การทดสอบกรดไบซินโคนินิก ( การทดสอบ BCA ) หรือที่รู้จักกันในชื่อ^การทดสอบสมิธตามชื่อผู้คิดค้นคือ Paul K. Smith ที่บริษัท Pierce Chemical Company [ ^{1 ]}เป็นการทดสอบทางชีวเคมีเพื่อหาความเข้มข้นรวมของโปรตีนในสารละลาย (0.5 μg/mL ถึง 1.5 mg/mL) คล้ายกับการทดสอบโปรตีนของ Lowryการทดสอบโปรตีนของ Bradfordหรือรีเอเจนต์ไบยูเรตความเข้มข้นรวมของโปรตีนจะแสดงโดยการเปลี่ยนสีของสารละลายตัวอย่างจากสีน้ำเงินเป็นสีม่วงตามสัดส่วนของความเข้มข้นของโปรตีน ซึ่งสามารถวัดได้โดยใช้ เทคนิค การวัดสี การทดสอบ BCA ได้รับสิทธิบัตรโดยบริษัท Pierce Chemical Companyในปี 1989 และสิทธิบัตรหมดอายุในปี 2006 ^{[ 2 ]}

สารละลาย BCA เข้มข้นประกอบด้วยส่วนผสมต่อไปนี้ใน สารละลาย ด่าง สูง ที่มีค่า pH 11.25: กรดไบซินโคนินิก , โซเดียมคาร์บอเนต , โซเดียมไบคาร์บอเนต , โซเดียมทาร์เทรตและคอปเปอร์(II) ซัลเฟตเพนตาไฮเดรต

การทดสอบ BCA อาศัยปฏิกิริยาหลักสองอย่าง อย่างแรกพันธะเปปไทด์ในโปรตีนจะลด ไอออน Cu ²⁺จากคอปเปอร์(II) ซัลเฟตให้เป็น Cu ¹⁺ (ปฏิกิริยานี้ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิ) ปริมาณ Cu ²⁺ที่ถูกลดลงจะเป็นสัดส่วนกับปริมาณโปรตีนที่มีอยู่ในสารละลาย ต่อมา โมเลกุลของกรดไบซินโคนินิกสองโมเลกุลจะจับ กับ ไอออน Cu ¹⁺ แต่ละ ไอออน เกิดเป็นสารเชิงซ้อนสีม่วงที่ดูดซับแสงได้ดีที่ความยาวคลื่น 562 นาโนเมตร

คอมเพล็กซ์ กรดไบซินโคนินิก Cu ¹⁺ได้รับอิทธิพลในตัวอย่างโปรตีนจากการมีอยู่ของหมู่ข้างเคียงซิสเทอีน/ซิสตีน ไทโรซีน และทริปโตแฟน ที่อุณหภูมิสูงขึ้น (37 ถึง 60 °C) พันธะเปปไทด์ช่วยในการสร้างคอมเพล็กซ์ปฏิกิริยา แนะนำให้บ่มการทดสอบ BCA ที่อุณหภูมิสูงขึ้นเพื่อเพิ่มความไวของการทดสอบในขณะที่ลดความแปรปรวนที่เกิดจากองค์ประกอบกรดอะมิโนที่ไม่เท่ากัน^{[ 3 ]}

ปริมาณโปรตีนในสารละลายสามารถวัดได้โดยการวัดสเปกตรัมการดูดกลืนแสงและเปรียบเทียบกับสารละลายโปรตีนที่มีความเข้มข้นที่ทราบแล้ว

การทดสอบ BCA นั้นไม่เข้ากันอย่างมากกับสารลดแรงตึงผิวและสารคีเลตโลหะ แม้ว่าปริมาณเล็กน้อยอาจจะทนได้^{[ 4 ]}มีรายงานว่าการทดสอบ BCA ยังตอบสนองต่อลิปิดและฟอสโฟลิปิดของเยื่อหุ้มเซลล์ทั่วไปอีกด้วย^{[ 5 ]}

การทดสอบ BCA มีรูปแบบอื่น ๆ อีกหลายวิธี:

ตามที่ Smith อธิบายไว้^{[ 1 ]}การทดสอบ BCA ดั้งเดิมเป็นโปรโตคอลสององค์ประกอบ รีเอเจนต์ทั้งสอง "มีความเสถียรอย่างไม่มีกำหนดที่อุณหภูมิห้อง" ^{[ 1 ]}สูตรที่ทันสมัย ​​(น่าจะเหมือนกันหรือคล้ายคลึงกันมาก) มีจำหน่ายจากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์อย่างน้อยสองราย^{[ 6 ] [ 7 ]}สารละลาย BCA Working ถูกสร้างขึ้นโดยการผสมรีเอเจนต์ A และรีเอเจนต์ B ในอัตราส่วน 50:1 และสามารถเตรียมได้ทั้งรายสัปดาห์ (มีความเสถียรปานกลาง) หรือตามความจำเป็น

สารรีเอเจนต์ A ^{[ 1 ]}

• 1% โดยปริมาตรBCA-Na ₂ (CAS: 979-88-4)
• 2% โดยปริมาตรNa ₂ CO ₃ ·H ₂ O (CAS: 5968-11-6)
• 0.16% โดยปริมาตรNa ₂ทาร์เทรต (CAS: 868-18-8)
• 0.4% โดยปริมาตรNaOH (CAS: 1310-73-2)
• 0.95% โดยปริมาตรNaHCO ₃ (CAS: 144-55-8)
• เติม NaOH 50% หรือNaHCO₃ _ชนิด แข็ง เพื่อปรับค่า pH ให้เป็น 11.25

สูตรทางเลือกที่แนะนำแต่ยังไม่ได้ทดสอบในต้นฉบับของสมิธคือการละเว้น NaOH (และคาดว่าไม่ต้องปรับค่า pH ด้วยตนเองให้เป็น 11.25) แต่ให้ละลายส่วนประกอบอื่นๆ ในบัฟเฟอร์ ที่เตรียมไว้ล่วงหน้าซึ่งประกอบด้วย Na ₂ CO ₃ ความเข้มข้น 0.25 MและNaHCO _{3 ความเข้มข้น 0.01} Mแทน^{[ 1 ]}

ที่น่าสังเกตคือ Smith สังเคราะห์ BCA ของตนเองผ่านปฏิกิริยา Pfitzingerของisatinและacetoinโดยแทนที่ KOH ด้วย NaOH แต่ปฏิบัติตามวิธีการสังเคราะห์ของ Lesene และ Henze ในส่วนอื่นๆ^{[ 8 ]}เนื่องจาก BCA ที่มีจำหน่ายจากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์ในเวลานั้นไม่บริสุทธิ์เพียงพอสำหรับการใช้งานของพวกเขา จำเป็นต้องมีการตกผลึกซ้ำอย่างน้อยสามครั้งติดต่อกันของ BCA ที่สังเคราะห์ขึ้นจากน้ำที่อุณหภูมิ 70˚C เพื่อให้บริสุทธิ์เพียงพอสำหรับการทดสอบ^{[ 1 ]}

รีเอเจนต์ B ^{[ 1 ]}

• 4% w/v CuSO ₄ ·5H ₂ O

การทดสอบ BCA Micro BCA เป็นโปรโตคอล 3 องค์ประกอบที่ใช้สารละลายเข้มข้นของปฏิกิริยา Biuret , BCAและ รีเอเจนต์ ทองแดง(II)ทำให้มีความไวที่ดีขึ้นที่ ~2 - 40 μg/mL เมื่อเทียบกับ 20 - 2000 μg/mL ของการทดสอบ BCA แบบดั้งเดิม อย่างไรก็ตาม มีการรบกวนจากองค์ประกอบที่ไม่ใช่โปรตีนที่แตกต่างกันและโดยทั่วไปแล้วมีความไวมากกว่า^{[ 4 ]}ชุดอุปกรณ์สำหรับการทดสอบ Micro BCA มีจำหน่ายจากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์อย่างน้อยสองราย^{[ 9 ] [ 10 ]}ที่น่าสังเกตคือ องค์ประกอบและการใช้ "รีเอเจนต์และโปรโตคอล Micro BCA" ได้รับการอธิบายไว้ในต้นฉบับโดย Smith ^{[ 1 ]}และชุดอุปกรณ์สมัยใหม่น่าจะประกอบด้วยสูตรที่แน่นอนหรือคล้ายคลึงกันมาก โปรโตคอลประกอบด้วยการผสมไมโครรีเอเจนต์ B และสารละลายทองแดงในอัตราส่วน 25:1 เพื่อสร้างไมโครรีเอเจนต์ C (MC) ซึ่งไม่สามารถเก็บรักษาได้นานและควรเตรียมใหม่ทุกครั้ง จากนั้นผสม MC ในอัตราส่วน 1:1 กับไมโครรีเอเจนต์ A เพื่อสร้างสารละลายใช้งานสำหรับการทดสอบขั้นสุดท้าย (ซึ่งไม่สามารถเก็บรักษาได้นานเช่นกัน) ไมโครรีเอเจนต์ A ไมโครรีเอเจนต์ B และสารละลายทองแดงสามารถเก็บรักษาได้นานอย่างไม่มีกำหนดที่อุณหภูมิห้อง^{[ 1 ]}

ไมโครรีเอเจนต์ A (MA) ^{[ 1 ]}

• 8% โดยปริมาตรNa ₂ CO ₃ ·H ₂ O (CAS: 5968-11-6)
• 1.6% โดยปริมาตรNaOH (CAS: 1310-73-2)
• โซเดียม₂ทาร์เทรต 1.6% w/v (CAS: 868-18-8) (ความเข้มข้น 10 เท่าของรีเอเจนต์ A ในการทดสอบ BCA ดั้งเดิมข้างต้น )
• _เติม NaHCO₃ (CAS: 144-55-8) ในปริมาณที่เพียงพอเพื่อปรับค่า pH ให้เป็น 11.25

ไมโครรีเอเจนต์ บี (MB) ^{[ 1 ]}

• 4% w/v BCA-Na ₂ (CAS: 979-88-4) (ความเข้มข้น 4 เท่าของรีเอเจนต์ A ในการทดสอบ BCA ดั้งเดิมข้างต้น )

สารละลายทองแดง^{[ 1 ]}

• 4% w/v CuSO ₄ ·5H ₂ O (CAS: 7758-99-8) (ความเข้มข้นเท่ากับรีเอเจนต์ B ในการทดสอบ BCA ดั้งเดิมข้างต้น )

การทดสอบ BCA ประเภทนี้ประกอบด้วย "สารรีเอเจนต์ความเข้ากันได้" ที่เป็นกรรมสิทธิ์เฉพาะซึ่งปิดกั้นด้วยพันธะโควาเลนต์ไทออล^{[ 11 ]}หรือที่ รู้จักกันใน ชื่อสารรีดิวซ์ความเข้ากันได้ (RACA) ^{[ 12 ]}แม้ว่าสิ่งนี้จะช่วยให้เข้ากันได้กับสารรีดิวซ์มากขึ้น แต่การทดสอบนี้ก็มีรูปแบบการรบกวนที่แตกต่างจากส่วนประกอบที่ไม่ใช่โปรตีนอื่นๆ^{[ 4 ]}

การทดสอบ BCA ประเภทนี้ดูเหมือนจะมีให้บริการเฉพาะจากThermo Fisher Scientific เท่านั้น มีรายงานว่าใช้ "วิธีการลดทองแดงแบบเดียวกับการทดสอบโปรตีน BCA แบบดั้งเดิมโดยใช้สารคีเลตทองแดง [ที่เป็นกรรมสิทธิ์] เฉพาะตัว" ซึ่งดูดซับที่ 480 นาโนเมตรแทนที่จะเป็น 562 นาโนเมตร^{[ 13 ]}สารคีเลตที่เป็นกรรมสิทธิ์นี้และ สูตร ปฏิกิริยา Biuret ที่คาดว่าได้รับการปรับให้เหมาะสมแล้ว ช่วยให้การทดสอบให้ผลลัพธ์ที่รวดเร็ว (<5 นาที) โดยไม่ต้องบ่มที่อุณหภูมิ 37˚C+ เหมือนกับการทดสอบ BCA ดั้งเดิม อย่างไรก็ตาม การทดสอบนี้มีโปรไฟล์การรบกวนที่แตกต่างจากส่วนประกอบที่ไม่ใช่โปรตีนอื่นๆ^{[ 4 ]}การ ทดสอบเปปไทด์เชิงปริมาณแบบวัดสี Pierce (ปัจจุบันเป็นกรรมสิทธิ์และมีให้บริการจาก Thermo Fisher Scientific) ดูเหมือนจะใช้สารคีเลตทองแดงที่เป็นกรรมสิทธิ์ที่ดูดซับที่ 480 นาโนเมตรที่คล้ายคลึงกันหรือเหมือนกัน^{[ 14 ]}

• การทดสอบไบยูเรต
• การทดสอบแบรดฟอร์ด
• การทดสอบโปรตีนด้วยคอลลอยด์ทองคำ

• โอเพ่นเวทแวร์
• เคมีวิเคราะห์ BCA