การวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินโดยการจัดลำดับแท็กปลายคู่ ( ChIA-PETหรือChIA-PETS ) เป็นเทคนิคในชีววิทยาโมเลกุลที่รวมเอา การเพิ่มความเข้มข้นตาม การตกตะกอนภูมิคุ้มกันของโครมาติน (ChIP) การเชื่อมต่อความใกล้เคียงของโครมาตินแท็กปลายคู่และการจัดลำดับความเร็วสูงเพื่อกำหนดปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินระยะไกลใหม่ทั่ว ทั้งจีโนม ^{[ 1 ]}

ยีนสามารถถูกควบคุมโดยบริเวณที่อยู่ห่างไกลจากโปรโมเตอร์ เช่น องค์ประกอบควบคุม (regulatory elements) ตัวกั้น (insulators) และองค์ประกอบขอบเขต (boundary elements) รวม ถึงตำแหน่ง การจับของปัจจัยถอดรหัส (transcription-factor binding sites, TFBS)การค้นพบปฏิสัมพันธ์ระหว่าง บริเวณ ควบคุมและบริเวณรหัสของยีนมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการทำความเข้าใจกลไกที่ควบคุมการควบคุมยีนในภาวะสุขภาพและโรค (Maston et al., 2006) เทคนิค ChIA-PET สามารถใช้เพื่อระบุปฏิสัมพันธ์ ของโครมาตินที่มีลักษณะเฉพาะและมีฟังก์ชัน การทำงานระหว่าง ตำแหน่งการจับของปัจจัยถอดรหัส ที่อยู่ห่างไกลและใกล้เคียงกับโปรโมเตอร์ของยีนที่พวกมันมีปฏิสัมพันธ์ด้วย

นอกจากนี้ ChIA-PET ยังสามารถใช้เพื่อไขกลไก การควบคุม จีโนมในระหว่างกระบวนการต่างๆ เช่นการแบ่งเซลล์การเพิ่มจำนวนเซลล์และการพัฒนาเซลล์โดยการสร้าง แผนที่ ปฏิสัมพันธ์ของ ChIA-PET สำหรับโปรตีนควบคุมการจับกับ DNA และ บริเวณ โปรโมเตอร์เราสามารถระบุเป้าหมายเฉพาะสำหรับการแทรกแซงทางการรักษาได้ดียิ่งขึ้น (Fullwood & Yijun, 2009)

วิธีการ ChIA-PET ผสมผสานวิธีการที่ใช้ ChIP ^{[ 2 ]}และวิธีการที่ใช้การจับภาพโครงสร้างโครโมโซม (3C) ^{[ 3 ]}เพื่อขยายขีดความสามารถของทั้งสองแนวทาง ChIP-Sequencing (ChIP-Seq) เป็นวิธีการที่นิยมใช้ในการระบุตำแหน่งการจับของปัจจัยการถอดรหัส (TFBS) ในขณะที่ 3C ถูกใช้เพื่อระบุปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินระยะไกล ทั้งสองวิธีต่างก็มีข้อจำกัดในการระบุปฏิสัมพันธ์ระยะไกลแบบ de-novo ทั่วทั้งจีโนม แม้ว่า ChIP-Seq จะสามารถระบุ TFBS ทั่วทั้งจีโนมได้^{[ 4 ] [ 5 ]}แต่ก็ให้ข้อมูลเชิงเส้นของตำแหน่งการจับของโปรตีนตามโครโมโซมเท่านั้น (แต่ไม่ใช่ปฏิสัมพันธ์ระหว่างกัน) และอาจประสบปัญหาจากสัญญาณรบกวนพื้นหลังของจีโนมสูง (ผลบวกเท็จ) ในขณะที่ 3C สามารถวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินระยะไกลที่ไม่เป็นเชิงเส้นได้ แต่ไม่สามารถใช้ได้ทั่วทั้งจีโนม และเช่นเดียวกับ ChIP-Seq ก็ประสบปัญหาจากสัญญาณรบกวนพื้นหลังสูงเช่นกัน เนื่องจากสัญญาณรบกวนเพิ่มขึ้นตามระยะห่างระหว่างบริเวณที่มีปฏิสัมพันธ์ (สูงสุด 100kb) จึงจำเป็นต้องมีการควบคุมที่ยุ่งยากและใช้เวลานานเพื่อให้สามารถระบุลักษณะปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินได้อย่างแม่นยำ^{[ 6 ]}แตกต่างจาก 3C ซึ่งเป็นวิธีการสร้างโปรไฟล์ปฏิสัมพันธ์เฉพาะตำแหน่ง วิธีการทางเลือกอื่นๆ เช่นHi-Cได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อสร้างโปรไฟล์ปฏิสัมพันธ์ทั่วทั้งจีโนม^{[ 7 ]}แม้ว่าจะมีวิธีการสร้างโปรไฟล์จีโนมทั้งหมดสำหรับทั้ง TFBS และปฏิสัมพันธ์ระยะไกล การรวมแนวทางต่างๆ เข้ากับวิธีการ ChIA-PET ช่วยให้สามารถระบุพื้นที่จีโนมที่โปรตีนที่สนใจจับอยู่ รวมถึงบริเวณจีโนมที่โปรตีนนั้นมีปฏิสัมพันธ์ด้วย^{[ 8 ] [ 9 ]}

วิธีการ ChIA-PET ประสบความสำเร็จในการแก้ไขปัญหาเรื่องสัญญาณรบกวนจากการปฏิสัมพันธ์ที่ไม่จำเพาะเจาะจงที่พบใน ChIP-Seq โดยการใช้คลื่นเสียงกับชิ้นส่วน ChIP เพื่อแยกการยึดเกาะแบบสุ่มออกจากสารประกอบที่มีปฏิสัมพันธ์จำเพาะ ขั้นตอนต่อไป ซึ่งเรียกว่าการเพิ่มความเข้มข้น จะช่วยลดความซับซ้อนสำหรับการวิเคราะห์ทั่วทั้งจีโนม และเพิ่มความจำเพาะเจาะจงให้กับการปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินที่ถูกจับโดย TF (ปัจจัยการถอดรหัส) ที่กำหนดไว้ล่วงหน้า ความสามารถของวิธีการ 3C ในการระบุปฏิสัมพันธ์ระยะไกลนั้นขึ้นอยู่กับทฤษฎีการเชื่อมต่อแบบใกล้เคียง ในส่วนของการเชื่อมต่อ DNA ชิ้นส่วนที่ถูกยึดไว้ด้วยสารประกอบโปรตีนทั่วไปจะมีข้อได้เปรียบทางจลนศาสตร์มากกว่าภายใต้สภาวะเจือจาง เมื่อเทียบกับชิ้นส่วนที่แพร่กระจายอย่างอิสระในสารละลายหรือยึดอยู่ในสารประกอบที่แตกต่างกัน ChIA-PET ใช้ประโยชน์จากแนวคิดนี้โดยการรวมลำดับตัวเชื่อมเข้ากับปลายอิสระของชิ้นส่วน DNA ที่ยึดติดกับสารประกอบโปรตีน เพื่อสร้างการเชื่อมต่อของชิ้นส่วนที่ยึดติดกันด้วยคอมเพล็กซ์ควบคุม ลำดับของตัวเชื่อมจะถูกเชื่อมต่อในระหว่างการเชื่อมต่อแบบใกล้เคียงนิวเคลียร์ ดังนั้น ผลิตภัณฑ์ของการเชื่อมต่อด้วยตัวเชื่อมจึงสามารถวิเคราะห์ได้ด้วยการจัดลำดับ PET ที่มีความเร็วสูงมากและแมปไปยังจีโนมอ้างอิงเนื่องจาก ChIA-PET ไม่ขึ้นอยู่กับไซต์เฉพาะสำหรับการตรวจจับเหมือนกับ 3C และ 4C จึงช่วยให้สามารถตรวจจับปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินแบบ de-novo ทั่วทั้งจีโนมได้อย่างเป็นกลาง^{[ 8 ]}เมื่อเปรียบเทียบกับ Hi-C การใช้การดึงแอนติบอดีจะจำกัดจำนวนชิ้นส่วนที่จัดลำดับให้เหลือเพียงปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินที่จับกับโปรตีนที่สนใจ ซึ่งจะช่วยให้การวิเคราะห์ข้อมูลง่ายขึ้นด้วย

ส่วนงานปฏิบัติการในห้องปฏิบัติการ:

• ฟอร์มาลดีไฮด์ใช้ในการเชื่อมโยงโมเลกุล DNA-โปรตีนเข้าด้วยกัน การใช้คลื่นเสียงความถี่สูง (Sonication)ใช้ในการสลายโครมาตินและลดปฏิกิริยาที่ไม่จำเพาะเจาะจง
• มีการใช้แอนติบอดีจำเพาะที่เลือกไว้เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของชิ้นส่วนโครมาตินที่จับกับโปรตีนที่สนใจ วัสดุ ChIP ที่จับกับแอนติบอดีจะถูกนำมาใช้ในการสร้าง ChIA-PET
• รูปที่ 1. โอลิโกนิวคลีโอไทด์ฮาล์ฟลิงเกอร์ที่ติดไบโอตินซึ่งมีไซต์ MmeI ขนาบข้าง ถูกนำมาใช้เชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA ที่เชื่อมต่อกันแบบใกล้เคียงกัน ลิงเกอร์สองแบบที่แตกต่างกันได้รับการออกแบบ (A และ B) โดยมีบาร์โค้ดนิวคลีโอไทด์เฉพาะ (CG หรือ AT) สำหรับลำดับลิงเกอร์ทั้งสอง (ซึ่งจะช่วยให้สามารถระบุผลิตภัณฑ์การเชื่อมต่อแบบไคเมอริกได้ตามที่อธิบายไว้ในรูปที่ 5)
• รูปที่ 2. ตัวเชื่อมถูกเชื่อมต่อเข้ากับชิ้นส่วน DNA ที่ยึดไว้
• Figure 3. The linker fragments are ligated on the ChIP beads under dilute conditions. The purified DNA is then digested by MmeI, which cuts at a distance from its recognition site to release the tag-linker-tag structure.
• Figure 4. The biotinylated PETs are then immobilized on streptavidin-conjugated magnetic beads.
• Figure 5. PET sequences with AA (CG/CG) and BB (AT/AT) linker barcode composition are considered to be possible intra-complex ligation products, while the PET sequences with AB (CG/AT) linker composition are considered to be derived from chimeric ligation products between DNA fragments bounded in different chromatin complexes.

Dry-lab portion of the workflow:

PET extraction, mapping, and statistical analyses

The PET tags are extracted and mapped to the reference human genomein silico.

Identification of ChIP enriched peaks (binding sites)

Self-ligated PET are used for identifying ChIP enriched sites because they provide the most reliable mapping (20 + 20 bit/s) to the reference genome.

ChIP enrichment peak-finding algorithm

A called peak is considered a binding site if there are multiple overlapping self-ligated PETs. The false discovery rate (FDR) is determined using statistical simulations to estimate the random background of PET-derived virtual DNA overlaps, and the estimated background noise.

Filtering of repetitive DNA (affects non-specific binding)

Satellite regions and binding sites present in regions with severe structural variations are removed.

ChIP enrichment count

The numbers of self-ligation and inter-ligation PETs (within + 250 bp window) are reported at each site. The total number of self-ligated and inter-ligated PETs at a specific site is called the ChIP enrichment count.

Figure 6. PET Classification: Uniquely aligned PET sequences can be classified by whether they are derived from one DNA fragment or two DNA fragments.

• Self-ligation PETs

If the two tags of a PET are mapped on the same chromosome with the genomic span in the range of ChIP DNA fragments (less than 3 Kb), with expected self-ligation orientation and on the same strand, they are considered to be derived from a self-ligation of a single ChIP DNA fragment, and considered a self-ligation PET.

• Inter-ligation PETs

If a PET does not fit into these criteria, then the PET most likely resulted from a ligation product between two DNA fragments and referred to as an inter-ligation PET. The two tags of an inter-ligation PETs do not have fixed tag orientations, might not be found on the same strands, might have any genomic span, and might not map to the same chromosome.

• Intrachromosomal inter-ligation PETs

If the two tags of an inter-ligation PET are mapped in the same chromosome but with a span > 3 Kb in any orientation, then these PETs are called intrachromosomal inter-ligation PETs.

• การเชื่อมต่อระหว่างโครโมโซม PET

PET ที่ถูกแมปไปยังโครโมโซมที่แตกต่างกัน เรียกว่า PET ที่เชื่อมต่อระหว่างโครโมโซม (interchromosomal inter-ligation PETs)

รูปที่ 7 กลไกที่เสนอแสดงให้เห็นว่าองค์ประกอบควบคุมระยะไกลสามารถเริ่มต้นปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินระยะไกลที่เกี่ยวข้องกับบริเวณโปรโมเตอร์ของยีนเป้าหมายได้อย่างไร

ปฏิสัมพันธ์เหล่านี้ก่อให้เกิดโครงสร้างลูป DNA ที่มี TFBS หลายตำแหน่งที่จุดยึดตรงกลาง ลูปขนาดเล็กอาจบรรจุยีนไว้ใกล้จุดยึดในช่องย่อยที่แน่นหนา ซึ่งอาจเพิ่มความเข้มข้นของโปรตีนควบคุมในบริเวณนั้นเพื่อกระตุ้นการถอดรหัสให้มากขึ้น กลไกนี้อาจเพิ่มประสิทธิภาพการถอดรหัส ทำให้ RNA pol II สามารถวนรอบแม่แบบยีนวงกลมที่แน่นหนาได้ ลูปปฏิสัมพันธ์ขนาดใหญ่มีแนวโน้มที่จะเชื่อมโยงยีนที่อยู่ห่างไกลกันที่ปลายทั้งสองข้างของลูปซึ่งอยู่ใกล้กับจุดยึดเพื่อการควบคุมที่ประสานกัน หรืออาจแยกยีนในลูปยาวเพื่อป้องกันการกระตุ้นการทำงานของยีน ดัดแปลงจาก Fullwood et al. (2009)

ข้อดีของวิธีการ ChIA-PET

• ChIA-PET มีศักยภาพที่จะเป็นแนวทางที่ไม่ลำเอียง ครอบคลุมทั้งจีโนม และเป็นแนวทางใหม่ สำหรับการวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินในระยะไกล (Fullwood & Yijun, 2009)
• การทดลอง ChIA-PET สามารถให้ข้อมูลชุดใหญ่ได้สองชุด ได้แก่ ตำแหน่งการจับของปัจจัยโปรตีน (PET ที่จับกับตัวเอง) และปฏิสัมพันธ์ระหว่างตำแหน่งการจับ (PET ที่จับกับตัวอื่น)
• ChIA-PET เป็นเทคนิคที่ใช้ ChIP เพื่อลดความซับซ้อนในการวิเคราะห์จีโนมโดยรวม และเพิ่มความจำเพาะเจาะจงให้กับปฏิกิริยาของโครมาตินที่ถูกจับโดยปัจจัยที่สนใจเป็นพิเศษ
• ChIA-PET สามารถใช้งานร่วมกับวิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอรุ่นใหม่แบบใช้แท็ก เช่น Roche 454 pyrosequencing , Illumina GA, ABI SOLiD และ Helicos ได้
• เทคนิค ChIA-PET สามารถนำไปใช้กับโปรตีนหลายชนิดที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการถอดรหัสหรือโครงสร้างของโครมาตินได้
• การวิเคราะห์ ChIA-PET สามารถนำไปใช้กับการปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการภายในนิวเคลียสโดยเฉพาะได้ โดยการใช้ปัจจัยถอดรหัสทั่วไป เช่นRNA Polymerase IIอาจทำให้สามารถระบุการปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการถอดรหัสได้ นอกจากนี้ การใช้ปัจจัยโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการจำลองดีเอ็นเอหรือโครงสร้างโครมาตินจะช่วยให้สามารถระบุการปฏิสัมพันธ์ทั้งหมดที่เกิดจากการจำลองดีเอ็นเอและการดัดแปลงโครงสร้างโครมาตินได้ (Fullwood et al., 2009)

จุดอ่อน

• เป็นที่ทราบกันดีว่าคอมเพล็กซ์ควบคุมแบบซิสและทรานส์ประกอบด้วยโปรตีนที่รวมกันอย่างเป็นเอกลักษณ์โดยขึ้นอยู่กับสภาวะเฉพาะของเซลล์และเนื้อเยื่อ (Dekker et al., 2006) แม้ว่าการระบุ TFBS ที่ทำงานได้เพียงตัวเดียวจะเป็นความก้าวหน้าที่สำคัญ แต่การใช้ ChIA-PET เพื่อระบุโปรตีนแต่ละตัวในคอมเพล็กซ์นั้นจะต้องอาศัยการคาดเดาและการทดลองหลายครั้งเพื่อระบุโปรตีนที่ทำปฏิกิริยาแต่ละตัว ซึ่งจะเป็นงานที่สิ้นเปลืองทั้งค่าใช้จ่ายและเวลา
• การตรวจ ChIA-PET มีข้อจำกัดอยู่ที่คุณภาพ ความบริสุทธิ์ และความจำเพาะของแอนติบอดีที่ใช้ (Fullwood et al., 2009)
• ChIA-PET ขึ้นอยู่กับการระบุลำดับที่สามารถจับคู่กับลำดับอ้างอิง (ref) ได้
• ChIA-PET จำเป็นต้องใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ในการระบุจุดสูงสุด (peak-calling) เพื่อจัดระเบียบและจับคู่ข้อมูล PET กับจีโนมอ้างอิง เนื่องจากความแตกต่างระหว่างแพลตฟอร์มซอฟต์แวร์ ผลลัพธ์จึงอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับโปรแกรมที่ใช้
• แม้ว่าบริเวณดีเอ็นเอที่ซ้ำกันอาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมยีน (Polak & Domany, 2006) แต่จำเป็นต้องกำจัดออก เนื่องจากอาจส่งผลกระทบต่อข้อมูลได้ (Fullwood et al., 2009)
• การเสริมคุณค่าจากสองแหล่งพร้อมกันทำให้เกิดอคติต่อภูมิภาคโดยรอบ^{[ 10 ]}

Fullwood et al. (2009) ใช้ ChIA-PET ในการตรวจจับและสร้างแผนที่เครือข่ายปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินที่ถูกควบคุมโดยตัวรับเอสโตรเจนอัลฟา (ER-alpha) ในเซลล์มะเร็งของมนุษย์ แผนที่ปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินโดยรวมที่ได้แสดงให้เห็นว่า ตำแหน่งการจับของ ER-alpha ที่อยู่ห่างไกลยังยึดติดกับโปรโมเตอร์ของยีนผ่านปฏิสัมพันธ์ของโครมาตินระยะไกล ซึ่งบ่งชี้ว่า ER-alpha ทำงานโดยการสร้างวงวนของโครมาตินอย่างกว้างขวางเพื่อนำยีนมารวมกันสำหรับการควบคุมการถอดรหัสอย่างเป็นระบบ

• โปรแกรมดูข้อมูลจีโนม ChIA-PET - โปรแกรมนี้ใช้สำหรับดูข้อมูลจาก Fullwood et al. (2009) และมีโปรแกรมดูปฏิสัมพันธ์ของจีโนมทั้งหมดแบบกำหนดเอง ซึ่งให้ภาพรวมของตำแหน่งการจับและปฏิสัมพันธ์พร้อมกับภาพรวมของจีโนมทั้งหมด