คอสมิด

คอสมิด เป็น พลาสมิดลูกผสมชนิดหนึ่งที่มีลำดับcos ของแลมบ์ดาฟาจ^{[ 1 ]}มักใช้เป็นเวกเตอร์ในการโคลนในวิศวกรรมพันธุกรรมคอสมิดสามารถใช้สร้างคลังจีโนมได้ คอลลินส์และโฮห์นได้อธิบายคอสมิดเป็นครั้งแรกในปี 1978 ^{[ 2 ]} คอสมิดสามารถบรรจุดีเอ็นเอได้ 37 ถึง 52 (โดยปกติ 45) กิโลเบส ซึ่งเป็นขีดจำกัดตามขนาดบรรจุภัณฑ์ของแบคทีริโอฟาจปกติ คอสมิดสามารถจำลองตัว เองได้ เหมือนพลาสมิดหากมีต้นกำเนิดการจำลอง (ori) ที่เหมาะสม เช่นSV40 ori ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วย นม ColE1 ori สำหรับการจำลองดีเอ็นเอแบบสองสาย หรือf1 ori สำหรับการจำลองดีเอ็นเอแบบสายเดียวในโปรคาริโอต คอสมิดมักมียีนสำหรับการคัดเลือก เช่นยีนต้านทานยาปฏิชีวนะเพื่อให้สามารถระบุเซลล์ที่ถูกแปลงสภาพได้โดยการเพาะเลี้ยงบนอาหารที่มียาปฏิชีวนะ เซลล์ที่ไม่รับคอสมิดจะไม่สามารถเจริญเติบโตได้^{[ 3 ]}

แตกต่างจากพลาสมิด พวกมันยังสามารถบรรจุในหลอดทดลองลงในแคปซิดของฟาจได้ ซึ่งเป็นขั้นตอนที่ต้องใช้ปลายที่เชื่อมต่อกันหรือที่รู้จักกันในชื่อ ไซต์ cosซึ่งใช้ในการโคลนนิ่งโดยใช้แลมบ์ดาฟาจเป็นเวกเตอร์ อย่างไรก็ตาม ยีนแลมบ์ดาเกือบทั้งหมดถูกลบออกไป ยกเว้น ลำดับ cosดีเอ็นเอไฮบริดคอสมิดในแคปซิดสามารถถ่ายโอนไปยังเซลล์แบคทีเรียได้โดยการทรานสดักชัน เนื่องจากมีความต้องการการบรรจุในหลอดทดลองซึ่งต้องมีดีเอ็นเออย่างน้อย 38 กิโลเบสระหว่างไซต์ cos เวกเตอร์ที่ไม่มีดีเอ็นเอแทรกจะไม่ถูกบรรจุ (ความไม่เสถียรของพลาสมิดจะเพิ่มขึ้นหากดีเอ็นเอที่แทรกใหม่มีลำดับซ้ำโดยตรงหรือดีเอ็นเอพาลินโดรม (ลำดับซ้ำแบบกลับด้าน) จำนวนมาก ความไม่เสถียรนี้สามารถแก้ไขได้โดยการใช้แบคทีเรียโฮสต์ที่มีการกลายพันธุ์เฉพาะที่ส่งผลต่อการรวมตัวของดีเอ็นเอ (หมายเหตุ การไม่มีลำดับซ้ำแบบกลับด้านถูกบันทึกไว้ในสิ่งพิมพ์แรกของ Hohn & Collins ที่อ้างถึงข้างต้น ดูเพิ่มเติมที่^{[ 4 ]} )

ลำดับ cosมีความยาวประมาณ 200 คู่เบส และมีความสำคัญต่อกระบวนการบรรจุ ประกอบด้วย ไซต์ cosNซึ่งเป็นตำแหน่งที่เอนไซม์เทอร์มิเนสจะตัดสาย DNA แต่ละสาย โดยห่างกัน 12 คู่เบสการตัดนี้ทำให้คอสมิดวงกลมกลายเป็นเส้นตรง โดยมีปลาย "ยึดเกาะ" หรือ "เหนียว" สองปลาย ยาว 12 คู่เบส (DNA ต้องเป็นเส้นตรงเพื่อให้พอดีกับหัวของฟาจ) ไซต์ cosBจะยึดเอนไซม์เทอร์มิเนสไว้ในขณะที่มันกำลังตัดและแยกสาย DNA ส่วน ไซต์ cosQของคอสมิดถัดไป (เนื่องจากการจำลองแบบวงกลมมักส่งผลให้เกิด สาย DNA ที่เชื่อม ต่อกันเป็นเส้นตรง ) จะถูกเอนไซม์เทอร์มิเนสยึดไว้หลังจากที่คอสมิดก่อนหน้าถูกบรรจุแล้ว เพื่อป้องกันการย่อยสลายโดยเอนไซม์ DNaseใน เซลล์

คอสมิดส่วนใหญ่เป็นพลาสมิดที่มีoriV ของแบคทีเรีย เครื่องหมายคัดเลือกยาปฏิชีวนะ และไซต์สำหรับการโคลน แต่พวกมันจะมีไซต์ cos หนึ่งไซต์ หรือล่าสุดสองไซต์ ที่ได้มาจากแบคทีริโอเฟจแลมบ์ดา ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์เฉพาะของการทดลอง คอสมิดที่มีช่วงโฮสต์กว้าง คอสมิดแบบชัตเติล หรือคอสมิด 'สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม' (เชื่อมโยงกับ oriV ของ SV40 และเครื่องหมายคัดเลือกสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) ก็มีให้เลือกใช้ ความจุในการบรรจุของคอสมิดจะแตกต่างกันไปตามขนาดของเวกเตอร์เอง แต่โดยทั่วไปจะอยู่ที่ประมาณ 40–45 กิโลเบส ขั้นตอนการโคลนเกี่ยวข้องกับการสร้างแขนเวกเตอร์สองแขนแล้วนำไปเชื่อมต่อกับดีเอ็นเอต่างประเทศ การคัดเลือกดีเอ็นเอคอสมิดชนิดป่าทำได้ง่ายๆ โดยการแยกตามขนาด ดังนั้นคอสมิดจึงสร้างโคโลนีเสมอ ไม่ใช่พลาค นอกจากนี้ความหนาแน่นของโคลนยังต่ำกว่ามาก โดยอยู่ที่ประมาณ 10⁵ ^– 10⁶ ^CFU ต่อไมโครกรัมของดีเอ็นเอที่เชื่อมต่อกัน

หลังจากสร้างไลบรารีของแลมบ์ดาหรือคอสมิดแบบลูกผสมแล้ว ดีเอ็นเอทั้งหมดจะถูกถ่ายโอนไปยัง โฮสต์ E. coli ที่เหมาะสม โดยใช้เทคนิคที่เรียกว่าการบรรจุในหลอดทดลอง (in vitro packaging) สารสกัดที่จำเป็นสำหรับการบรรจุได้มาจาก ไลโซเจน ของ E. coli cI857 (red-gam-Sam และ Dam (ส่วนหัว) และ Eam (ส่วนหาง) ตามลำดับ) สารสกัดเหล่านี้จะจดจำและบรรจุโมเลกุลลูกผสมในหลอดทดลองทำให้เกิดอนุภาคฟาจที่สมบูรณ์ (เวกเตอร์แบบแลมบ์ดา) หรือพลาสมิดลูกผสมที่บรรจุอยู่ในเปลือกฟาจ (คอสมิด) ความแตกต่างเหล่านี้สะท้อนให้เห็นในความถี่การติดเชื้อที่แตกต่างกัน โดยเวกเตอร์แบบแลมบ์ดาให้ผลดีกว่า ซึ่งชดเชยความจุในการบรรจุที่ต่ำกว่าเล็กน้อย นอกจากนี้ ไลบรารีของฟาจยังจัดเก็บและคัดกรองได้ง่ายกว่าไลบรารีของคอสมิด

ดีเอ็นเอเป้าหมาย: ดีเอ็นเอจีโนมที่จะทำการโคลนจะต้องถูกตัดเป็นชิ้นส่วนขนาดที่เหมาะสมด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ โดยปกติแล้วจะทำโดยการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะบางส่วน ตามด้วยการแยกขนาดหรือการกำจัดหมู่ฟอสเฟต (โดยใช้เอนไซม์ฟอสฟาเทสจากลำไส้ลูกวัว) เพื่อหลีกเลี่ยงการสลับตำแหน่งของโครโมโซม กล่าวคือ การเชื่อมต่อชิ้นส่วนที่ไม่ได้เชื่อมต่อกันทางกายภาพ

เวกเตอร์ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ "SuperCos 1"