สเปกโทรสโกปีฟลูออเร สเซนซ์ (หรือที่รู้จักกันในชื่อฟลูออริเมตรีหรือสเปกโทรฟลูออโรเมตรี ) เป็น สเปกโทรสโกปีแม่เหล็กไฟฟ้าชนิดหนึ่งที่วิเคราะห์ ฟลูออเรส เซน ซ์ จากตัวอย่าง โดยใช้ลำแสง ซึ่งโดยทั่วไป คือ แสงอัลตราไวโอเลตเพื่อกระตุ้นอิเล็กตรอนในโมเลกุลของสารประกอบบางชนิดและทำให้เกิดการปล่อยแสงออกมา โดยทั่วไปจะเป็นแสงที่มองเห็น ได้ แต่ไม่จำเป็นเสมอไป เทคนิคเสริมคือสเปกโทรสโกปีการดูดกลืนแสง ในกรณีพิเศษของสเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ของโมเลกุลเดี่ยว จะวัดความผันผวนของความเข้มของแสงที่ปล่อยออกมาจากฟลูออโรฟอร์ เดี่ยว หรือฟลูออโรฟอร์คู่

อุปกรณ์ที่ใช้วัดการเรืองแสงเรียกว่าฟลูออโรมิเตอร์

โมเลกุลมีสถานะต่างๆ ที่เรียกว่าระดับพลังงานสเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์เกี่ยวข้องกับสถานะอิเล็กตรอนและสถานะการสั่นเป็นหลัก โดยทั่วไป สปีชีส์ที่กำลังตรวจสอบจะมีสถานะอิเล็กตรอนพื้นฐาน (สถานะพลังงานต่ำ) ที่น่าสนใจ และสถานะอิเล็กตรอนกระตุ้นที่มีพลังงานสูงกว่า ภายในแต่ละสถานะอิเล็กตรอนเหล่านี้จะมีสถานะการสั่นต่างๆ^{[ 1 ]}

ในการเรืองแสง โมเลกุลจะถูกกระตุ้นก่อนโดยการดูดซับโฟตอนจากสถานะอิเล็กตรอนพื้นฐานไปยังสถานะการสั่นสะเทือนต่างๆ ในสถานะอิเล็กตรอนที่ถูกกระตุ้น การชนกับโมเลกุลอื่นๆ ทำให้โมเลกุลที่ถูกกระตุ้นสูญเสียพลังงานการสั่นสะเทือนจนกระทั่งถึงสถานะการสั่นสะเทือนต่ำสุดของสถานะอิเล็กตรอนที่ถูกกระตุ้น กระบวนการนี้มักจะแสดงให้เห็นด้วยแผนภาพJablonski ^{[ 1 ]}

จากนั้นโมเลกุลจะลดระดับลงไปยังระดับการสั่นสะเทือนต่างๆ ของสถานะอิเล็กตรอนพื้นฐานอีกครั้ง โดยปล่อยโฟตอนออกมาในกระบวนการ^{[ 1 ]}เนื่องจากโมเลกุลอาจลดระดับลงไปยังระดับการสั่นสะเทือนต่างๆ ในสถานะพื้นฐานได้ โฟตอนที่ปล่อยออกมาจึงจะมีพลังงานและความถี่ที่แตกต่างกัน ดังนั้น การวิเคราะห์ความถี่ต่างๆ ของแสงที่ปล่อยออกมาในสเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนต์ พร้อมกับความเข้มสัมพัทธ์ของพวกมัน จะช่วยให้สามารถกำหนดโครงสร้างของระดับการสั่นสะเทือนต่างๆ ได้

สำหรับอะตอม กระบวนการจะคล้ายกัน อย่างไรก็ตาม เนื่องจากอะตอมไม่มีระดับพลังงานการสั่นสะเทือน โฟตอนที่ปล่อยออกมามักจะมีความยาวคลื่นเดียวกับรังสีที่ตกกระทบ กระบวนการปล่อยโฟตอนที่ถูกดูดซับอีกครั้งนี้เรียกว่า "การเรืองแสงแบบเรโซแนนซ์" และแม้ว่าจะเป็นลักษณะเฉพาะของการเรืองแสงของอะตอม แต่ก็พบเห็นได้ในการเรืองแสงของโมเลกุลเช่นกัน^{[ 2 ]}

ในการวัดการเรืองแสง (การปล่อยแสง) ทั่วไปความยาวคลื่นกระตุ้น (ความยาวคลื่นของแสงตกกระทบที่ใช้ในการกระตุ้นฟลูออโรฟอร์) จะคงที่ และความยาวคลื่นตรวจจับจะแปรผัน (ทำให้เกิดสเปกตรัมการปล่อยแสง ) ในขณะที่ในการวัดการกระตุ้นการเรืองแสง ความยาวคลื่นตรวจจับจะคงที่ และความยาวคลื่นกระตุ้นจะแปรผันไปทั่วบริเวณที่สนใจเพื่อสร้างสเปกตรัมการกระตุ้น เมทริกซ์การ กระตุ้น-การปล่อยแสงได้มาจากการบันทึกสเปกตรัมการปล่อยแสงที่เกิดจากช่วงความยาวคลื่นกระตุ้นต่างๆ และนำมารวมกัน^{[ 3 ] [ 4 ]}นี่คือชุดข้อมูลพื้นผิวสามมิติ: ความเข้มของการปล่อยแสงเป็นฟังก์ชันของความยาวคลื่นกระตุ้นและการปล่อยแสง และโดยทั่วไปจะแสดงเป็นแผนที่เส้นชั้นความสูง

โดยทั่วไปแล้ว เครื่องมือวัดฟลูออเรสเซนซ์มีสองประเภท ได้แก่ฟลูออโรมิเตอร์แบบใช้ฟิลเตอร์ ซึ่งใช้ฟิลเตอร์ในการแยก แสง ตกกระทบและแสง ฟลูออเร ส เซนซ์ และ สเปกโตรฟลูออโรมิเตอร์ซึ่งใช้ โมโน โครมาเตอร์แบบตะแกรงเลี้ยวเบน ในการแยกแสงตกกระทบและแสงฟลูออเรสเซนซ์

ทั้งสองประเภทใช้หลักการดังต่อไปนี้: แสงจากแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นจะผ่านตัวกรองหรือโมโนโครมาเตอร์ แล้วตกกระทบตัวอย่าง แสงส่วนหนึ่งจะถูกดูดซับโดยตัวอย่าง และโมเลกุลบางส่วนในตัวอย่างจะเรืองแสง แสงเรืองแสงจะถูกปล่อยออกมาในทุกทิศทาง แสงเรืองแสงบางส่วนจะผ่านตัวกรองหรือโมโนโครมาเตอร์ตัวที่สองและไปถึงตัวตรวจจับ ซึ่งโดยปกติจะวางทำมุม 90° กับลำแสงตกกระทบเพื่อลดความเสี่ยงที่แสงที่ส่องผ่านหรือสะท้อนจะไปถึงตัวตรวจจับ

สามารถใช้แหล่งกำเนิดแสงหลายชนิดเป็นแหล่งกระตุ้นได้ เช่น เลเซอร์ LED และหลอดไฟโดยเฉพาะอย่างยิ่งหลอดไฟซีนอนและหลอดไฟไอปรอท  เลเซอร์จะปล่อยแสงที่มีความเข้มสูงเฉพาะในช่วงความยาวคลื่นที่แคบมาก โดยทั่วไปต่ำกว่า 0.01 นาโนเมตร ซึ่งทำให้ไม่จำเป็นต้องใช้โมโนโครมาเตอร์หรือตัวกรองสำหรับการกระตุ้น ข้อเสียของวิธีนี้คือไม่สามารถเปลี่ยนความยาวคลื่นของเลเซอร์ได้มากนัก หลอดไฟไอปรอทเป็นหลอดไฟแบบเส้นตรง หมายความว่ามันปล่อยแสงใกล้ความยาวคลื่นสูงสุด ในทางตรงกันข้าม หลอดไฟซีนอนมีสเปกตรัมการปล่อยแสงต่อเนื่องที่มีความเข้มเกือบคงที่ในช่วง 300-800  นาโนเมตร และมีความเข้มเพียงพอสำหรับการวัดที่ความยาวคลื่นต่ำกว่า 200  นาโนเมตร เล็กน้อย

อาจใช้ตัวกรองและ/หรือโมโนโครมาเตอร์ในเครื่องวัดฟลูออริเมตรี โมโนโครมาเตอร์จะส่งผ่านแสงที่มีความยาวคลื่นปรับได้พร้อมค่าความคลาดเคลื่อนที่ปรับได้ โมโนโครมาเตอร์ชนิดที่พบมากที่สุดใช้ตะแกรงเลี้ยวเบน กล่าวคือแสงขนานจะส่องผ่านตะแกรงและออกมาในมุมที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับความยาวคลื่น จากนั้นสามารถปรับโมโนโครมาเตอร์เพื่อเลือกความยาวคลื่นที่จะส่งผ่านได้ สำหรับการวัดค่าแอนไอโซโทรปี จำเป็นต้องเพิ่มตัวกรองโพลาไรเซชันสองตัว: ตัวหนึ่งหลังโมโนโครมาเตอร์หรือตัวกรองสำหรับการกระตุ้น และอีกตัวหนึ่งก่อนโมโนโครมาเตอร์หรือตัวกรองสำหรับการปล่อยแสง

ดังที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ การวัดการเรืองแสงมักจะทำที่มุม 90° เมื่อเทียบกับแสงกระตุ้น รูปทรงเรขาคณิตนี้ใช้แทนการวางเซนเซอร์ไว้ที่แนวแสงกระตุ้นที่มุม 180° เพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนของแสงกระตุ้นที่ส่งผ่าน ไม่มีโมโนโครมาเตอร์ใดที่สมบูรณ์แบบ และมันจะส่งผ่านแสงที่กระจัดกระจาย บางส่วน นั่นคือแสงที่มีความยาวคลื่นอื่นนอกเหนือจากที่ต้องการ โมโนโครมาเตอร์ในอุดมคติจะส่งผ่านเฉพาะแสงในช่วงที่กำหนดและมีการส่งผ่านที่ไม่ขึ้นกับความยาวคลื่นสูง เมื่อวัดที่มุม 90° เฉพาะแสงที่กระเจิงโดยตัวอย่างเท่านั้นที่ทำให้เกิดแสงกระจัดกระจาย ส่งผลให้มีอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่ดีขึ้น และลดขีดจำกัดการตรวจจับลงประมาณ 10,000 เท่า^{[ 5 ]}เมื่อเทียบกับรูปทรงเรขาคณิต 180° นอกจากนี้ การเรืองแสงยังสามารถวัดได้จากด้านหน้า ซึ่งมักทำสำหรับตัวอย่างที่ขุ่นหรือทึบแสง^{[ 6 ]}

ตัวตรวจจับอาจเป็นแบบช่องสัญญาณเดียวหรือหลายช่องสัญญาณก็ได้ ตัวตรวจจับแบบช่องสัญญาณเดียวสามารถตรวจจับความเข้มของความยาวคลื่นได้ครั้งละหนึ่งความยาวคลื่นเท่านั้น ในขณะที่ตัวตรวจจับแบบหลายช่องสัญญาณสามารถตรวจจับความเข้มของความยาวคลื่นทั้งหมดพร้อมกัน ทำให้ไม่จำเป็นต้องใช้โมโนโครมาเตอร์หรือตัวกรองการปล่อยแสง

เครื่องวัดฟลูออเรสเซนซ์อเนกประสงค์ที่สุดที่มีโมโนโครมาเตอร์คู่และแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นแบบต่อเนื่องสามารถบันทึกได้ทั้งสเปกตรัมการกระตุ้นและสเปกตรัมฟลูออเรสเซนซ์ เมื่อวัดสเปกตรัมฟลูออเรสเซนซ์ ความยาวคลื่นของแสงกระตุ้นจะคงที่ โดยควรอยู่ที่ความยาวคลื่นที่มีการดูดกลืนสูง และโมโนโครมาเตอร์การปล่อยจะสแกนสเปกตรัม สำหรับการวัดสเปกตรัมการกระตุ้น ความยาวคลื่นที่ผ่านตัวกรองการปล่อยหรือโมโนโครมาเตอร์จะคงที่ และโมโนโครมาเตอร์การกระตุ้นจะสแกน สเปกตรัมการกระตุ้นโดยทั่วไปจะเหมือนกับสเปกตรัมการดูดกลืน เนื่องจากความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์เป็นสัดส่วนกับการดูดกลืน^{[ 7 ]}

โดยทั่วไปแล้ว ที่ความเข้มข้นต่ำความเข้มของการเรืองแสง จะแปรผันตรงกับความเข้มข้นของ สาร เรืองแสง

แตกต่างจากสเปกโทรสโกปี UV/visible ตรงที่การได้สเปกตรัม 'มาตรฐาน' ที่ไม่ขึ้นกับอุปกรณ์นั้นทำได้ยาก ปัจจัยหลายอย่างส่งผลกระทบและบิดเบือนสเปกตรัม และจำเป็นต้องมีการแก้ไขเพื่อให้ได้สเปกตรัม 'ที่แท้จริง' กล่าวคือ สเปกตรัมที่ไม่ขึ้นกับเครื่องมือ ประเภทของการบิดเบือนต่างๆ จะถูกจำแนกในที่นี้ว่าเกี่ยวข้องกับเครื่องมือหรือตัวอย่าง ก่อนอื่นจะกล่าวถึงการบิดเบือนที่เกิดจากเครื่องมือ เริ่มต้นจากความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงและลักษณะความยาวคลื่นที่เปลี่ยนแปลงไปตามเวลาในระหว่างการทดลองแต่ละครั้งและระหว่างการทดลองแต่ละครั้ง นอกจากนี้ ไม่มีหลอดไฟใดที่มีความเข้มคงที่ที่ทุกความยาวคลื่น เพื่อแก้ไขปัญหานี้ สามารถใช้ตัวแยกแสงหลังจากโมโนโครมาเตอร์หรือตัวกรองสำหรับการกระตุ้นเพื่อส่งแสงส่วนหนึ่งไปยังตัวตรวจจับอ้างอิง

นอกจากนี้ ต้องคำนึงถึงประสิทธิภาพการส่งผ่านของโมโนโครมาเตอร์และฟิลเตอร์ด้วย ซึ่งอาจเปลี่ยนแปลงไปตามเวลา ประสิทธิภาพการส่งผ่านของโมโนโครมาเตอร์ยังแปรผันตามความยาวคลื่นด้วย นี่คือเหตุผลที่ควรติดตั้งตัวตรวจจับอ้างอิงเพิ่มเติมไว้หลังโมโนโครมาเตอร์หรือฟิลเตอร์สำหรับการกระตุ้น เปอร์เซ็นต์ของฟลูออเรสเซนซ์ที่ตัวตรวจจับตรวจจับได้ก็ขึ้นอยู่กับระบบเช่นกัน ยิ่งไปกว่านั้น ประสิทธิภาพควอนตัมของตัวตรวจจับ นั่นคือเปอร์เซ็นต์ของโฟตอนที่ตรวจจับได้ จะแตกต่างกันไปในแต่ละตัวตรวจจับ ตามความยาวคลื่น และตามเวลา เนื่องจากตัวตรวจจับจะเสื่อมสภาพลงอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้

อีกสองประเด็นที่ต้องพิจารณา ได้แก่ เลนส์ที่ใช้ในการนำรังสี และวิธีการยึดหรือบรรจุวัสดุตัวอย่าง (เรียกว่าคิวเวตต์หรือเซลล์) สำหรับการวัดรังสี UV, แสงที่มองเห็นได้ และ NIR ส่วนใหญ่ จำเป็นต้องใช้คิวเวตต์ควอตซ์ที่มีความแม่นยำสูง ในทั้งสองกรณี สิ่งสำคัญคือต้องเลือกวัสดุที่มีการดูดซับในช่วงความยาวคลื่นที่สนใจค่อนข้างน้อย ควอตซ์เป็นวัสดุที่เหมาะสมที่สุด เนื่องจากสามารถส่งผ่านแสงได้ตั้งแต่ 200  นาโนเมตรถึง 2500  นาโนเมตร ควอตซ์เกรดสูงกว่าสามารถส่งผ่านแสงได้ถึง 3500  นาโนเมตร ในขณะที่คุณสมบัติการดูดซับของวัสดุอื่นๆ อาจบดบังการเรืองแสงจากตัวอย่างได้

การแก้ไขปัจจัยทางเครื่องมือทั้งหมดเหล่านี้เพื่อให้ได้สเปกตรัม 'มาตรฐาน' เป็นกระบวนการที่ยุ่งยาก ซึ่งจะนำมาใช้ในทางปฏิบัติเฉพาะเมื่อจำเป็นอย่างยิ่งเท่านั้น เช่น เมื่อวัดผลผลิตควอนตัม หรือเมื่อค้นหาความยาวคลื่นที่มีความเข้มของการปล่อยแสงสูงสุด เป็นต้น

ดังที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ การบิดเบือนเกิดขึ้นจากตัวอย่างเช่นกัน ดังนั้นจึงต้องคำนึงถึงบางแง่มุมของตัวอย่างด้วย ประการแรก การสลายตัวด้วยแสงอาจทำให้ความเข้มของการเรืองแสงลดลงเมื่อเวลาผ่านไป การกระเจิงของแสงก็ต้องนำมาพิจารณาด้วยเช่นกัน ประเภทของการกระเจิงที่สำคัญที่สุดในบริบทนี้คือการกระเจิงแบบเรย์ลีและการกระเจิงแบบรามาน แสงที่กระเจิงโดยการกระเจิงแบบเรย์ลีมีความยาวคลื่นเดียวกันกับแสงตกกระทบ ในขณะที่ในการกระเจิงแบบรามานแสงที่กระเจิงจะเปลี่ยนความยาวคลื่น โดยปกติจะเป็นความยาวคลื่นที่ยาวขึ้น การกระเจิงแบบรามานเป็นผลมาจากสถานะอิเล็กตรอนเสมือนที่เหนี่ยวนำโดยแสงกระตุ้น จากสถานะเสมือน นี้ โมเลกุลอาจผ่อนคลายกลับไปยังระดับการสั่นสะเทือนอื่นที่ไม่ใช่สถานะพื้นฐานของการสั่นสะเทือน^{[ 9 ]}ในสเปกตรัมการเรืองแสง จะเห็นได้เสมอที่ความแตกต่างของเลขคลื่นคงที่เมื่อเทียบกับเลขคลื่นกระตุ้น เช่น ยอดจะปรากฏที่เลขคลื่น 3600  cm ⁻¹ต่ำกว่าแสงกระตุ้นในน้ำ

แง่มุมอื่นๆ ที่ต้องพิจารณาคือเอฟเฟกต์ตัวกรองภายใน^{[ 10 ] [ 11 ]}ซึ่งรวมถึงการดูดซับซ้ำ การดูดซับซ้ำเกิดขึ้นเนื่องจากโมเลกุลอื่นหรือส่วนหนึ่งของโมเลกุลขนาดใหญ่ดูดซับที่ความยาวคลื่นที่ฟลูออโรฟอร์ปล่อยรังสี หากเป็นเช่นนั้น โฟตอนบางส่วนหรือทั้งหมดที่ปล่อยออกมาจากฟลูออโรฟอร์อาจถูกดูดซับอีกครั้ง เอฟเฟกต์ตัวกรองภายในอีกอย่างหนึ่งเกิดขึ้นเนื่องจากความเข้มข้นสูงของโมเลกุลที่ดูดซับ รวมถึงฟลูออโรฟอร์ ผลที่ได้คือความเข้มของแสงกระตุ้นไม่คงที่ตลอดทั้งสารละลาย ส่งผลให้มีเพียงเปอร์เซ็นต์เล็กน้อยของแสงกระตุ้นเท่านั้นที่ไปถึงฟลูออโรฟอร์ที่มองเห็นได้สำหรับระบบตรวจจับ เอฟเฟกต์ตัวกรองภายในเปลี่ยนสเปกตรัมและความเข้มของแสงที่ปล่อยออกมา ดังนั้นจึงต้องนำมาพิจารณาเมื่อวิเคราะห์สเปกตรัมการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนต์^{[ 7 ] [ 12 ]}

การเรืองแสงของโปรตีนที่พับตัวแล้วเป็นการผสมผสานของการเรืองแสงจากสารตกค้างอะโรมาติกแต่ละชนิด การปล่อยการเรืองแสงภายในส่วนใหญ่ของโปรตีนที่พับตัวแล้วเกิดจากการกระตุ้นของสารตกค้างทริปโตแฟน โดยมีการปล่อยบางส่วนเกิดจากไทโรซีนและฟีนิลอะลานีน แต่พันธะไดซัลไฟด์ก็มีการดูดซับที่สำคัญในช่วงความยาวคลื่นนี้เช่นกัน โดยทั่วไป ทริปโตแฟนมีความยาวคลื่นของการดูดซับสูงสุดที่ 280  นาโนเมตร และมีจุดสูงสุดของการปล่อยที่ขึ้นอยู่กับตัวทำละลายโดยมีช่วงตั้งแต่ประมาณ 300 ถึง 350  นาโนเมตร ขึ้นอยู่กับขั้วของสภาพแวดล้อมในบริเวณนั้น^{[ 13 ]} ดังนั้น การเรืองแสงของโปรตีนจึงอาจใช้เป็นเครื่องมือวินิจฉัยสถานะโครงสร้างของโปรตีนได้^{[ 14 ]} นอกจากนี้ การเรืองแสงของทริปโตแฟนยังได้รับอิทธิพลอย่างมากจากความใกล้เคียงของสารตกค้างอื่นๆ ( เช่น กลุ่ม โปรตอนที่อยู่ใกล้เคียงเช่น แอสปาร์ติกหรือกลูตาเมต สามารถทำให้ การเรืองแสงของทริปโตแฟน ลดลงได้ ) นอกจากนี้ การถ่ายโอนพลังงานระหว่างทริปโตเฟนและกรดอะมิโนเรืองแสงอื่นๆ ก็เป็นไปได้ ซึ่งจะส่งผลต่อการวิเคราะห์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่ใช้วิธีความเป็นกรดของฟอร์สเตอร์ ยิ่งไปกว่านั้น ทริปโตเฟนเป็นกรดอะมิโนที่ค่อนข้างหายาก โปรตีนหลายชนิดมีทริปโตเฟนเพียงหนึ่งหรือสองโมเลกุลเท่านั้น ดังนั้น การเรืองแสงของทริปโตเฟนจึงเป็นการวัดสถานะโครงสร้างของทริปโตเฟนแต่ละโมเลกุลได้อย่างไวมาก ข้อดีเมื่อเทียบกับโพรบภายนอกคือ โปรตีนเองจะไม่เปลี่ยนแปลง การใช้การเรืองแสงภายในเพื่อศึกษาโครงสร้างของโปรตีนในทางปฏิบัติจำกัดเฉพาะกรณีที่มีทริปโตเฟนเพียงไม่กี่โมเลกุล (หรืออาจมีเพียงหนึ่งโมเลกุล) เนื่องจากแต่ละโมเลกุลมีสภาพแวดล้อมเฉพาะที่แตกต่างกัน ซึ่งทำให้เกิดสเปกตรัมการปล่อยแสงที่แตกต่างกัน

ทริปโตแฟนเป็นกรดอะมิโนเรืองแสงภายในที่สำคัญ ซึ่งสามารถใช้ในการประเมินลักษณะของสภาพแวดล้อมจุลภาคของทริปโตแฟนได้ เมื่อทำการทดลองกับสารทำให้เสียสภาพ สารลดแรงตึงผิวหรือโมเลกุลแอมฟิฟิลิกอื่นๆสภาพแวดล้อมจุลภาคของทริปโตแฟนอาจเปลี่ยนแปลงไป ตัวอย่างเช่น หากโปรตีนที่มีทริปโตแฟนเพียงตัวเดียวในแกน 'ไฮโดรโฟบิก' ถูกทำให้เสียสภาพด้วยอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น สเปกตรัมการปล่อยแสงจะเลื่อนไปทางสีแดง นี่เป็นเพราะทริปโตแฟนสัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำ แทนที่จะอยู่ภายในโปรตีนที่เป็นไฮโดรโฟบิก ในทางตรงกันข้าม การเติมสารลดแรงตึงผิวลงในโปรตีนที่มีทริปโตแฟนซึ่งสัมผัสกับตัวทำละลายที่เป็นน้ำ จะทำให้เกิดสเปกตรัมการปล่อยแสงที่เลื่อนไปทางสีน้ำเงิน หากทริปโตแฟนฝังอยู่ในเวสิเคิลหรือไมเซลล์ของ สารลดแรงตึงผิว ^{[ 15 ]}โปรตีนที่ไม่มีทริปโตแฟนอาจถูกเชื่อมต่อกับฟลูออโรฟอร์

เมื่อกระตุ้นการเรืองแสงด้วยแสงที่ความยาวคลื่น 295 นาโนเมตร สเปกตรัมการปล่อยแสงของทริปโตเฟนจะเด่นกว่าการเรืองแสงของไทโรซีนและฟีนิลอะลานีน ซึ่งมีความแรงน้อยกว่า

โปรตีนเรืองแสงแบบเวลาจำเพาะ (TRFPs) เป็นโมเลกุลชีวภาพที่ได้มาจากโปรตีนเรืองแสงตามธรรมชาติ เช่นโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) จากAequorea victoriaโดย TRFPs จะเรืองแสงในช่วงเวลาจำกัด (1–10 นาโนวินาที) ซึ่งแปรผันตามปัจจัยแวดล้อม เช่นpHหรือปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุล TRFPs ซึ่งเริ่มใช้ในช่วงต้นทศวรรษ 2000 ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบวัดอายุการเรืองแสง (FLIM) โดยให้ความคมชัดที่เหนือกว่าวิธีการที่ใช้ความเข้มแสง ด้วยการลดการเรืองแสงอัตโนมัติและทำให้สามารถมัลติเพล็กซ์สัญญาณได้^{[ 16 ]}

TRFP ปล่อยแสงหลังจากได้รับการกระตุ้น โดยมีอายุการใช้งานที่วัดได้ผ่านการนับโฟตอนเดี่ยวที่สัมพันธ์กับเวลา ตัวแปรต่างๆ เช่น mTFP1 (สีเขียวอมฟ้า, ~2.6 ns) และ mScarlet-I (สีแดง, ~3.1 ns) มีผลผลิตควอนตัมสูงและความเสถียรต่อแสง ทำให้เหมาะสำหรับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิต TRFP ที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมจะรวมเข้ากับเซลล์ผ่านพลาสมิดทำให้สามารถติดตามเหตุการณ์ที่ไม่รุกรานของการพับโปรตีน การส่งสัญญาณไอออน หรือกิจกรรมของเอนไซม์ได้^{[ 16 ]}

TRFP ที่ได้รับการปรับแต่งด้วย AI มีอายุการใช้งานที่ยาวนานขึ้นและการปล่อยแสงที่สว่างขึ้น ซึ่งช่วยพัฒนากล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูง TRFP ถูกใช้ในสิ่งมีชีวิตต้นแบบ เช่นแมลงหวี่และปลาซีบราฟิชความท้าทาย ได้แก่ ความเสี่ยงของการซีดจางของแสง เครื่องมือ FLIM ที่ซับซ้อน และการทะลุทะลวงที่จำกัดในเนื้อเยื่อส่วนลึกเนื่องจากการกระเจิง ตัวแปรที่มีการเลื่อนไปทางสีแดงอาจช่วยแก้ไขปัญหานี้ได้^{[ 16 ]}

งานวิจัยอื่น ๆ พยายามจับคู่ TRFP กับCRISPRสำหรับการศึกษาเป้าหมายยีน^{[ 16 ]}

การบูรณาการเข้ากับการวินิจฉัยทางคลินิก เช่น การตรวจจับสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกจำเป็นต้องใช้ FLIM ที่คุ้มค่า การวิจัยที่กำลังดำเนินอยู่มีเป้าหมายเพื่อเพิ่มความสว่าง ลดความเป็นพิษ และขยายช่วงสเปกตรัม^{[ 16 ]}

ในปี 2025 นักวิจัยได้สร้าง TRFP ใหม่ 28 ชนิด โดยเพิ่มสีและช่วงเวลาซึ่งให้ตัวเลือกมากมายในการใช้เทคนิคนี้ พวกเขากลายพันธุ์กรดอะมิโนบางส่วนเพื่อลดความเสถียรของบริเวณที่สร้างสัญญาณเรืองแสง^{[ 17 ]}

สเปกโทรสโกปีแบบฟลูออเรสเซนซ์ถูกนำมาใช้ในงานวิจัยทางชีวเคมี การแพทย์ และเคมี เพื่อวิเคราะห์สารประกอบอินทรีย์นอกจากนี้ยังมีรายงานการนำไปใช้ในการแยกแยะเนื้องอกผิวหนังที่เป็นมะเร็งออกจากเนื้องอกที่ไม่เป็นมะเร็งอีกด้วย

เทคนิคสเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์อะตอม (AFS) มีประโยชน์ในการวิเคราะห์/วัดสารประกอบชนิดอื่นๆ ที่มีอยู่ในอากาศ น้ำ หรือสื่ออื่นๆ เช่นCVAFSซึ่งใช้ในการตรวจจับโลหะหนัก เช่น ปรอท

การเรืองแสงยังสามารถใช้ในการเปลี่ยนทิศทางของโฟตอนได้ ดังเช่นในตัวเก็บรวบรวมพลังงานแสงอาทิตย์แบบเรืองแสง

นอกจากนี้ สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ยังสามารถปรับใช้ในระดับจุลภาคได้โดยใช้ไมโครฟลูออริเมตรี

ในเคมีวิเคราะห์ เครื่องตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์จะใช้ร่วมกับHPLC

ในด้านการวิจัยเกี่ยวกับน้ำ สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์สามารถใช้ในการตรวจสอบคุณภาพน้ำโดยการตรวจจับสารมลพิษอินทรีย์^{[ 18 ]}ความก้าวหน้าล่าสุดในด้านวิทยาศาสตร์คอมพิวเตอร์และการเรียนรู้ของเครื่องยังทำให้สามารถตรวจจับการปนเปื้อนของแบคทีเรียในน้ำได้อีกด้วย^{[ 19 ]}

ในการวิจัยทางการแพทย์ชีวภาพ สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ใช้เพื่อประเมินประสิทธิภาพของการกระจายยาผ่านการเชื่อมโยงของสารเรืองแสงกับยาต่างๆ^{[ 20 ]}

สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ในการวิจัยทางชีวฟิสิกส์ช่วยให้บุคคลสามารถมองเห็นและระบุลักษณะของโดเมนไขมันภายในเยื่อหุ้มเซลล์ได้^{[ 21 ]}

TFRP ถูกนำมาใช้ในเทคนิคการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ของฟอร์สเตอร์ (FRET) เพื่อศึกษาความใกล้ชิดของโมเลกุลและติดตามการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมในโรคต่างๆ รวมถึงมะเร็งหรือโรค ความ เสื่อมของระบบประสาท

• โพรบแลนทานอยด์
• การเรืองแสง
• การเรืองแสงที่เกิดจากเลเซอร์

• Fluorophores.orgฐานข้อมูลของสีย้อมเรืองแสง
• OpenFluorเครื่องมือชุมชนที่สนับสนุน การวิเคราะห์ ทางเคมีเชิงสถิติของฟลูออเรสเซนซ์ของสารอินทรีย์
• ฐานข้อมูลแร่เรืองแสง พร้อมรูปภาพ สารกระตุ้น และสเปกตรัม (fluomin.org)