ไบโอรีพอร์เตอร์

ไบ โอรีพอร์เตอร์ คือ เซลล์จุลินทรีย์ ที่มีชีวิตสมบูรณ์ซึ่งได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรมให้สร้างสัญญาณที่วัดได้เพื่อตอบสนองต่อสารเคมีหรือตัวกระตุ้นทางกายภาพเฉพาะในสิ่งแวดล้อมไบโอรีพอร์เตอร์ประกอบด้วยองค์ประกอบทางพันธุกรรมที่สำคัญสองส่วน คือ ยีน โปรโมเตอร์และยีนรีพอร์เตอร์ยีนโปรโมเตอร์จะถูกเปิดใช้งาน ( ถอดรหัส ) เมื่อมีตัวกระตุ้นเป้าหมายอยู่ในสิ่งแวดล้อมของเซลล์ ยีนโปรโมเตอร์ในเซลล์แบคทีเรียปกติจะเชื่อมโยงกับยีนอื่นๆ ซึ่งจะถูกถอดรหัสและแปลเป็นโปรตีนที่ช่วยให้เซลล์ต่อสู้หรือปรับตัวกับตัวกระตุ้นที่มันสัมผัส ในกรณีของไบโอรีพอร์เตอร์ ยีนเหล่านี้หรือบางส่วนของยีนเหล่านั้นถูกกำจัดออกไปและแทนที่ด้วยยีนรีพอร์เตอร์ ดังนั้น การเปิดใช้งานยีนโปรโมเตอร์จะเปิดใช้งานยีนรีพอร์เตอร์ด้วย ทำให้เกิดการผลิตโปรตีน รีพอร์เตอร์ ที่สร้างสัญญาณที่ตรวจจับได้ การมีสัญญาณบ่งชี้ว่าไบโอรีพอร์เตอร์ตรวจจับตัวกระตุ้นเฉพาะในสิ่งแวดล้อมได้แล้ว

เดิมทีพัฒนาขึ้นเพื่อการวิเคราะห์ปัจจัยพื้นฐานที่มีผลต่อ การแสดงออก ของยีนไบโอรีพอร์เตอร์ถูกนำไปใช้ในการตรวจจับสารปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมตั้งแต่แรก^{[ 1 ]}และต่อมาได้พัฒนาไปสู่สาขาที่หลากหลาย เช่นการวินิจฉัยทางการแพทย์เกษตรกรรมแม่นยำ การรับรอง ความปลอดภัยของอาหารการตรวจสอบและควบคุมกระบวนการ และการคำนวณไบโอไมโครอิเล็กทรอนิกส์ ความสามารถรอบด้าน ของ ไบโอรีพอร์เตอร์ เกิดจากข้อเท็จจริงที่ว่ามี ระบบ ยีนรีพอร์เตอร์ จำนวนมาก ที่สามารถสร้างสัญญาณได้หลากหลาย นอกจากนี้ ยีนรีพอร์เตอร์ยังสามารถแทรกเข้าไปใน เซลล์ แบคทีเรียยีสต์พืชและ สัตว์ เลี้ยงลูกด้วยนมได้ทำให้มีฟังก์ชันการทำงานที่สำคัญในเวกเตอร์โฮสต์ที่หลากหลาย

มียีนรายงานหลายประเภทที่สามารถนำมาใช้ในการสร้างสิ่งมีชีวิตรายงานทางชีวภาพ ได้และสัญญาณที่พวกมันสร้างขึ้นมักจะแบ่งออกเป็นประเภทต่างๆ ได้แก่ สัญญาณวัดสี สัญญาณเรืองแสงสัญญาณเปล่งแสงสัญญาณเคมีเรืองแสงหรือสัญญาณไฟฟ้าเคมีแม้ว่าแต่ละประเภทจะทำงานแตกต่างกัน แต่ผลลัพธ์สุดท้ายก็ยังคงเหมือนเดิมเสมอ นั่นคือ สัญญาณที่วัดได้ซึ่งเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของสารเคมีหรือสารทางกายภาพเฉพาะที่พวกมันสัมผัส ในบางกรณี สัญญาณจะเกิดขึ้นก็ต่อเมื่อมีการเติมสารตั้งต้น รองลงใน การทดสอบทางชีวภาพ ( luxAB , Luc และ aequorin) สำหรับยีนรายงานทางชีวภาพอื่นๆ สัญญาณจะต้องถูกกระตุ้นด้วยแหล่งกำเนิดแสงภายนอก (GFP และ UMT) และสำหรับยีนรายงานทางชีวภาพบางชนิด สัญญาณจะเกิดขึ้นเองโดยสมบูรณ์ โดยไม่ต้องใช้สารตั้งต้นภายนอกหรือการกระตุ้นจากภายนอก ( luxCDABE ) ส่วนต่อไปนี้จะสรุปโดยย่อเกี่ยวกับระบบยีนรายงานที่มีอยู่และแอปพลิเคชันที่มีอยู่แล้ว

ลูซิเฟอเรสเป็นชื่อสามัญของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาการเปล่งแสง ลูซิเฟอเรสสามารถพบได้ในแบคทีเรีย สาหร่าย เชื้อรา แมงกะพรุน แมลง กุ้ง และปลาหมึก และแสงที่สิ่งมีชีวิตเหล่านี้ผลิตขึ้นเรียกว่าไบโอเรืองแสง ในแบคทีเรีย ยีนที่รับผิดชอบต่อปฏิกิริยาการเปล่งแสง ( ยีน lux ) ได้ถูกแยกและนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการสร้างไบโอรีพอร์เตอร์ที่เปล่งแสงสีฟ้าอมเขียวที่มีความเข้มสูงสุดที่ 490 นาโนเมตร^{[ 2 ]} มี luxสามรูปแบบ ได้แก่รูปแบบที่ทำงานที่อุณหภูมิ < 30°C รูปแบบที่ < 37°C และรูปแบบที่ < 45°C ระบบพันธุกรรม luxประกอบด้วยยีนห้าตัว ได้แก่luxA , luxB , luxC , luxDและluxEขึ้นอยู่กับการรวมกันของยีนเหล่านี้ที่ใช้สามารถสร้างไบโอรีพอร์เตอร์ เรืองแสง ได้หลายประเภท

ไบโอรีพอร์เตอร์ luxABประกอบด้วย ยีน luxAและluxB เท่านั้น ซึ่งทำหน้าที่สร้างสัญญาณแสง อย่างไรก็ตาม เพื่อให้ปฏิกิริยาการปล่อยแสงสมบูรณ์ จำเป็นต้องมี สารตั้งต้นเข้าสู่เซลล์ โดยทั่วไปแล้ว การเติมสารเคมีเดคาแนล (decanal) จะเกิดขึ้น ในช่วงใดช่วงหนึ่งของกระบวนการทดสอบทางชีวภาพ มีการสร้างไบโอรีพอร์เตอร์ luxAB จำนวนมาก ในระบบเซลล์แบคทีเรีย ยีสต์ แมลง ไส้เดือนฝอย พืช และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

แทนที่จะมีเพียง ยีน luxAและluxB เท่านั้น ไบโอรีพอร์เตอร์สามารถมี ยีนทั้งห้าของ ชุดยีน luxได้ ทำให้สามารถสร้างระบบสร้างแสงที่ทำงานได้อย่างอิสระโดยสมบูรณ์ โดยไม่ต้องเติมสารตั้งต้นเพิ่มเติมหรือใช้แหล่งกำเนิดแสงภายนอกใดๆ ดังนั้น ใน การทดสอบทางชีวภาพนี้ ไบโอรีพอร์เตอร์จะสัมผัสกับสาร เป้าหมาย และจะ เกิดการเพิ่มขึ้นของแสงชีวภาพใน เชิงปริมาณซึ่งมักเกิดขึ้นภายในเวลาไม่ถึงหนึ่งชั่วโมง เนื่องจากความรวดเร็วและง่ายต่อการใช้งาน รวมถึงความสามารถในการทำการทดสอบทางชีวภาพซ้ำๆ ได้แบบเรียลไทม์และแบบออนไลน์ ทำให้ ไบโอรีพอร์เตอร์ luxCDABEมีความน่าสนใจอย่างยิ่ง ด้วยเหตุนี้ จึงมีการนำไปใช้ในวิธีการตรวจจับที่หลากหลาย ตั้งแต่การตรวจจับสารปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมไปจนถึงการตรวจสอบการติดเชื้อของเชื้อโรคในหนูทดลองแบบเรียลไทม์

โดยทั่วไปแล้วไบโอรีพอร์เตอร์ luxที่ไม่จำเพาะจะใช้สำหรับการตรวจจับสารพิษทางเคมี โดยปกติจะออกแบบให้มีการเรืองแสงอย่างต่อเนื่อง เมื่อสัมผัสกับสารพิษทางเคมี เซลล์จะตายหรือกิจกรรมการเผาผลาญของเซลล์จะชะลอตัวลง ส่งผลให้ ระดับแสงเรือง แสง ลดลง การใช้งานที่คุ้นเคยมากที่สุดคือในการทดสอบ Microtox ซึ่งหลังจากสัมผัสกับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นหลายระดับในช่วงเวลาสั้นๆ การลดลงของการเรืองแสงสามารถสัมพันธ์กับระดับความเป็นพิษได้^{[ 3 ] [ 4 ]}

ลูซิเฟอเรสจากหิ่งห้อยเร่งปฏิกิริยาที่สร้างแสงที่มองเห็นได้ในช่วง 550 ถึง 575 นาโนเมตร นอกจากนี้ยังมีลูซิเฟอเรสจากด้วงคลิกซึ่งสร้างแสงที่จุดสูงสุดใกล้เคียงกับ 595 นาโนเมตร ลูซิเฟอเรสทั้งสองชนิดต้องการการเติมสารตั้งต้นภายนอก (ลูซิเฟอริน) เพื่อให้เกิดปฏิกิริยาแสงขึ้น มีการสร้างไบโอรีพอร์เตอร์ที่ใช้ luc จำนวนมากเพื่อตรวจจับสารประกอบ อนินทรีย์และอินทรีย์หลากหลายชนิดที่เป็นปัญหาสิ่งแวดล้อม อย่างไรก็ตาม การใช้งานที่มีแนวโน้มดีที่สุดน่าจะขึ้นอยู่กับการนำรหัสพันธุกรรมของลูซิเฟอเรสจากหิ่งห้อยเข้าไปในเซลล์และเนื้อเยื่อยูคาริโอตอื่นๆ^{[ 5 ]}

การใส่ ยีน lucเข้าไปในเซลล์มะเร็งปากมดลูกของมนุษย์ ( HeLa ) แสดงให้เห็นว่าการกำจัดเซลล์มะเร็งสามารถมองเห็นได้ภายในหนูที่มีชีวิตโดยการสแกนด้วย กล้อง CCDซึ่งช่วยให้สามารถ ตรวจสอบการรักษา ด้วยเคมี บำบัด ได้อย่างรวดเร็วแบบออนไลน์และแบบเรียล ไทม์ ^{[ 6 ]}ในอีกตัวอย่างหนึ่ง ยีน lucถูกใส่เข้าไปในเซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์เพื่อพัฒนาการทดสอบทางชีวภาพสำหรับการตรวจจับและวัดสารที่มีศักยภาพในการออกฤทธิ์ เป็น เอสโตรเจนและต้านเอสโตรเจน^{[ 7 ]}

โปรโมเตอร์เฉพาะสามารถวางไว้ต้นน้ำของ ยีน luc ได้ กล่าวคือ ลำดับ lucสามารถเชื่อมเข้ากับลำดับโปรโมเตอร์ในระดับ DNA ได้ หากโครงสร้างดังกล่าวมีขนาดไม่ใหญ่เกินไป ก็สามารถนำเข้าสู่เซลล์ยูคาริโอตได้ง่ายๆ โดยใช้พลาสมิดวิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาการทำงานของโปรโมเตอร์ที่กำหนดในเซลล์/เนื้อเยื่อประเภทที่กำหนด เนื่องจากปริมาณแสงที่ผลิตโดยลูซิเฟอเรสเป็นสัดส่วนโดยตรงกับการทำงานของโปรโมเตอร์^{[ 8 ]}นอกเหนือจากการศึกษาโปรโมเตอร์แล้ว การทดสอบลูซิเฟอเรสของหิ่งห้อยยังให้ทางเลือกในการศึกษาตัวกระตุ้นการถอดรหัส : ในการทดลองเหล่านี้ โดยทั่วไปจะใช้ ระบบ GAL4/UAS และลำดับ DNA ที่กระตุ้นต้นน้ำของ Gal4 (UAS) จะถูกวางไว้ต้นน้ำของยีน lucในขณะที่ตัวกระตุ้นที่แตกต่างกันหรือตัวแปร/ชิ้นส่วนที่แตกต่างกันของตัวกระตุ้นเดียวกันจะถูกเชื่อมเข้ากับโมดูลการจับ DNA ของ GAL4 ในระดับโปรตีน ด้วยวิธีนี้ กิจกรรมการถอดรหัสของโปรตีนฟิวชั่น GAL4 ที่แตกต่างกันสามารถเปรียบเทียบได้โดยตรงโดยใช้แสงเป็นตัวบ่งชี้^{[ 9 ]}

เอควอรินเป็นโปรตีนเรืองแสงที่แยกได้จากแมงกะพรุนเรืองแสงAequorea victoriaเมื่อเติม ไอออน แคลเซียม (Ca2+) และโคเอเลนเทอราซีน จะเกิดปฏิกิริยาซึ่งส่งผลให้เกิดแสงสีน้ำเงินในช่วง 460 ถึง 470 นาโนเมตร เอควอรินได้รับการรวมเข้ากับเซลล์ B ของมนุษย์ เพื่อตรวจจับ แบคทีเรียและไวรัส ที่ก่อโรคในสิ่งที่เรียกว่า การทดสอบ Cell CANARY (Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields) ^{[ 10 ]}เซลล์ B ได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรมให้ผลิตเอควอริน เมื่อสัมผัสกับแอนติเจนของเชื้อโรคต่างๆ เซลล์ B ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมจะปล่อยแสงออกมาอันเป็นผลมาจากการกระตุ้นการส่งสัญญาณภายในเซลล์ที่ปล่อยไอออนแคลเซียมภายในเซลล์

โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) ก็เป็นโปรตีนเรืองแสงที่แยกและโคลนมาจากแมงกะพรุนAequorea victoriaเช่น กัน ^{[ 11 ]}สายพันธุ์ต่างๆ ยังถูกแยกได้จากพืชทะเลRenilla reniformisด้วย GFP เช่นเดียวกับเอควอริน สร้างสัญญาณเรืองแสงสีน้ำเงิน แต่ไม่จำเป็นต้องเติมสารตั้งต้นภายนอก สิ่งที่จำเป็นคือ แหล่งกำเนิด แสงอัลตราไวโอเลตเพื่อกระตุ้นคุณสมบัติการเรืองแสงของโปรตีนเรืองแสง ความสามารถในการเรืองแสงเองนี้ทำให้ GFP เป็นที่ต้องการอย่างมากในการทดสอบไบโอเซนเซอร์ เนื่องจากสามารถใช้ได้แบบออนไลน์และในการตรวจสอบเซลล์ที่มีชีวิตที่สมบูรณ์ นอกจากนี้ ความสามารถในการเปลี่ยนแปลง GFP เพื่อสร้างการปล่อยแสงนอกเหนือจากสีน้ำเงิน (เช่น สีฟ้า สีแดง และสีเหลือง) ทำให้สามารถใช้เป็นตัวตรวจจับหลายตัวอย่างได้ ด้วยเหตุนี้ GFP จึงถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในโครงสร้างไบโอรีพอร์เตอร์ภายในโฮสต์แบคทีเรีย ยีสต์ ไส้เดือนฝอย พืช และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

ยูโรพอร์ฟิริโนเจน (ยูโรเจน) III เมทิลทรานสเฟอเรส (UMT) เร่งปฏิกิริยาที่ให้ผลผลิต เรือง แสง สองชนิด ซึ่งสร้างการเรืองแสงสีแดงส้มในช่วง 590 ถึง 770 นาโนเมตรเมื่อได้รับแสงอัลตราไวโอเลต [ ^{12 ] เช่น}เดียวกับ GFP จึงไม่จำเป็นต้องเติมสารตั้งต้นภายนอก UMT ถูกใช้เป็นไบโอรีพอร์เตอร์สำหรับการคัดเลือกพลาสมิด ลูกผสม เป็นเครื่องหมายสำหรับการถอดรหัส ยีน ในเซลล์แบคทีเรีย ยีสต์ และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และสำหรับการตรวจจับเกลือพิษ เช่นอาร์เซไนต์และแอนติโมไนต์