DRIP-seq (DRIP-sequencing)เป็นเทคโนโลยีสำหรับการสร้างโปรไฟล์ทั่วทั้งจีโนมของไฮบริด DNA-RNA ชนิดหนึ่งที่เรียกว่า " R-loop " ^{[ 1 ]} DRIP-seq ใช้ แอนติบอดีที่ไม่ขึ้นกับลำดับแต่จำเพาะต่อโครงสร้าง สำหรับ การตกตะกอนภูมิคุ้มกัน DNA-RNA (DRIP) เพื่อจับ R-loop สำหรับ การจัดลำดับ DNAแบบขนานจำนวนมาก^{[ 1 ]}

R-loop คือ โครงสร้าง กรดนิวคลีอิก สามสาย ซึ่งประกอบด้วยคู่ไฮบริด DNA-RNA และ DNA สายเดี่ยว (ssDNA) ที่เคลื่อนที่^{[ 2 ]} R-loop เกิดขึ้นเป็นส่วนใหญ่ใน บริเวณจีโนมที่อุดมไปด้วย ไซโตซีนระหว่างการถอดรหัส^{[ 2 ]}และเป็นที่ทราบกันว่าเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยีนและการเปลี่ยนคลาสของอิมมูโนโกลบูลิน [ ^{1 ] [ 3 ] [ 4 ] พบ}ได้ในสิ่งมีชีวิตหลากหลายชนิด ตั้งแต่แบคทีเรียไปจนถึงสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 2 ]}โดยส่วนใหญ่จะอยู่บริเวณโปรโมเตอร์ของเกาะ CpG ในเซลล์มนุษย์และบริเวณที่มีการถอดรหัสสูงในยีสต์^{[ 1 ] [ 3 ]}

ภายใต้สภาวะผิดปกติ กล่าวคือ การผลิตไฮบริด DNA-RNA ที่เพิ่มขึ้น R-loop สามารถทำให้จีโนมไม่เสถียรได้โดยการเปิดเผย DNA สายเดี่ยวต่อความเสียหายภายในที่เกิดจากการทำงานของเอนไซม์ เช่นAIDและAPOBECหรือการสัมผัสกับสารเคมีที่มีปฏิกิริยามากเกินไป^{[ 4 ]}ดังนั้น การทำความเข้าใจว่า R-loop เกิดขึ้นที่ใดและในสถานการณ์ใดทั่วทั้งจีโนมจึงมีความสำคัญต่อการทำความเข้าใจความไม่เสถียรของจีโนมให้ดียิ่งขึ้น ในตอนแรก การระบุลักษณะของ R-loop ถูกจำกัดไว้เฉพาะวิธีการเฉพาะตำแหน่ง^{[ 5 ]}อย่างไรก็ตาม เมื่อ เทคโนโลยี การจัดลำดับแบบขนานขนาดใหญ่และอนุพันธ์ต่างๆ เช่น DRIP-seq เข้ามา ความเป็นไปได้ในการตรวจสอบจีโนมทั้งหมดเพื่อหา R-loop ก็เปิดกว้างขึ้น

DRIP-seq อาศัยความจำเพาะและความสัมพันธ์สูงของแอนติบอดีโมโนโคลนอล S9.6 (mAb) ต่อไฮบริด DNA-RNA ที่มีความยาวต่างๆ กัน แอนติบอดีโมโนโคลนอล S9.6 ถูกสร้างและระบุลักษณะครั้งแรกในปี 1986 และปัจจุบันใช้สำหรับการตกตะกอนภูมิคุ้มกันแบบเลือกเฉพาะของ R-loop ^{[ 6 ]}ตั้งแต่นั้นมา มันถูกนำไปใช้ในวิธีการตกตะกอนภูมิคุ้มกันที่หลากหลายสำหรับการระบุลักษณะของ R-loop ^{[ 1 ] [ 3 ] [ 7 ] [ 8 ]}แนวคิดเบื้องหลัง DRIP-seq คล้ายกับChIP-sequencingโดยที่ชิ้นส่วน R-loop เป็นวัสดุหลักที่ถูกตกตะกอนภูมิคุ้มกันใน DRIP-seq

DRIP-seq ส่วนใหญ่ใช้สำหรับการทำแผนที่ R-loop ทั่วทั้งจีโนม การระบุตำแหน่งการก่อตัวของ R-loop ช่วยให้สามารถศึกษาเหตุการณ์ต่างๆ ในเซลล์ได้ เช่น หน้าที่ของการก่อตัวของ R-loop ในบริเวณเฉพาะ การกำหนดลักษณะของบริเวณเหล่านี้ และผลกระทบต่อการแสดงออกของยีน นอกจากนี้ยังสามารถใช้เพื่อศึกษาอิทธิพลของ R-loop ในกระบวนการอื่นๆ เช่นการจำลองแบบและการสังเคราะห์ DNAโดยอ้อม DRIP-seq สามารถดำเนินการกับเซลล์กลายพันธุ์ที่ขาดจีนที่เกี่ยวข้องกับการแก้ไข R-loop ได้^{[ 3 ]}การศึกษาประเภทนี้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับบทบาทของจีนที่กลายพันธุ์ในการยับยั้งการก่อตัวของ DNA-RNA และอาจเกี่ยวกับความสำคัญของ R-loop ในความไม่เสถียรของจีโนม

DRIP-seq ถูกใช้ครั้งแรกสำหรับการสร้างโปรไฟล์ R-loop ทั่วทั้งจีโนมในมนุษย์ ซึ่งแสดงให้เห็นการก่อตัวของ R-loop ที่แพร่หลายในโปรโมเตอร์ของเกาะ CpG ^{[ 1 ]}โดยเฉพาะอย่างยิ่ง นักวิจัยพบว่าการก่อตัวของ R-loop เกี่ยวข้องกับสถานะที่ไม่มีการเมทิลเลชั่นของเกาะ CpG

ต่อมา DRIP-seq ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างโปรไฟล์การก่อตัวของ R-loop ที่จุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของการถอดรหัสในเซลล์ Ntera2 ที่มีศักยภาพหลายอย่างของมนุษย์[ 7 ^{]ในการ}ศึกษานี้ นักวิจัยได้เปิดเผยว่า R-loop ที่ปลาย 3' ของยีนอาจมีความสัมพันธ์กับการสิ้นสุดของการถอดรหัส

ขั้นแรกสกัดดีเอ็นเอจีโนม (gDNA) จากเซลล์ที่สนใจโดยใช้เอนไซม์โปรตีเนส เค ตามด้วย การสกัดด้วยฟีนอล-คลอโรฟอร์มและการตกตะกอนด้วยเอทานอลสำหรับเซลล์ยีสต์ จำเป็นต้องย่อยด้วยเอนไซม์ไซโมไลเอสเพิ่มเติมเพื่อกำจัดผนังเซลล์ก่อน การใช้เอนไซม์ โปรตีเนส เคนอกจากนี้ยังสามารถสกัด gDNA ได้ด้วยวิธีการอื่นๆ อีกหลายวิธี เช่นวิธีการแบบใช้คอลัมน์

ดีเอ็นเอจีโน ม (gDNA) จะถูกบำบัดด้วยเอนไซม์ S1 นิวคลี เอส เพื่อกำจัดดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) และ อาร์เอ็นเอ ( RNA ) ที่ไม่ต้องการ จากนั้นจึงตกตะกอนด้วยเอทานอลเพื่อกำจัดเอนไซม์ S1 นิวคลีเอสออกไป ต่อมา ดีเอ็นเอจีโนมจะถูกตัดด้วย เอนไซม์ ตัดจำเพาะ (restriction endonuclease ) ทำให้ได้ดีเอ็นเอสายคู่ (dsDNA) ที่มีขนาดแตกต่างกัน หรืออีกทางเลือกหนึ่ง สามารถสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอจีโนมได้โดยการใช้คลื่นเสียง (sonication )

นำ gDNA ที่ถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ มาบ่มกับแอนติบอดีโมโนโคลนอล S9.6 ที่จำเพาะต่อโครงสร้าง DNA-RNA ขั้นตอนนี้เป็นเอกลักษณ์เฉพาะของโปรโตคอล DRIP-seq เนื่องจากอาศัยความจำเพาะและแรงยึดเกาะสูงของแอนติบอดี S9.6 ต่อไฮบริด DNA-RNA อย่างสมบูรณ์ แอนติบอดีจะจดจำและจับกับบริเวณเหล่านี้ที่กระจายอยู่ทั่วจีโนมและจะถูกนำไปใช้ในการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน แอนติบอดี S9.6 จะจับกับลูกปัดแม่เหล็กโดยการโต้ตอบกับลิแกนด์จำเพาะ (เช่นโปรตีน Aหรือโปรตีน G ) บนพื้นผิวของลูกปัด ดังนั้น ชิ้นส่วนที่มี DNA-RNA จะจับกับลูกปัดโดยอาศัยแอนติบอดี

ลูกปัดแม่เหล็กจะถูกล้างเพื่อกำจัด gDNA ที่ไม่ได้จับกับลูกปัดโดยการล้างหลายครั้ง และไฮบริด DNA-RNA จะถูกแยกออกมาโดยการชะล้าง เพื่อกำจัดแอนติบอดีที่จับกับไฮบริดกรดนิวคลีอิก จะทำการบำบัดด้วยโปรตีเนส K ตามด้วยการสกัดด้วยฟีนอล-คลอโรฟอร์ม และการตกตะกอนด้วยเอทานอล ซึ่งจะทำให้ได้ไฮบริด DNA-RNA บริสุทธิ์ที่มีขนาดแตกต่างกัน

สำหรับการจัดลำดับแบบขนานขนาดใหญ่ของชิ้นส่วนเหล่านี้ วัสดุที่ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันจะถูกทำให้แตกตัวด้วยคลื่นเสียง คัดเลือกตามขนาด และเชื่อมต่อกับ อะแดปเตอร์ โอลิโกนิวคลีโอไท ด์ที่มีบาร์โค้ด เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของกลุ่มและทำการจัดลำดับ

เพื่อตรวจจับตำแหน่งของการก่อตัวของ R-loop ลำดับการอ่านหลายร้อยล้านรายการจาก DRIP-seq จะถูกจัดเรียงกับจีโนมอ้างอิง ก่อน โดย ใช้ ตัวจัดเรียงลำดับการอ่านสั้น จากนั้นจึงใช้วิธีการเรียกจุดสูงสุด ที่ออกแบบมาสำหรับ ChIP-seq เพื่อประเมินสัญญาณ DRIP ^{[ 1 ]}หากใช้ค็อกเทลของเอนไซม์ตัดจำเพาะที่แตกต่างกันสำหรับการทดลอง DRIP-seq ที่แตกต่างกันของตัวอย่างเดียวกัน จุดสูงสุด DRIP-seq ที่เป็นเอกฉันท์จะถูกเรียก^{[ 7 ]}โดยทั่วไป จุดสูงสุดจะถูกเปรียบเทียบกับจุดสูงสุดจาก ตัวอย่างที่ได้รับการบำบัดด้วย RNase H1 ที่สอดคล้องกัน ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมอินพุต^{[ 1 ] [ 7 ]}

มีการพัฒนาเครื่องมือคำนวณ ฐานข้อมูล และกรอบการวิเคราะห์หลายอย่างสำหรับการทำนาย การระบุ การแสดงภาพ และการวิเคราะห์แบบบูรณาการของชุดข้อมูล R-loops และ DRIP-seq รวมถึง QmRLFS-finder, DROPA, R-loopBase และ RLBase ^{[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]}

เนื่องจากไม่มีวิธีการอื่นที่ใช้แอนติบอดีในการตกตะกอนภูมิคุ้มกันของ R-loop ทำให้การตรวจสอบความถูกต้องของผลลัพธ์ DRIP-seq ทำได้ยาก อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์จากวิธีการสร้างโปรไฟล์ R-loop อื่นๆ เช่น DRIVE-seq อาจใช้เพื่อวัดความสอดคล้องกันได้

ในทางกลับกัน DRIP-seq อาศัยแพลตฟอร์มการจัดลำดับดีเอ็นเอแบบอ่านสั้นที่มีอยู่แล้วสำหรับการจัดลำดับ R-loop กล่าวคือ ข้อจำกัดโดยธรรมชาติทั้งหมดของแพลตฟอร์มเหล่านี้ก็มีผลต่อ DRIP-seq ด้วยเช่นกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แพลตฟอร์มการจัดลำดับดีเอ็นเอแบบอ่านสั้นทั่วไปจะทำให้เกิดการครอบคลุมการอ่านที่ไม่สม่ำเสมอในบริเวณที่มี GC สูง การจัดลำดับ R-loop ที่ยาวอาจเป็นเรื่องท้าทาย เนื่องจาก R-loop ส่วนใหญ่เกิดขึ้นในบริเวณดีเอ็นเอที่มีไซโตซีนสูง นอกจากนี้ บริเวณที่มี GC สูงมักมีความซับซ้อนต่ำโดยธรรมชาติ ซึ่งทำให้โปรแกรมจัดเรียงลำดับแบบอ่านสั้นสร้างการจัดเรียงที่ไม่ซ้ำกันได้ยาก

แม้ว่าจะมีวิธีการวิเคราะห์และกำหนดลักษณะการก่อตัวของ R-loop อื่นๆ อีกหลายวิธี^{[ 5 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]}แต่มีเพียงไม่กี่วิธีเท่านั้นที่ให้ความครอบคลุมและความแข็งแกร่งในระดับจีโนม^{[ 1 ] [ 3 ]}

• การดัดแปลงไบซัลไฟต์แบบไม่ทำให้เสียสภาพและการจัดลำดับ : วิธีนี้ประกอบด้วยการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์ตามด้วยการจัดลำดับและอาศัยผลการกลายพันธุ์ของโซเดียมไบซัลไฟต์บน ssDNA แม้ว่าวิธีนี้จะใช้เป็นหลักในการระบุตำแหน่งโปรโมเตอร์ CpG island ที่เฉพาะเจาะจง^{[ 1 ]}แต่ก็ใช้ในการตรวจจับ R-loop ในระดับเล็กน้อย^{[ 5 ]}และตำแหน่งเปราะบาง ssDNA อื่นๆ^{[ 21 ]}
• DNA:RNA In Vitro Enrichment (DRIVE-seq) : ^{[ 1 ]}วิธีนี้มีหลักการคล้ายคลึงกับ DRIP-seq มาก ยกเว้นการใช้เอนโดนิวคลีเอส MBP-RNASEH1 แทน S9.6 mAb สำหรับการกู้คืน R-loops MBP-RNASEH1 เป็นทางเลือกแทน S9.6 mAb เมื่อจำเป็นต้องมีการทดสอบการจับเพิ่มเติม อย่างไรก็ตาม การแสดงออกมากเกินไปของเอนโดนิวคลีเอสนี้อาจก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ในร่างกาย
• การตกตะกอนภูมิคุ้มกัน DNA:RNA ตามด้วยการไฮบริดไดเซชันบนไมโครอาร์เรย์แบบเรียงต่อกัน (DRIP-chip) : ^{[ 3 ]}วิธีนี้ยังอาศัยการใช้ S9.6 mAb เช่นกัน อย่างไรก็ตาม แทนที่จะเข้าสู่ไปป์ไลน์การจัดลำดับ วัสดุที่ตกตะกอนภูมิคุ้มกันใน DRIP-chip จะถูกไฮบริดไดซ์กับไมโครอาร์เรย์ข้อดีของ DRIP-chip เหนือ DRIP-seq คือการได้รับข้อมูลอย่างรวดเร็ว ปัจจัยจำกัดของเทคนิคนี้คือจำนวนโพรบในไมโครอาร์เรย์ชิปและไม่มีข้อมูลลำดับ DNA

• การตกตะกอนภูมิคุ้มกัน
• ลำดับ ChIP
• การจัดลำดับดีเอ็นเอ