RNA นำทาง

RNA นำทาง (gRNA) หรือ RNA นำทางเดี่ยว (sgRNA) คือลำดับRNA สั้นๆ ที่นำทาง โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ CRISPRไปยังลำดับกรดนิวคลีอิก เป้าหมายโดย การจับคู่เบสแบบวัตสัน-คริก [ ^{1 ] [ 2 ] ใน}แบคทีเรียและอาร์เคีย gRNA เป็นส่วนหนึ่งของ ระบบ CRISPR -Cas ซึ่งทำหน้าที่เป็นระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวที่ปกป้องสิ่งมีชีวิตจากไวรัส ในที่นี้ gRNA สั้นๆ ทำหน้าที่เป็นตัวตรวจจับ DNA แปลกปลอมและชี้นำเอนไซม์ Cas ที่ย่อยสลายกรดนิวคลีอิกแปลกปลอม^{[ 1 ] [ 3 ]}

RNA นำทาง (gRNA) ถูกค้นพบในปี 1990 โดย B. Blum, N. Bakalara และ L. Simpson ผ่านวิธีการไฮบริดไดเซชันแบบนอร์เทิร์นบลอตในดีเอ็นเอแม็กซิเซอร์เคิลของไมโทคอนเดรียในปรสิตยูคาริโอต Leishmania tarentolae งานวิจัยต่อมาในช่วงกลางทศวรรษ 2000 และปีต่อๆ มาได้สำรวจโครงสร้างและหน้าที่ของ gRNA และระบบ CRISPR-Cas ความก้าวหน้าครั้งสำคัญเกิดขึ้นในปี 2012 เมื่อมีการค้นพบว่า gRNA สามารถนำทางเอนโดนิวคลีเอ ส Cas9 เพื่อทำการตัดดีเอ็นเอแบบสองสายในตำแหน่งที่จำเพาะเจาะจง การค้นพบนี้ส่งผลให้Jennifer DoudnaและEmmanuelle Charpentier ได้รับ รางวัลโนเบลสาขาเคมี ประจำปี 2020 จากผลงานการพัฒนาเทคโนโลยีการแก้ไขยีน CRISPR-Cas9

โปรติสต์ Trypanosomatidและkinetoplastids อื่นๆ มีกระบวนการดัดแปลง RNA หลังการถอดรหัสที่เรียกว่า "การแก้ไข RNA" ซึ่งทำการ แทรก/ลบ ยูริดีนภายในไมโทคอนเดรีย [ ^{4 ​​] [ 5 ] DNA}ของไมโทคอนเดรียนี้เป็นวงกลมและแบ่งออกเป็นแม็กซิเซอร์เคิลและมินิเซอร์เคิล ไมโทคอนเดรียหนึ่ง อันประกอบด้วยแม็กซิ เซอร์เคิล ประมาณ 50 อัน ซึ่งมีทั้งบริเวณที่เข้ารหัสและไม่เข้ารหัส และประกอบด้วยเบสประมาณ 20 กิโลเบส (kb) บริเวณที่เข้ารหัสมีการอนุรักษ์สูง (16-17 kb) และบริเวณที่ไม่เข้ารหัสจะแตกต่างกันไปตามสายพันธุ์ มินิเซอร์เคิลมีขนาดเล็ก (ประมาณ 1 kb) แต่มีจำนวนมากกว่าแม็กซิเซอร์เคิล ไมโทคอนเดรียหนึ่งอันประกอบด้วยมินิเซอร์เคิลหลายพันอัน^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}แม็กซิเซอร์เคิลสามารถเข้ารหัส " คริปโตยีน " และ gRNA บางส่วนได้ ในขณะที่มินิเซอร์เคิลสามารถเข้ารหัส gRNA ส่วนใหญ่ได้ ยีน gRNA บางตัวแสดงตำแหน่งการแทรกและการลบที่เหมือนกัน แม้ว่าจะมีลำดับที่แตกต่างกัน ในขณะที่ลำดับ gRNA อื่นๆ ไม่เสริมกับ mRNA ที่ได้รับการแก้ไขก่อน โมเลกุล Maxicircles และ minicircles เรียงต่อกันเป็นเครือข่าย DNA ขนาดใหญ่ภายในไมโทคอนเดรีย^{[ 9 ] [ 8 ] [ 10 ]}

ทรานสคริปต์แม็กซิเซอร์เคิลส่วนใหญ่ไม่สามารถแปลเป็นโปรตีนได้เนื่องจากการเลื่อนเฟรมในลำดับของพวกมัน การเลื่อนเฟรมเหล่านี้จะได้รับการแก้ไขหลังการถอดรหัสผ่านการแทรกและการลบสารตกค้างยูริดีนที่ตำแหน่งที่แม่นยำ ซึ่งจะสร้างกรอบการอ่านแบบเปิดกรอบการอ่านแบบเปิดนี้จะถูกแปลเป็นโปรตีนที่มีความคล้ายคลึงกับโปรตีนไมโทคอนเดรียที่พบในเซลล์อื่นๆ^{[ 11 ]}กระบวนการแทรกและการลบยูริดีนนั้นเกิดขึ้นโดยอาศัย RNA นำทางสั้นๆ (gRNA) ซึ่งเข้ารหัสข้อมูลการแก้ไขผ่านลำดับที่เสริมกัน และอนุญาตให้มีการจับคู่เบสระหว่างกัวนีนและยูราซิล (GU) เช่นเดียวกับระหว่างกัวนีนและไซโตซีน (GC) ซึ่งอำนวยความสะดวกในกระบวนการแก้ไข^{[ 12 ]}

RNA นำทางส่วนใหญ่ถูกถอดรหัสจากบริเวณระหว่างยีนของดีเอ็นเอแม็กซิเซอร์เคิลและมีลำดับที่เสริมกับ mRNA ปลาย 3' ของ gRNA มีหางโอลิโก 'U' (ความยาว 5-24 นิวคลีโอไทด์) ซึ่งอยู่ในบริเวณที่ไม่ได้รับการเข้ารหัส แต่มีปฏิสัมพันธ์และสร้างคอมเพล็กซ์ที่เสถียรกับบริเวณที่อุดมไปด้วย A และ G ของ mRNA และ gRNA ที่ได้รับการแก้ไขก่อน ซึ่งมีเสถียรภาพทางอุณหพลศาสตร์โดยตัวยึด 5' และ 3' ^{[ 13 ]}ไฮบริดเริ่มต้นนี้ช่วยในการจดจำตำแหน่ง mRNA เฉพาะที่จะได้รับการแก้ไข^{[ 14 ]}

โดยทั่วไป การแก้ไข RNA จะดำเนินไปจากปลาย 3' ไปยังปลาย 5' บน mRNA กระบวนการแก้ไขเริ่มต้นเมื่อ gRNA สร้างคู่ RNA กับลำดับ mRNA ที่เสริมกันซึ่งอยู่ถัดจากตำแหน่งการแก้ไข การจับคู่นี้จะดึงดูด คอมเพล็กซ์ ไรโบนิวคลีโอโปรตีน จำนวนหนึ่ง ซึ่งควบคุมการตัดเบสที่ไม่ตรงกันตัวแรกที่อยู่ติดกับจุดยึด gRNA-mRNA หลังจากนั้นยูริดิลิลทรานสเฟอเรสจะแทรก 'U' ที่ปลาย 3' และ RNA ไลเกสจะเชื่อมปลายทั้งสองที่ถูกตัดเข้าด้วยกัน กระบวนการนี้จะเกิดขึ้นซ้ำที่ตำแหน่งการแก้ไขต้นน้ำถัดไปในลักษณะเดียวกัน โดยปกติ gRNA ตัวเดียวจะเข้ารหัสข้อมูลสำหรับตำแหน่งการแก้ไขหลายตำแหน่ง (บล็อกการแก้ไข) ซึ่งการแก้ไขจะสร้างคู่ gRNA/mRNA ที่สมบูรณ์ กระบวนการแก้ไขตามลำดับนี้เรียกว่าแบบจำลองเอนไซม์แบบเรียงลำดับ^{[ 14 ] [ 12 ] [ 15 ]}

ในกรณีของ mRNA ที่ "แก้ไขแบบแพน" ^{[ 16 ]}คู่เกลียวจะคลายตัวออก และ gRNA อีกตัวจะสร้างคู่เกลียวกับลำดับ mRNA ที่แก้ไขแล้ว ซึ่งเป็นการเริ่มต้นการแก้ไขอีกรอบ gRNA ที่ทับซ้อนกันเหล่านี้จะสร้าง "โดเมน" การแก้ไข ยีนบางตัวมีโดเมนการแก้ไขหลายโดเมน^{[ 17 ]}ขอบเขตของการแก้ไขสำหรับยีนใดๆ จะแตกต่างกันไปในแต่ละสายพันธุ์ของไทรพาโนโซมาทิด ความแปรผันประกอบด้วยการสูญเสียการแก้ไขที่ด้าน 3' ซึ่งอาจเกิดจากการสูญเสียคลาสลำดับมินิเซอร์เคิลที่เข้ารหัส gRNA เฉพาะ มีการเสนอแบบจำลอง การย้อนกลับ^{[ 18 ]}เพื่ออธิบายการสูญเสียการแก้ไขบางส่วน และในบางกรณี การสูญเสียการแก้ไขทั้งหมดผ่านวิวัฒนาการ แม้ว่าการสูญเสียการแก้ไขมักจะเป็นอันตรายถึงชีวิต แต่ก็มีการสังเกตการสูญเสียดังกล่าวในสายพันธุ์ห้องปฏิบัติการเก่า การคงอยู่ของการแก้ไขตลอดประวัติศาสตร์วิวัฒนาการอันยาวนานของโปรติสต์โบราณเหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงความได้เปรียบในการคัดเลือก ซึ่งลักษณะที่แท้จริงยังคงไม่แน่นอน^{[ 16 ]}

ยังไม่ชัดเจนว่าเหตุใด trypanosomatids จึงใช้กลไกที่ซับซ้อนเช่นนี้ในการสร้าง mRNA อาจมีต้นกำเนิดมาจากไมโตคอนเดรียในยุคแรกของบรรพบุรุษของสายพันธุ์โปรติสต์ kintoplastid เนื่องจากมีอยู่ในbodonidsซึ่งเป็นบรรพบุรุษของ trypanosomatids ^{[ 19 ]}และอาจไม่มีอยู่ในeuglenoidsซึ่งแยกสาขามาจากบรรพบุรุษร่วมกันกับ kinetoplastids

ในโปรโตซัวLeishmania tarentolaeยีนไมโทคอนเดรีย 12 จาก 18 ยีนได้รับการแก้ไขโดยใช้กระบวนการนี้ หนึ่งในยีนเหล่านั้นคือ Cyb โดย mRNA จะได้รับการแก้ไขสองครั้งติดต่อกัน สำหรับการแก้ไขครั้งแรก ลำดับที่เกี่ยวข้องบน mRNA มีดังนี้:

mRNA 5' AAAGAAAAGGCUUUAACUCAGGUUGU 3' 

ปลาย 3' ใช้สำหรับยึด gRNA (ในกรณีนี้คือ gCyb-I gRNA) โดยการจับคู่เบส (มีการใช้คู่ G/U บางคู่) ปลาย 5' ไม่ตรงกันอย่างสมบูรณ์ และเอนโดนิวคลีเอส เฉพาะ 3 ชนิด จะตัด mRNA ที่ตำแหน่งที่ไม่ตรงกัน

จีอาร์เอ็นเอ 3' อร๊ายยยยย 5' mRNA 5' AA AGAAA AGGC UUUAACUCAGGUUGU 3' 

ขณะนี้ mRNA ได้รับการ "ซ่อมแซม" โดยการเพิ่ม U เข้าไปในแต่ละตำแหน่งการแก้ไขตามลำดับ ทำให้ได้ลำดับดังต่อไปนี้:

จีอาร์เอ็นเอ 3' อร๊ายยยยย 5' เอ็มอาร์เอ็นเอ 5' 

ยีนนี้มีไซต์การแก้ไข gRNA ที่ทับซ้อนกันสองไซต์ ปลาย 5' ของส่วนนี้คือจุดยึด 3' สำหรับ gRNA อีกตัวหนึ่ง (gCyb-II gRNA) ^{[ 9 ]}

โปรคาริโอต เช่น แบคทีเรียและอาร์เคีย ใช้CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) และเอนไซม์ Cas ที่เกี่ยวข้อง เป็นระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว เมื่อโปรคาริโอตติดเชื้อฟาจ และสามารถป้องกันการโจมตีได้ เอนไซม์ Cas เฉพาะจะตัด DNA (หรือ RNA) ของฟาจ และรวมชิ้นส่วนเหล่านั้นเข้ากับช่องว่างของลำดับ CRISPR ส่วนที่เก็บไว้เหล่านี้จะถูกจดจำในระหว่างการโจมตีของไวรัสในอนาคต ทำให้เอนไซม์ Cas สามารถใช้สำเนา RNA ของส่วนเหล่านี้ พร้อมกับลำดับ CRISPR ที่เกี่ยวข้อง เป็น gRNA เพื่อระบุและทำให้ลำดับแปลกปลอมเป็นกลาง^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

ไกด์อาร์เอ็นเอจะกำหนดเป้าหมายลำดับที่เสริมกันโดยการจับคู่เบสแบบวัตสัน-คริกอย่างง่าย^{[ 23 ]}ในระบบ CRISPR/cas ประเภท II sgRNA จะนำเอนไซม์ Cas ไปยังเป้าหมายบริเวณเฉพาะในจีโนมเพื่อการตัด DNA ที่กำหนดเป้าหมาย sgRNA เป็นการรวมกันของโมเลกุล RNA สองโมเลกุลที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม ได้แก่ CRISPR RNA ( crRNA ) และ trans-activating crRNA ( tracrRNA ) ส่วนประกอบ crRNA มีหน้าที่ในการจับกับบริเวณ DNA ที่กำหนดเป้าหมาย ในขณะที่ส่วนประกอบ tracrRNA มีหน้าที่ในการกระตุ้นกิจกรรมของเอนโดนิวคลีเอส Cas9 ส่วนประกอบทั้งสองนี้เชื่อมต่อกันด้วยโครงสร้าง tetraloop สั้นๆ ส่งผลให้เกิดการสร้าง sgRNA tracrRNA ประกอบด้วยคู่เบสที่สร้างโครงสร้าง stem-loop ทำให้สามารถยึดติดกับ เอนไซม์ เอนโดนิวคลีเอส ได้ การถอดรหัสของโลคัส CRISPR สร้าง crRNA ซึ่งมีบริเวณ spacer ที่ขนาบข้างด้วยลำดับซ้ำ โดยทั่วไปมีความยาว 18-20 คู่เบส (bp) crRNA นี้จะนำเอนโดนิวคลีเอส Cas9 ไปยังบริเวณเป้าหมายที่เสริมกันบน DNA ซึ่งจะตัด DNA ทำให้เกิดสิ่งที่เรียกว่าคอมเพล็กซ์เอฟเฟกต์ การดัดแปลงในลำดับ crRNA ภายใน sgRNA สามารถเปลี่ยนแปลงตำแหน่งการจับ ทำให้สามารถกำหนดเป้าหมายบริเวณ DNA ต่างๆ ได้อย่างแม่นยำ ทำให้เป็นระบบที่ตั้งโปรแกรมได้สำหรับการแก้ไขจีโนม^{[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]}

ความจำเพาะในการกำหนดเป้าหมายของ CRISPR-Cas9 ถูกกำหนดโดยลำดับนิวคลีโอไทด์ 20 ตัว (nt) ที่ปลาย 5' ของ gRNA ลำดับเป้าหมายที่ต้องการจะต้องอยู่ก่อนหน้า Protospacer Adjacent Motif (PAM) ซึ่งเป็นลำดับ DNA สั้นๆ ที่มีความยาวโดยทั่วไป 2-6 คู่เบส ซึ่งอยู่ถัดจากบริเวณ DNA ที่กำหนดเป้าหมายสำหรับการตัดโดยระบบ CRISPR เช่น CRISPR-Cas9 PAM จำเป็นสำหรับการตัดโดย Cas nuclease และโดยทั่วไปจะอยู่ห่างจากตำแหน่งตัดไปทางด้านล่าง 3-4 นิวคลีโอไทด์ เมื่อ gRNA จับคู่กับเป้าหมายแล้ว Cas9 จะทำให้เกิดการแตกของสายคู่ประมาณ 3 นิวคลีโอไทด์เหนือ PAM ^{[ 27 ] [ 28 ]}

ปริมาณ GC ที่เหมาะสมของลำดับไกด์ควรมากกว่า 50% ปริมาณ GC ที่สูงขึ้นจะช่วยเพิ่มความเสถียรของคู่ RNA-DNA และลดการเกิดไฮบริดิเซชันนอกเป้าหมาย ความยาวของลำดับไกด์โดยทั่วไปคือ 20 bp แต่ก็สามารถอยู่ในช่วง 17 ถึง 24 bp ได้เช่นกัน ลำดับที่ยาวขึ้นจะช่วยลดผลกระทบนอกเป้าหมาย ลำดับไกด์ที่สั้นกว่า 17 bp มีความเสี่ยงที่จะกำหนดเป้าหมายไปยังหลายตำแหน่ง^{[ 29 ] [ 30 ] [ 24 ]}

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 เป็นเทคนิคที่ใช้ในการแก้ไขยีนและการบำบัดด้วยยีน Cas เป็นเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอสที่ตัด DNA ในตำแหน่งเฉพาะที่ควบคุมโดย RNA นำทาง นี่เป็นเทคนิคที่จำเพาะต่อเป้าหมายซึ่งสามารถทำให้เกิดการกำจัดยีนหรือการเพิ่มยีนได้ ขึ้นอยู่กับกลไกการซ่อมแซมสายคู่ หลักฐานแสดงให้เห็นว่าทั้งในหลอดทดลองและในสิ่งมีชีวิต tracrRNA จำเป็นสำหรับ Cas9 ในการจับกับลำดับ DNA เป้าหมาย ระบบ CRISPR-Cas9 ประกอบด้วยสามขั้นตอนหลัก ขั้นตอนแรกเกี่ยวข้องกับการขยายฐานในบริเวณโลคัส CRISPR โดยการเพิ่มสเปเซอร์ DNA ต่างประเทศในลำดับจีโนม โปรตีนเช่น cas1 และ cas2 ช่วยในการค้นหาสเปเซอร์ใหม่ ขั้นตอนต่อไปเกี่ยวข้องกับการถอดรหัส CRISPR: pre-crRNA (precursor CRISPR RNA) ถูกสร้างขึ้นโดยการถอดรหัสของอาร์เรย์สเปเซอร์ซ้ำของ CRISPR เมื่อมีการปรับเปลี่ยนเพิ่มเติม pre-crRNA จะถูกแปลงเป็นบริเวณที่ล้อมรอบด้วยสเปเซอร์เดี่ยว ทำให้เกิด crRNA สั้นๆ กระบวนการเจริญเติบโตของ RNA คล้ายกันในประเภท I และ III แต่แตกต่างกันในประเภท II ขั้นตอนที่สามเกี่ยวข้องกับการจับของโปรตีน cas9 และชี้นำให้ตัดส่วนของ DNA โปรตีน Cas9 จับกับ crRNA และ tracrRNA ที่รวมกัน ทำให้เกิดคอมเพล็กซ์ตัวกระตุ้น ซึ่งทำหน้าที่เป็น RNA นำทางสำหรับโปรตีน cas9 เพื่อชี้นำกิจกรรมเอนโดนิวคลีเอส^{[ 31 ] [ 2 ] [ 3 ]}

วิธีการควบคุมยีนที่สำคัญวิธีหนึ่งคือการกลายพันธุ์ของ RNA ซึ่งสามารถนำมาใช้ผ่านการแก้ไข RNA โดยอาศัย gRNA ^{[ 32 ]}ไกด์ RNA จะแทนที่อะดีโนซีนด้วยอิโนซีนที่ตำแหน่งเป้าหมายเฉพาะ ปรับเปลี่ยนรหัสพันธุกรรม^{[ 33 ]}อะดีโนซีนดีอะมีเนสจะออกฤทธิ์ต่อ RNA ทำให้เกิดการดัดแปลงหลังการถอดรหัสโดยการเปลี่ยนแปลงโคดอนและหน้าที่ของโปรตีนต่างๆ ไกด์ RNA เป็น RNA นิวคลีโอลาร์ขนาดเล็กที่ร่วมกับไรโบโปรตีนทำการเปลี่ยนแปลง RNA ภายในเซลล์ เช่น การเติมหมู่ไรโบเมทิลใน rRNA และการนำซูโดอูริดีนเข้ามาในพรีไรโบโซมอล RNA ^{[ 34 ]}ไกด์ RNA จะจับกับลำดับ RNA แอนติเซนส์และควบคุมการดัดแปลง RNA มีการสังเกตว่า RNA รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) และไมโคร RNA (miRNA) มักถูกใช้เป็นลำดับ RNA เป้าหมาย และการดัดแปลงนั้นทำได้ง่ายกว่าเนื่องจากมีขนาดเล็ก^{[ 35 ]}

• การแก้ไขยีนด้วยระบบ CRISPR
• เครื่องมือ CRISPR/Cas
• ไซอาร์เอ็นเอ
• ยีนน็อคเอาท์
• ลวดลายที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์

• การแก้ไข RNA โดยการแทรกยูริดีนโดยใช้ไกด์ RNA ในหลอดทดลองhttp://www.jbc.org/content/272/7/4212.full
• Blum, Beat; Simpson, Larry (1990). "RNA นำทางในไมโตคอนเดรียคิเนโตพลาสติดมีหางโอลิโก(U) 3′ ที่ไม่ได้เข้ารหัสซึ่งเกี่ยวข้องกับการจดจำบริเวณที่แก้ไขล่วงหน้า" Cell . 62 (2): 391– 397. doi : 10.1016/0092-8674(90)90375-O . PMID  1695552 . S2CID  2181338 .
• Kurata, Morito; Wolf, Natalie K.; Lahr, Walker S.; Weg, Madison T.; Kluesner, Mitchell G.; Lee, Samantha; Hui, Kai; Shiraiwa, Masano; Webber, Beau R.; Moriarity, Branden S. (2018). "การดัดแปลงจีโนมแบบมัลติเพล็กซ์สูงโดยใช้อาร์เรย์ gRNA ของ CRISPR/Cas9" PLOS ONE . ​​13 (9) e0198714. Bibcode : 2018PLoSO..1398714K . doi : 10.1371/journal.pone.0198714 . PMC  6141065 . PMID  30222773 .
• Khan, Fehad J.; Yuen, Garmen; Luo, Ji (2019). "การกำจัดยีน CRISPR/Cas9 แบบมัลติเพล็กซ์ด้วยการถ่ายทอดร่วม crRNA:tracrRNA อย่างง่าย" . Cell & Bioscience . 9 41. doi : 10.1186/s13578-019-0304-0 . PMC  6528186 . PMID  31139343 .
• นิชิมาสุ, ฮิโรชิ; นูเรกิ, โอซามุ (2017). "โครงสร้างและกลไกของนิวคลีเอสเอฟเฟคเตอร์ที่ควบคุมด้วย RNA ของ CRISPR" Current Opinion in Structural Biology . 43 : 68–78 . doi : 10.1016/j.sbi.2016.11.013 . PMID  27912110 .
• ฉุย, กัวฮุ่ย; หม่า ฮันฮุย; หยาน, จี้ฟาง; เฉินหมิง; หงหนานฟาง; ซู่, ตงหยู; โจวจิ; จู้, เฉินหยู่; เฉิน เคอ; ด้วน, บิน; กู่เฟิง; คู เซิง; หวง เต๋อซวง; เว่ยเจีย; หลิว ฉี (2018) "DeepCRISPR: การออกแบบ RNA แนวทาง CRISPR ที่ปรับให้เหมาะสมโดยการเรียนรู้เชิงลึก " ชีววิทยาจีโนม . 19 (1): 80. ดอย : 10.1186/ s13059-018-1459-4 PMC  6020378 . PMID29945655  .​