การทดสอบ ELISpot ( enzyme -linked immunosorbent spot ) เป็นวิธี การทดสอบชนิดหนึ่งที่เน้นการวัดปริมาณความถี่ของ การหลั่ง ไซโตไคน์จากเซลล์เดี่ยว การทดสอบ ELISpot ยังจัดเป็นรูปแบบหนึ่งของการย้อมสีภูมิคุ้มกันเนื่องจากจัดเป็นเทคนิคที่ใช้แอนติบอดีในการตรวจจับโปรตีนเป้าหมายโดยคำว่าเป้าหมายหมายถึงสารชีวภาพหรือสารเคมีใดๆ ที่ถูกระบุหรือวัด

การทดสอบ FluoroSpot เป็นรูปแบบหนึ่งของการทดสอบ ELISpot การทดสอบ FluoroSpot ใช้หลักการเรืองแสงเพื่อวิเคราะห์สารหลายชนิด ซึ่งหมายความว่าสามารถตรวจจับการหลั่งของโปรตีนได้มากกว่าหนึ่งชนิด

Cecil Czerkinsky อธิบาย ELISpot เป็นครั้งแรกในปี 1983 ว่าเป็นวิธีการใหม่ในการหาปริมาณการผลิตอิมมูโนโกลบูลินที่จำเพาะต่อแอนติเจนโดยเซลล์ไฮบริดโดมาในปี 1988 Czerkinsky ได้พัฒนาการ ทดสอบ ELISAแบบจุดที่หาปริมาณการหลั่งของลิมโฟไคน์โดยเซลล์ Tในปีเดียวกันนั้น ELISpot แบบสองสีได้ถูกนำมาใช้ร่วมกับการสร้างภาพด้วยคอมพิวเตอร์เป็นครั้งแรก ซึ่งทำให้สามารถนับและวิเคราะห์จุดได้ ปี 1988 ยังเป็นปีที่มีการใช้แผ่นเมมเบรนที่ก้นแผ่นเป็นครั้งแรกในการทำการทดสอบเหล่านี้^{[ 1 ]}

1. การเคลือบแอนติบอดี : ในเทคนิค ELISpot Assay จะมีการเติมและล้างสารต่างๆ ออกจากหลุมทดสอบ หลุมทดสอบจะอยู่บนแผ่นทดสอบในห้องปฏิบัติการ โดยมีช่องเล็กๆ สำหรับเติมสารที่ต้องการตรวจสอบ จำนวนหลุมทดสอบบนแผ่นทดสอบจะแตกต่างกันไป แต่โดยทั่วไปจะมีตั้งแต่ 16-100 หลุม สารแรกที่เติมลงในหลุมทดสอบคือแอนติบอดีโมโนโคลนอลที่จำเพาะต่อไซโตไคน์ แอนติบอดีเหล่านี้จะเคลือบผนังของหลุมทดสอบเพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการจับกับไซโตไคน์ในอนาคตแอนติบอดีโมโนโคลนอลหมายความว่าแอนติบอดีนั้นผลิตจากเซลล์ต้นกำเนิดเพียงเซลล์เดียว และสามารถจับกับอีพิโทปของโปรตีนได้เพียงตำแหน่งเดียวเท่านั้นในทาง กลับกัน แอนติบอดี โพลีโคลนอลสามารถจับกับอีพิโทปหลายตำแหน่งของโปรตีนเดียวกันได้
2. การบ่มเซลล์ : เซลล์ที่ต้องการสังเกตและวิเคราะห์จะถูกใส่ลงในหลุมเพาะเลี้ยง แต่ละหลุมอาจมีหรือไม่มีสิ่งกระตุ้นที่กระตุ้นการหลั่งไซโตไคน์ในเซลล์ ระหว่างการบ่มเซลล์ เซลล์จะทำปฏิกิริยากับสิ่งกระตุ้นที่มีอยู่และหลั่งไซโตไคน์ มีขั้นตอนและวิธีการมากมายที่ต้องปฏิบัติตามเพื่อให้มั่นใจได้ว่าการจัดการเซลล์เป็นไปอย่างถูกต้อง เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีคุณภาพสูง เซลล์ในตัวอย่างเลือดควรได้รับการเขย่าเบา ๆ หากเก็บไว้นานกว่า 3 ชั่วโมง ตัวอย่างเลือดควรเจือจางด้วย PBS (สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต ) ก่อนเก็บรักษา และตัวอย่างเลือดไม่ควรมีแกรนูโลไซต์เซลล์ใด ๆ ที่ถูกแช่แข็งและละลายแล้วควรปล่อยให้พักอย่างน้อยหนึ่งชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส (อุณหภูมิปกติของร่างกายมนุษย์) ^{[ 2 ]}นอกจากนี้ยังมีหลายสิ่งที่ควรพิจารณาเมื่อทำการบ่มเซลล์ เช่น การตรวจสอบให้แน่ใจว่าเซลล์ไม่ได้รับการเคลื่อนไหวอย่างกะทันหันซึ่งอาจส่งผลต่อการก่อตัวของจุด หรือความชื้นในตู้บ่มสูงพอที่จะหลีกเลี่ยงการระเหยมากเกินไปและทำให้หลุมแห้ง ^{[ 3 ]}
3. การดักจับไซโตไคน์ : เนื่องจากเซลล์ถูกล้อมรอบด้วยแอนติบอดีโมโนโคลนอลที่จำเพาะต่อไซโตไคน์ซึ่งเคลือบอยู่บนผนังของหลุมเพาะเลี้ยง ไซโตไคน์ที่ถูกหลั่งออกมาจากเซลล์ที่นำมาเพาะเลี้ยงจะเริ่มเกาะติดกับแอนติบอดีที่ตำแหน่งเฉพาะเจาะจง
4. แอนติบอดีตรวจจับ : ในขั้นตอนนี้ ต้องล้างหลุมทดลองเพื่อกำจัดเซลล์และสารที่ไม่พึงประสงค์อื่นๆ ออกไป สิ่งที่ควรเหลืออยู่คือแอนติบอดีโมโนโคลนอลที่จำเพาะต่อไซโตไคน์และไซโตไคน์ที่จับกับแอนติบอดีเหล่านั้น จากนั้นจึงเติมแอนติบอดีตรวจจับที่ จำเพาะต่อไซโตไคน์ซึ่งติดไบโอตินลงในหลุมทดลอง แอนติบอดีตรวจจับที่จำเพาะต่อไซโตไคน์เหล่านี้จะจับกับไซโตไคน์ที่เหลืออยู่ในหลุมทดลอง เนื่องจากไซโตไคน์ยังคงเกาะติดอยู่กับแอนติบอดีชุดแรกที่ใช้ เนื่องจากไซโตไคน์เกาะติดอยู่กับแอนติบอดีชุดแรกที่เคลือบหลุมทดลอง ไซโตไคน์จึงไม่ถูกล้างออกไปเมื่อล้างหลุมทดลอง
5. สเตรปตาไวดีน-เอนไซม์คอนจูเกต : สเตรปตาไวดีน-เอนไซม์คอนจูเกตจะถูกเติมลงในหลุมเพื่อจับกับแอนติบอดีตรวจจับ จุดประสงค์ของการไบโอติไนเลชันแอนติบอดีตรวจจับเฉพาะไซโตไคน์ที่เติมลงในหลุมในขั้นตอนก่อนหน้านี้ก็เพื่อให้แอนติบอดีสามารถจับกับสเตรปตาไวดีน-เอนไซม์คอนจูเกตใหม่ได้ การไบโอติไนเลชันโดยพื้นฐานแล้วจะสร้างความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่างไบโอตินบนแอนติบอดีเฉพาะไซโตไคน์และสเตรปตาไวดีนบนคอนจูเกต ^{[ 4 ]}
6. การเติมสารตั้งต้น : เติมสารตั้งต้นลงในหลุม และเอนไซม์คอนจูเกตที่เติมในขั้นตอนก่อนหน้าจะทำปฏิกิริยากับสารตั้งต้นนี้ ปฏิกิริยานี้จะก่อให้เกิดตะกอนที่ไม่ละลายน้ำและเกิดเป็นจุดในหลุม สารตั้งต้นที่คุณใช้ในขั้นตอนนี้จะขึ้นอยู่กับชนิดของเอนไซม์ที่ใช้ในขั้นตอนก่อนหน้า หากใช้สเตรปตาไวดีน-ALP (สเตรปตาไวดีนและอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสคอนจูเกต) การใช้ BCIP/NBT-plus (ส่วนผสมของ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate และ nitroblue tetrazolium chloride) ^{[ 5 ]}เป็นสารตั้งต้นจะทำให้เกิดจุดที่ชัดเจนกว่าและวิเคราะห์ได้ง่ายกว่า หากใช้สเตรปตาไวดีน-HRP (สเตรปตาไวดีนและฮอร์สแรดิชเพอร์ออกซิเดสคอนจูเกต) การใช้ TMB (tetramethylbenzidine) ^{[ 6 ]}เป็นสารตั้งต้นจะให้ผลลัพธ์ที่ดีกว่า ^{[ 7 ]}
7. การวิเคราะห์ : จุดที่เกิดขึ้นสามารถอ่านได้ด้วยเครื่องอ่าน ELISpot อัตโนมัติ หรือนับภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบผ่าตัด และนำไปใช้ในการคำนวณความถี่ของการหลั่งไซโตไคน์ต่อไป

การทดสอบ FluoroSpot คล้ายกับการทดสอบ ELISpot มาก ความแตกต่างหลักคือการทดสอบ FluoroSpot สามารถวิเคราะห์การมีอยู่ของสารวิเคราะห์หลายชนิดในแผ่นหลุมเดียว ในขณะที่การทดสอบ ELISpot สามารถวิเคราะห์สารวิเคราะห์ได้เพียงครั้งละหนึ่งชนิดเท่านั้น การทดสอบ FluoroSpot ทำได้โดยใช้การเรืองแสงแทนปฏิกิริยาเอนไซม์ในการตรวจจับ ขั้นตอนสำหรับการทดสอบ FluoroSpot ก็คล้ายกัน โดยมีความแตกต่างเล็กน้อย^{[ 8 ]}

1. การเคลือบแอนติบอดี : คล้ายกับ ELISpot แอนติบอดีจับโมโนโคลนอลที่จำเพาะต่อไซโตไคน์จะถูกเติมลงในเพลทที่มีหลุม สำหรับทั้งสองวิธีทดสอบ เพลทจะถูกบำบัดด้วยเอทานอลเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนและการเก็บข้อมูลที่ผิดเพี้ยน สำหรับการทดสอบ FluoroSpot แอนติบอดีจับชนิดต่างๆ จะถูกติดเข้ากับหลุมเพื่อตรวจจับสารวิเคราะห์หลายชนิด เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดจากการทดสอบ ELISpot และ FluoroSpot ควรปฏิบัติตามเทคนิคการเคลือบเพลทที่ถูกต้อง เพลทควรได้รับการบำบัดด้วยเอทานอล ล้าง และจากนั้นเคลือบด้วยแอนติบอดี วิธีการบำบัด ด้วยเอทานอลจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชนิดของเพลทที่ใช้ สำหรับเพลท MSIP และ IPFL คุณควรเติมเอทานอล 35% ปริมาณ 15 ไมโครลิตรลงในทุกหลุม ปล่อยให้เอทานอลอยู่ในหลุมเป็นเวลาหนึ่งนาที แล้วเทออก สำหรับเพลท MAIPSWU คุณควรเติมเอทานอล 70% ปริมาณ 50 ไมโครลิตรลงในทุกหลุมแทน ปล่อยให้เอทานอลอยู่ในหลุมเป็นเวลาสองนาที แล้วจึงเทออก หลังจากที่ได้ทำการบำบัดหลุมด้วยเอทานอลแล้ว คุณต้องล้างหลุมทั้งหมดด้วยน้ำปราศจากเชื้อ 200 ไมโครลิตร กระบวนการล้างนี้ควรทำซ้ำทั้งหมด 5 ครั้ง เมื่อหลุมได้รับการบำบัดด้วยเอทานอลและล้างแล้ว สามารถเติมแอนติบอดีจับโมโนโคลนอลเฉพาะไซโตไคน์ลงในแต่ละหลุมได้ ^{[ 9 ]}
2. การบ่มเซลล์ : นำเซลล์ใส่ลงในหลุมเพาะเลี้ยงและบ่มในสภาวะที่มีหรือไม่มีสิ่งกระตุ้นที่มีผลต่อการหลั่งโปรตีน
3. การจับไซโตไคน์ : โปรตีน/สารวิเคราะห์ที่ถูกหลั่งออกมาจากเซลล์ที่นำมาบ่มจะจับกับแอนติบอดีจับที่ติดอยู่กับหลุมในขั้นตอนแรก
4. แอนติบอดีตรวจจับ : คล้ายกับวิธี ELISpot เมื่อล้างหลุมเพื่อกำจัดเซลล์และสารอื่นๆ ที่เราไม่สนใจที่จะระบุหรือวัดแล้ว จะเติมแอนติบอดีตรวจจับที่ติดไบโอติน (ซึ่งมีความจำเพาะต่อสารวิเคราะห์ชนิดหนึ่งที่คุณต้องการวัดปริมาณ) จากนั้นจึงเติมแอนติบอดีตรวจจับที่ติดแท็กสำหรับสารวิเคราะห์ชนิดที่สองและสามที่กำลังศึกษา
5. คอนจูเกตที่ติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์ : แทนที่จะเติมคอนจูเกตสเตรปตาไวดีน-เอนไซม์ การตรวจจับสารวิเคราะห์หลายชนิดใน FluoroSpot จะถูกขยายให้มากขึ้นโดยใช้แอนติบอดีต่อต้านแท็กที่ติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์และคอนจูเกตสเตรปตาไวดีน-ฟลูออโรฟอร์ นอกจากนี้ยังมีการเติมสารละลายเพิ่มความเรือง แสงในขั้นตอนนี้เพื่อเพิ่มสัญญาณที่จะใช้ในการวิเคราะห์สีเรืองแสงในหลุมในภายหลัง ความเรืองแสงนี้เองที่ทำให้ FluoroSpot สามารถวิเคราะห์และเปรียบเทียบสารวิเคราะห์หลายชนิดได้ ซึ่งแตกต่างจาก ELISpot
6. การวิเคราะห์ : เนื่องจาก FluoroSpot อาศัยการใช้ฟลูออเรสเซนซ์และไม่ใช่ปฏิกิริยาเอนไซม์ จึงไม่จำเป็นต้องมีขั้นตอนที่เติมสารตั้งต้นเพื่อทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ (อย่างที่จำเป็นสำหรับ ELISpot) ขั้นตอนสุดท้ายสำหรับการทดสอบ FluoroSpot คือการวิเคราะห์ฟลูออโรฟอร์ภายใต้เครื่องอ่านฟลูออเรสเซนซ์อัตโนมัติที่มีตัวกรองแยกต่างหากสำหรับฟลูออโรฟอร์ต่างๆ ที่กำลังวิเคราะห์ ควรเลือกตัวกรองเหล่านี้สำหรับความยาวคลื่น เฉพาะ ของฟลูออโรฟอร์หากต้องการการวัดที่แม่นยำ ^{[ 8 ]}

เนื่องจากการทดสอบ FluoroSpot ระบุและวัดปริมาณของสารวิเคราะห์หลายชนิด จึงเป็นไปได้ที่การดูดซึมของสารวิเคราะห์หนึ่งชนิดจะส่งผลต่อการหลั่งของสารวิเคราะห์อีกชนิดหนึ่ง ซึ่งเรียกว่าผลกระทบจากการจับ^{[ 8 ]}ผลกระทบที่สารวิเคราะห์ชนิดหนึ่งมีต่อสารวิเคราะห์อีกชนิดหนึ่งอาจเป็นบวกหรือลบ (การผลิตสารวิเคราะห์ชนิดที่สองอาจเพิ่มขึ้นหรือลดลง) เพื่อต่อต้านผลกระทบจากการจับ สามารถใช้การกระตุ้นร่วมเพื่อหลีกเลี่ยงการผลิตสารวิเคราะห์ที่ลดลงได้^{[ 8 ]}ซึ่งก็คือการเพิ่มแอนติบอดีตัวที่สองที่กระตุ้นการผลิตสารวิเคราะห์ชนิดเดียวกันลงในหลุมทดสอบ

การทดสอบ ELISpot และ FluoroSpot สามารถนำไปใช้ในสาขาการวิจัยหลายสาขา ได้แก่ การพัฒนาวัคซีน^{[ 10 ]}มะเร็ง^{[ 11 ]} โรค ภูมิแพ้^{[ 12 ]}การจำแนกลักษณะของโมโนไซต์/มาโครฟาจ/เซลล์เดนดริติก การวิเคราะห์อะโพลิโปโปรตีน และการวิจัยทางสัตวแพทย์^{[อ้างอิง 10, 11 และ 12 จำเป็นต้องอัปเดต]}ด้วย ELISpot คุณสามารถศึกษาการตอบสนองของไซโตไคน์ที่จำเพาะต่อแอนติเจน เซลล์ที่หลั่งแอนติบอดีที่จำเพาะ^{[ 13 ]}แอนติเจนของเนื้องอก^{[ 11 ]} การปล่อย แกรนไซม์ Bและเพอร์ฟอรินโดยเซลล์ T ประสิทธิภาพของวัคซีน^{[ 14 ]}การทำแผนที่เอพิโทป^{[ 15 ]}กิจกรรมของเซลล์ T ที่เป็นพิษต่อเซลล์ การตรวจจับ IL-4, IL-5 และ IL-13 ^{[ 12 ]}การตอบสนองของแอนติบอดีที่เกิดจากวัคซีน เซลล์ B หน่วยความจำที่จำเพาะต่อแอนติเจน^{[ 10 ]}และอื่นๆ อีกมากมาย

โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การทดสอบ T-cell ELISpot ใช้เพื่อจำแนกกลุ่มย่อยของเซลล์ T เนื่องจากการทดสอบนี้สามารถตรวจจับการผลิตไซโตไคน์ IFN-γ, IL-2, TNF-alpha, IL-4, IL-5 และ IL-13 ได้ ไซโตไคน์สามตัวแรกผลิตโดยเซลล์ Th1 ในขณะที่สามตัวหลังผลิตโดยเซลล์ Th2 การวัดการตอบสนองของเซลล์ T ผ่านการผลิตไซโตไคน์ยังทำให้สามารถศึกษาประสิทธิภาพของวัคซีนได้อีกด้วย^{[ 16 ]}

ด้วย T-cell FluoroSpot คุณสามารถตรวจสอบลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกได้ นอกจากนี้ คุณยังสามารถวิเคราะห์การหลั่งของไซโตไคน์ IFN-γ และแกรนไซม์ B เพื่อประเมินการตอบสนองของเซลล์ T ที่เป็นพิษต่อเซลล์ ซึ่งทั้งสองอย่างนี้ใช้ในการวิจัยมะเร็ง^{[ 17 ]}

ด้วย B-cell FluoroSpot ประสิทธิภาพของวัคซีนยังสามารถสังเกตได้โดยการวัดปริมาณการหลั่งของ IgG, IgA และ IgM ก่อนและหลังการฉีดวัคซีน การวิเคราะห์อิมมูโนโกลบูลิน หลายชนิดนี้ เป็นไปได้เนื่องจากวิธีการเรืองแสงที่ใช้ใน FluoroSpot ^{[ 17 ]}