Cas4เป็นเอนโดนิวคลีเอสที่พบใน ระบบ CRISPR บาง ระบบ ซึ่งใช้เป็นส่วนหนึ่งของขั้นตอนการได้มาซึ่งสเปเซอร์ โปรตีนในตระกูล Cas4 ที่อยู่ในอาร์เคียSulfolobus solfataricusใช้สารตกค้างซิสเทอีนสี่ตัวเพื่อจับกับคลัสเตอร์เหล็ก-ซัลเฟอร์ เช่นเดียวกับนิวคลีเอส AddB ของBacillus subtilis [ ^{1 ] โปรตีน}ในตระกูล Cas4 ชื่อ Sso0001 เป็นเอ็กโซนิวคลีเอสของ DNA สายเดี่ยว 5' ถึง 3' ซึ่งในหลอดทดลองจะถูกขัดขวางโดยสารประกอบ DNA นอกเกลียว^{[ 1 ]} Cas4 ทำหน้าที่ตัดออกเพื่อสร้าง DNA สายเดี่ยว 3' ที่สามารถรวมตัวใหม่ได้ในสายคู่ของ DNA ^{[ 1 ]}

Cas4 จับและเก็บชิ้นส่วน DNA สั้นๆ ที่เรียกว่า "สเปเซอร์" จากองค์ประกอบต่างๆ ลงในอาร์เรย์ CRISPR จีโนมของโฮสต์ เพื่อรักษาภูมิคุ้มกันต่อไวรัสและองค์ประกอบเคลื่อนที่จากภายนอก^{[ 2 ]}ระบบ CRISPR-Cas ทั้งหมดจะจดจำและตัด "โปรโตสเปเซอร์" ให้มีขนาดที่ถูกต้อง ในขณะที่เชื่อม "สเปเซอร์" เข้ากับอาร์เรย์ CRISPR จีโนมในทิศทางที่ถูกต้อง^{[ 2 ]} "โปรโตสเปเซอร์" จะถูกจดจำโดยโมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ (PAM) ที่มี 2 ถึง 5 คู่เบส เพื่อกำหนดทิศทางและแทรกเข้าไปในอาร์เรย์ CRISPR ^{[ 2 ]} Cas4 จะตัดเหนือลำดับ PAM เพื่อให้แน่ใจว่าสเปเซอร์ทำงานได้^{[ 3 ]}การวางแนวของสเปเซอร์เกิดขึ้นระหว่างการรวม virto ในความถี่ที่คล้ายคลึงกันกับโปรตีน Cas1 และ Cas2 การวางแนวที่ถูกต้องเป็นที่ต้องการอย่างมากในร่างกายเพื่อทำหน้าที่ในการจดจำเป้าหมาย^{[ 2 ]}

โปรตีน Cas4 เป็นโปรตีนหลักสำหรับ CRISPR โดยป้องกันสเปเซอร์ที่ไม่ทำงานและรับประกันความถูกต้องของการปรับแต่ง^{[ 4 ]} CRISPR-Cas เป็นแหล่งสำรองภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวเพื่อให้ทันกับองค์ประกอบทางพันธุกรรมเคลื่อนที่ที่กำลังพัฒนา เช่น พลาสมิดและแบคทีริโอเฟจ^{[ 5 ]} CRISPR-Cas มีสามขั้นตอนผ่านภูมิคุ้มกัน ได้แก่ การปรับตัว การแสดงออก และการรบกวน^{[ 4 ]} Cas4 แสดงกิจกรรมการคลายเกลียว DNA เอ็กโซนิวคลีเอส และเอนโดนิวคลีเอส^{[ 4 ]}โปรตีน Cas4 สองตัวถูกใช้ในการประสานงานการจดจำ PAM การตัดแต่งพรีสเปเซอร์และการกำจัดส่วนที่ยื่นออกมา 3' และการรวม DNA สเปเซอร์เข้ากับอาร์เรย์ CRISPR ที่จัดเรียงเพื่อให้ได้ crRNA ที่ใช้งานได้กับ DNA เป้าหมายเพื่อโต้ตอบกับภูมิคุ้มกัน CRISPR ^{[ 2 ]}อาร์เรย์เป็นแหล่งของ RNA ขนาดเล็กที่นำทางคอมเพล็กซ์นิวคลีเอส Cas ไปยังเป้าหมาย^{[ 5 ]}

Cas4 จำเป็นสำหรับการประมวลผลพรีสเปเซอร์อย่างมีประสิทธิภาพโดยการสร้างคอมเพล็กซ์ Cas4- Cas1 - Cas2 ^{[ 3 ]} ในคอมเพล็กซ์นี้ Cas4 จะตัดซับสเตรตแบบสองสายที่มีส่วนยื่น 3' ยาวผ่านการตัดเอนโดนิวคลีโอไลติกแบบเฉพาะไซต์^{[ 4 ]} Cas4 มีปฏิสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับไซต์แอคทีฟอินทิเกรสของCas1จดจำลำดับ PAM ภายในซับสเตรตและตัดอย่างแม่นยำเหนือลำดับเหล่านั้น ทำให้มั่นใจได้ว่าจะได้รับสเปเซอร์ที่ใช้งานได้^{[ 4 ] [ 3 ]} Cas4 ทำหน้าที่เป็นนิวคลีเอสและจุดตรวจสอบโมเลกุลภายในกลไกการปรับตัว^{[ 3 ]}โปรตีน Cas4 ร่วมกับ Cas1-Cas2 ช่วยให้สามารถรวมลำดับที่เข้ากันได้กับการรบกวนปลายน้ำได้^{[ 3 ]}