การตรึงด้วยความเย็นเป็นเทคนิคสำหรับการตรึงหรือทำให้วัสดุชีวภาพคงตัว ซึ่งเป็นขั้นตอนแรกในการเตรียมตัวอย่างสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง [ ^{1 ] ตัวอย่าง}ทั่วไปสำหรับการตรึงด้วยความเย็น ได้แก่ ตัวอย่างเนื้อเยื่อพืชหรือสัตว์ ขนาดเล็ก สารแขวนลอยของเซลล์จุลินทรีย์หรือเซลล์เพาะเลี้ยง สารแขวนลอยของไวรัสหรือแคปซิดของไวรัส และตัวอย่าง ของโมเลกุลขนาดใหญ่ที่บริสุทธิ์โดยเฉพาะโปรตีน^{[ 2 ] [ 3 ]}

ประเภทของการตรึงด้วยความเย็น ได้แก่ การแช่แข็งแบบแห้ง การแช่แข็งแบบแทนที่ และการแช่แข็งแบบกัดกร่อน

วิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการทำให้ตัวอย่างเนื้อเยื่อหรือเซลล์ขนาดเล็กเย็นตัวลงอย่างรวดเร็วมากจนถึงอุณหภูมิของไนโตรเจน เหลว (−196 °C) หรือต่ำกว่านั้น ซึ่งจะหยุดการเคลื่อนไหวและกิจกรรมทางเมตาบอลิซึมทั้งหมด และรักษาสภาพโครงสร้างภายในโดยการแช่แข็งเฟส ของเหลวทั้งหมดให้ กลายเป็นของแข็ง โดยทั่วไป ตัวอย่างจะถูกจุ่มลงในไนโตรเจนเหลว หรืออีเทน เหลว หรือ โพรเพนเหลวในภาชนะที่ทำให้เย็นลงด้วยไนโตรเจนเหลว เป้าหมายสูงสุดคือการแช่แข็งตัวอย่างอย่างรวดเร็วมาก (ที่ 10⁴ ^ถึง 10⁶ ^เคลวินต่อวินาที) จนผลึกน้ำแข็งไม่สามารถก่อตัวได้ หรือถูกป้องกันไม่ให้เติบโตจนมีขนาดใหญ่พอที่จะก่อให้เกิดความเสียหายต่อโครงสร้างระดับจุลภาค ของ ตัวอย่าง การสร้างตัวอย่างที่มีตัวอย่างอยู่ในน้ำแข็งอสัณฐานถือเป็น " เป้าหมายสูงสุด " ของกล้องจุลทรรศน์แช่แข็งทางชีววิทยา

ในทางปฏิบัติ เป็นเรื่องยากมากที่จะบรรลุอัตราการทำความเย็นที่สูงเพียงพอที่จะผลิตน้ำแข็งอสัณฐานในชิ้นงานที่มีความหนามากกว่าไม่กี่ไมโครเมตรด้วยเหตุนี้ การจุ่มชิ้นงานลงในไนโตรเจนเหลวที่จุดเดือด (−196 °C) ^{[ 4 ]}จึงไม่ได้ทำให้ชิ้นงานแข็งตัวเร็วพอเสมอไป ด้วยเหตุผลหลายประการ ประการแรก ไนโตรเจนเหลวจะเดือดอย่างรวดเร็วรอบๆ ชิ้นงาน ทำให้เกิดฟิล์มของN ที่เป็นฉนวน₂ก๊าซที่ชะลอการถ่ายเทความร้อนไปยังของเหลวไครโอเจนิก เรียกว่าปรากฏการณ์ไลเดนฟรอสต์อัตราการทำความเย็นสามารถปรับปรุงได้โดยการปั๊มไนโตรเจนเหลวด้วยปั๊มสุญญากาศแบบใบพัดหมุนเป็นเวลาสองสามสิบวินาทีก่อนที่จะจุ่มชิ้นงานลงไป การทำเช่นนี้จะลดอุณหภูมิของไนโตรเจนเหลวลงต่ำกว่าจุดเดือด ดังนั้นเมื่อจุ่มชิ้นงานลงไป ไนโตรเจนเหลวจะห่อหุ้มชิ้นงานอย่างใกล้ชิดในช่วงเวลาสั้นๆ และดึงความร้อนออกจากชิ้นงานได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น การทำความเย็นที่เร็วกว่านั้นสามารถทำได้โดยการจุ่มชิ้นงานลงในโพรเพนหรืออีเทน เหลว (พบว่าอีเทนมีประสิทธิภาพมากกว่า) ^{[ 5 ]}ที่ทำให้เย็นลงใกล้จุดหลอมเหลวโดยใช้ไนโตรเจนเหลว^{[ 6 ] หรือโดยการกระแทกชิ้นงานกับพื้น ผิว}โลหะที่ขัดเงาอย่างดีซึ่งทำให้เย็นด้วยไนโตรเจนเหลวที่ทำจากทองแดงหรือเงิน^{[ 7} ] ประการที่สอง คุณสมบัติสองประการของน้ำเองป้องกันการตรึงด้วยความเย็นอย่างรวดเร็วในชิ้นงานขนาดใหญ่^{[ 8 ]}ค่าการนำความร้อนของน้ำแข็งนั้นต่ำมากเมื่อเทียบกับโลหะและน้ำจะปล่อยความร้อนแฝงของการหลอมเหลว ออกมา เมื่อแข็งตัว ทำให้การเย็นตัวอย่างรวดเร็วในชิ้นงานที่มีความหนามากกว่าไม่กี่ไมโครเมตรเป็นไปไม่ได้

ความดันสูงช่วยป้องกันการก่อตัวของผลึกน้ำแข็งขนาดใหญ่ การแช่แข็งอย่างรวดเร็วด้วยความดันในตัว (SPRF) สามารถใช้สารทำความเย็นได้หลายชนิด และเมื่อเร็ว ๆ นี้ได้รับการยกย่องว่าเป็นทางเลือกที่น่าสนใจและต้นทุนต่ำกว่าการแช่แข็งด้วยความดันสูง (HPF) ^{[ 9 ]}ไนโตรเจนที่มีความดันต่ำจะเข้ามาแทนที่เอทานอลที่อุณหภูมิประมาณ 123K จากนั้นเอทานอลที่อุ่นจะถูกขับออกโดย LN2 ที่กำลังแข็งตัว และมีแนวโน้มที่จะสร้างส่วนผสมของเอทานอลและไนโตรเจนซึ่งค่อย ๆ เย็นลงเรื่อย ๆ^{[ 10 ]}

เวลาในการอบแห้งจะลดลงได้ถึง 30% ด้วย การอบ แห้งแบบแช่แข็ง ที่เหมาะสม ^{[ 11 ]}

• การแช่แข็ง