้งหมดจากเพลท 96 หรือ 384 หลุมจึงสามารถรวมกันในหลอดเดียวเพื่อประมวลผลพร้อมกันได้หลังจากขั้นตอนแรกนี้

หลังจากรวมตัวอย่างเข้าไว้ในหลอดเดียวแล้ว ไพรเมอร์อิสระจะถูกย่อยสลาย จากนั้นปฏิกิริยาการสังเคราะห์สายที่สองจะทำให้ได้ซีดีเอ็นเอสองสาย (DS cDNA)

ขั้นตอนต่อไป โมเลกุล cDNA ที่มีความยาวเต็มเหล่านี้จะผ่านกระบวนการที่เรียกว่า tagmentation โดยใช้เอนไซม์ Tn5 transposaseที่บรรจุอะแดปเตอร์ที่จำเป็นสำหรับการขยายไลบรารีไว้ล่วงหน้า เอนไซม์ transposase จะทำการตัดโมเลกุล cDNA ออกเป็นชิ้นเล็กๆ ก่อน จากนั้นจึงเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ที่บรรจุไว้ล่วงหน้าเข้ากับชิ้นส่วน cDNA เหล่านั้น ความซับซ้อนของไลบรารีจะสูงขึ้นเมื่อใช้ cDNA ประมาณ 20 นาโนกรัมต่อตัวอย่างสำหรับกระบวนการ tagmentation ซึ่งหมายความว่าจำเป็นต้องใช้รอบการขยายด้วย PCR น้อยลง

เพื่อให้สามารถใช้งานร่วมกับเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอของ Illumina ได้ ไลบรารี cDNA ที่ได้จะถูกสร้างดัชนีและขยายโดยใช้กลยุทธ์การสร้างดัชนีคู่แบบพิเศษ (UDI) ด้วยดัชนี P5 และ P7 ดัชนีเหล่านี้ช่วยลดความเสี่ยงของการกำหนดบาร์โค้ดผิดพลาดหลังจากการจัดลำดับดีเอ็นเอรุ่นใหม่

จากนั้นจึงจำเป็นต้องมีข้อมูลเกี่ยวกับขนาดชิ้นส่วนเฉลี่ยของไลบรารี เพื่อประเมินความเข้มข้นโมลาร์ของไลบรารีและเตรียมการเจือจางไลบรารีที่เหมาะสมสำหรับการจัดลำดับดีเอ็นเอ ไลบรารีที่ประสบความสำเร็จจะมีชิ้นส่วนอยู่ในช่วง 300 – 1000 bp โดยมีขนาดสูงสุดอยู่ที่ 400-700 bp

แตกต่างจากวิธีการ RNA-seq แบบมาตรฐานที่ต้องใช้จำนวนอ่านประมาณ 30 ล้านครั้งต่อตัวอย่างเพื่อให้ ได้ข้อมูล การแสดงออกของยีน ที่น่าเชื่อถือ สำหรับ BRB-seq นั้น ความลึกของการลำดับเบสระหว่าง 1 ถึง 5 ล้านครั้งต่อตัวอย่างก็เพียงพอที่จะตรวจจับยีนส่วนใหญ่ที่แสดงออกในตัวอย่างได้แล้ว ส่วนยีนที่มีการแสดงออกน้อยสามารถตรวจจับได้โดยการลำดับเบสที่ความลึกสูงขึ้น

ข้อมูลการจัดลำดับ BRB-seq สามารถวิเคราะห์ได้ด้วยวิธีการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกแบบโอเพนซอร์สมาตรฐาน เช่น STARsolo ซึ่งออกแบบมาเพื่อจัดเรียงข้อมูลมัลติเพล็กซ์และสร้างเมทริกซ์จำนวนยีนและ UMI สำหรับการวิเคราะห์ RNA-seq ในขั้นตอนต่อไปจากไฟล์ fastq ดิบ

BRB-seq เหมาะสำหรับงานวิจัยใดๆ ที่ต้องการข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์ทั่วทั้งจีโนม โดยเฉพาะอย่างยิ่งเหมาะสำหรับงานวิจัยที่มีตัวอย่างหลายร้อยหรือหลายพันตัวอย่าง เนื่องจากขั้นตอนการทำงานที่ปรับขนาดได้ ตรงไปตรงมา และรวดเร็ว ซึ่งเหมาะสำหรับการทำงานแบบอัตโนมัติ