การเรียกยีน
ในสาขาจีโนมิกส์ GeneCalling เป็นเทคนิคการสร้างโปรไฟล์การถอดรหัสmRNAแบบเปิดแพลตฟอร์ม[ 1 ]โปรโตคอล GeneCalling วัดระดับcDNAซึ่งมีความสัมพันธ์กับ ระดับ การแสดงออกของยีนของ ทราน สคริปต์ เฉพาะ ความแตกต่างระหว่างการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อที่แข็งแรงและเนื้อเยื่อที่ตอบสนองต่อโรคหรือยาจะถูกตรวจสอบและเปรียบเทียบในเทคโนโลยีนี้[ 2 ]เทคนิคนี้ถูกนำไปใช้ในการศึกษาเนื้อเยื่อของมนุษย์[ 3 ]และเนื้อเยื่อพืช[ 4 ]
วิธี
ในโปรโตคอล GeneCalling นั้น mRNA จะถูกแยกออกจากตัวอย่างที่กำหนดก่อน แล้วจึงนำไปประมวลผลเป็นชิ้นส่วนเพื่อการวิเคราะห์ โดยปกติแล้วขั้นตอนนี้จะเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์และการแบ่งย่อยcDNA สองสาย จากRNA โพลีเอจากนั้นจึงใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะชุดต่างๆ เพื่อย่อย cDNA ที่แบ่งแล้วเป็นชุดๆ และชิ้นส่วนที่ได้จะถูกเชื่อมต่อกับอะแดปเตอร์ที่มีฉลากเพื่อขยายจำนวนโดยPCR ผลิตภัณฑ์PCRจะถูกทำให้บริสุทธิ์และนำไปทำการแยกด้วยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสบนแท่นที่ติดตั้งไว้ โดยใช้การกระตุ้นด้วยเลเซอร์แบบคงที่และระบบการถ่ายภาพอุปกรณ์ประจุไฟฟ้า แบบหลายสี [ 5 ] ฉลากเรืองแสงที่ปลาย 5' ของไพรเมอร์ PCR ตัวใดตัวหนึ่งช่วยให้สามารถมองเห็นชิ้นส่วน PCR ได้ และ cDNA จะถูกนำไปย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะที่แยกและเหมือนกันหลายๆ ครั้ง เพื่อสร้างโปรไฟล์ที่รวมกันโดยพิจารณาจากความสูงของยอดและความแปรปรวน[ 6 ] จากนั้นโปรไฟล์การย่อยที่รวมกันจากการเตรียม cDNA จะถูกนำมาเปรียบเทียบเพื่อระบุตำแหน่งของชิ้นส่วนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (เช่น ระหว่างเนื้อเยื่อปกติและเนื้อเยื่อที่เป็นโรคหรือตอบสนองต่อยา) โปรไฟล์เหล่านี้จะถูกเปรียบเทียบโดยใช้ฐานข้อมูลต่างๆ ที่พร้อมใช้งานบนอินเทอร์เน็ต เช่น GeneScape [ 7 ]