การกำจัดยีน (หรือที่รู้จักกันในชื่อการลบยีนหรือการปิดใช้งานยีน ) เป็นเทคนิคทางวิศวกรรมพันธุกรรมที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ซึ่งเกี่ยวข้องกับ การกำจัดหรือปิดใช้งานยีนเฉพาะ เจาะจงภายในจีโนมของสิ่งมีชีวิต สามารถทำได้หลายวิธี รวมถึงการรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกัน (homologous recombination) , CRISPR -Cas9และTALENs

ข้อดีหลักประการหนึ่งของการตัดแต่งยีนคือ ช่วยให้นักวิจัยสามารถศึกษาการทำงานของยีนเฉพาะในสิ่งมีชีวิต และเข้าใจบทบาทของยีนในการพัฒนาและการทำงานทางสรีรวิทยาตามปกติ รวมถึงในพยาธิสภาพของโรคต่างๆ โดยการศึกษาลักษณะภายนอกของสิ่งมีชีวิตที่มีการตัดแต่งยีน นักวิจัยสามารถเข้าใจกระบวนการทางชีววิทยาที่ยีนนั้นเกี่ยวข้องได้

การปิดใช้งานยีนมีสองประเภทหลัก ได้แก่ การปิดใช้งานแบบสมบูรณ์และการปิดใช้งานแบบมีเงื่อนไข การปิดใช้งานยีนแบบสมบูรณ์จะทำให้ยีนนั้นไม่ทำงานอย่างถาวร ในขณะที่การปิดใช้งานยีนแบบมีเงื่อนไขจะอนุญาตให้เปิดและปิดยีนได้ในเวลาที่กำหนดหรือในเนื้อเยื่อเฉพาะ การปิดใช้งานยีนแบบมีเงื่อนไขมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับกระบวนการพัฒนาการและเพื่อทำความเข้าใจบทบาทของยีนในเซลล์หรือเนื้อเยื่อเฉพาะประเภท

การตัดแต่งยีน (Gene knockout) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด รวมถึงแบคทีเรียยีสต์ปลาซีบราฟิชแมลงหวี่และหนูในหนู การตัดแต่งยีนมักใช้เพื่อศึกษาหน้าที่ของยีนเฉพาะในกระบวนการพัฒนา สรีรวิทยา และการวิจัยโรคมะเร็ง

การใช้เทคนิคการตัดต่อยีนในหนูทดลองมีคุณค่าอย่างยิ่งในการศึกษาโรคในมนุษย์ ตัวอย่างเช่น การตัดต่อยีนในหนูทดลองถูกนำมาใช้เพื่อศึกษาบทบาทของยีนเฉพาะในโรคมะเร็ง โรคทางระบบประสาท โรคภูมิคุ้มกันบกพร่อง และโรคเมตาบอลิซึม

อย่างไรก็ตาม การตัดยีนก็มีข้อจำกัดอยู่บ้าง ตัวอย่างเช่น การสูญเสียยีนเพียงตัวเดียวอาจไม่สามารถเลียนแบบผลกระทบของความผิดปกติทางพันธุกรรมได้อย่างสมบูรณ์ และการตัดยีนอาจส่งผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ต่อยีนหรือวิถีการทำงานอื่นๆ นอกจากนี้ การตัดยีนก็ไม่ใช่แบบจำลองที่ดีสำหรับโรคในมนุษย์เสมอไป เนื่องจากจีโนมของหนูไม่เหมือนกับจีโนมของมนุษย์ และสรีรวิทยาของหนูก็แตกต่างจากสรีรวิทยาของมนุษย์

เทคนิค KO นั้นโดยพื้นฐานแล้วตรงกันข้ามกับเทคนิคการแทรกยีนการกำจัดยีนสองตัวพร้อมกันในสิ่งมีชีวิตเรียกว่าการกำจัดยีนคู่ ( DKO ) ในทำนองเดียวกัน คำว่าการกำจัดยีนสามตัว ( TKO ) และการกำจัดยีนสี่ตัว ( QKO ) ใช้เพื่ออธิบายการกำจัดยีนสามหรือสี่ตัวตามลำดับ อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องแยกแยะความแตกต่างระหว่างการกำจัดยีนแบบเฮเทอโรไซกัสและแบบโฮโมไซกัส ในกรณีแรก ยีนเพียงหนึ่งในสองสำเนา ( อัลลีล ) เท่านั้นที่ถูกกำจัด ในกรณีหลัง ยีนทั้งสองสำเนาถูกกำจัด

การกำจัดยีนเกิดขึ้นได้ด้วยเทคนิคที่หลากหลาย เดิมที มีการระบุ การกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติจากนั้นจึงต้องสร้างการสูญเสียยีนหรือการปิดใช้งานยีนโดยใช้การจัดลำดับดีเอ็นเอหรือวิธีการอื่น ๆ^{[ 1 ]}

การกำจัดยีนโดยการกลายพันธุ์มักทำในแบคทีเรีย ตัวอย่างแรกของการใช้เทคนิคนี้ในEscherichia coliได้รับการตีพิมพ์ในปี 1989 โดย Hamilton และคณะ^{[ 2 ]}ในการทดลองนี้ มีการใช้การรวมตัวใหม่สองครั้งตามลำดับเพื่อลบยีน งานนี้สร้างความเป็นไปได้ในการกำจัดหรือแทนที่ยีนที่มีฟังก์ชันในแบคทีเรีย วิธีการดังกล่าวได้รับการพัฒนาสำหรับสิ่งมีชีวิตอื่นๆ โดยเฉพาะสัตว์ทดลอง เช่น หนู หนูที่ถูกกำจัดยีนมักใช้ในการศึกษายีนที่เทียบเท่ากับมนุษย์ซึ่งอาจมีความสำคัญต่อโรค ตัวอย่างของการศึกษาโดยใช้หนูที่ถูกกำจัดยีนคือการตรวจสอบบทบาทของ โปรตีน Xirpในกลุ่มอาการเสียชีวิตกะทันหันโดยไม่ทราบสาเหตุ (SUNDS) และกลุ่มอาการ Brugada ในประชากรชาวจีนฮั่น^{[ 3 ]}

สำหรับการตรวจสอบการน็อคเอาท์ยีนการแทรกแซง RNA (RNAi) ซึ่งเป็นวิธีการใหม่กว่า หรือที่รู้จักกันในชื่อการปิดกั้นยีน ได้รับความนิยมมากขึ้น ในการแทรกแซง RNA (RNAi) นั้น RNA สื่อสารสำหรับยีนเฉพาะจะถูกทำให้ไม่ทำงานโดยใช้ RNA รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) หรือ RNA แฮร์พินสั้น (shRNA) ซึ่งจะหยุดการแสดงออกของยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ ยีนมะเร็ง เช่นbcl-2และp53รวมถึงยีนที่เชื่อมโยงกับโรคทางระบบประสาท ความผิดปกติทางพันธุกรรม และการติดเชื้อไวรัส ล้วนถูกกำหนดเป้าหมายสำหรับการปิดกั้นยีนโดยใช้การแทรกแซง RNA (RNAi) ^{[ 4 ]}

การรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกัน (Homologous recombination) คือการแลกเปลี่ยนยีนระหว่างสายดีเอ็นเอสองสาย ซึ่งรวมถึงบริเวณลำดับเบสที่เหมือนกันเป็นบริเวณกว้าง ในสิ่งมีชีวิตยูคาริโอต แบคทีเรีย และไวรัสบางชนิด การรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกันเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ และเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในวิศวกรรมพันธุกรรม การรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกัน ซึ่งเกิดขึ้นระหว่างการแบ่งเซลล์แบบไมโอซิสในสิ่งมีชีวิตยูคาริโอต มีความสำคัญต่อการซ่อมแซมดีเอ็นเอสายคู่ที่แตกหัก และส่งเสริมความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยอนุญาตให้ข้อมูลทางพันธุกรรมเคลื่อนย้ายได้ระหว่างการไขว้กันของโครโมโซม การรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกัน ซึ่งเป็นกลไกการซ่อมแซมดีเอ็นเอที่สำคัญในแบคทีเรีย ช่วยให้สามารถแทรกสารพันธุกรรมที่ได้มาจากการถ่ายโอนยีนในแนวนอนและการเปลี่ยนแปลงเข้าไปในดีเอ็นเอได้ การรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกันในไวรัสมีอิทธิพลต่อวิวัฒนาการของไวรัส การรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกัน ซึ่งเป็นวิธีการกำหนดเป้าหมายยีนชนิดหนึ่งที่ใช้ในวิศวกรรมพันธุกรรม เกี่ยวข้องกับการนำการกลายพันธุ์ที่ได้รับการออกแบบเข้าไปในยีนเฉพาะ เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับหน้าที่ของยีนนั้น วิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการแทรกดีเอ็นเอจากภายนอกเข้าไปในเซลล์ โดยมีลำดับเบสคล้ายกับยีนเป้าหมาย และมีลำดับเบสที่เหมือนกันทั้งด้านต้นน้ำและด้านท้ายของยีนเป้าหมาย ดีเอ็นเอของยีนเป้าหมายจะถูกแทนที่ด้วยลำดับเบสของดีเอ็นเอจากภายนอกในระหว่างการจำลองแบบ เมื่อเซลล์ตรวจพบว่าบริเวณข้างเคียงที่คล้ายคลึงกันนั้นเป็นโฮโมล็อก ยีนเป้าหมายจะถูก "ปิดการทำงาน" โดยการแลกเปลี่ยนนี้ การใช้เทคนิคนี้ในการกำหนดเป้าหมายอัลลีลเฉพาะในเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนของหนู ทำให้สามารถสร้างหนูที่มียีนถูกปิดการทำงานได้ ด้วยความช่วยเหลือของการกำหนดเป้าหมายยีน ยีนจำนวนมากในหนูถูกปิดการทำงาน ทำให้เกิดแบบจำลองหนูที่แตกต่างกันหลายร้อยแบบของโรคต่างๆ ในมนุษย์ เช่น มะเร็ง เบาหวาน โรคหัวใจและหลอดเลือด และความผิดปกติทางระบบประสาท มาริโอ คาเปคคี เซอร์ มาร์ติน เจ. อีแวนส์ และโอลิเวอร์ สมิธตีส์ ได้ทำการวิจัยที่สำคัญเกี่ยวกับการรวมตัวกันของโฮโมล็อกในเซลล์ต้นกำเนิดของหนู และพวกเขาได้รับรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ประจำปี 2007 จากผลการค้นพบของพวกเขา^{[ 5 ]}ตามธรรมเนียมแล้วการรวมตัวกันของโฮโมโลกัสเป็นวิธีการหลักในการทำให้ยีนถูกน็อคเอาท์ วิธีนี้เกี่ยวข้องกับการสร้างโครงสร้าง DNAที่มีการกลายพันธุ์ที่ต้องการ สำหรับวัตถุประสงค์ในการน็อคเอาท์ โดยทั่วไปแล้วจะใช้เครื่องหมายต้านทานยาแทนที่ยีนที่ต้องการน็อคเอาท์^{[ 6 ]} โครงสร้างนี้จะต้องมีลำดับ โฮโมโลยีอย่างน้อย 2 กิโลเบสกับลำดับเป้าหมาย โครงสร้างนี้สามารถส่งไปยังเซลล์ต้นกำเนิด ได้ ทั้งโดยการฉีดไมโครหรือการใช้กระแสไฟฟ้าวิธีนี้จะอาศัยกลไกการซ่อมแซมของเซลล์เองในการรวมโครงสร้าง DNA เข้ากับ DNA ที่มีอยู่ ส่งผลให้ลำดับของยีนเปลี่ยนแปลงไป และในกรณีส่วนใหญ่ ยีนจะถูกแปลเป็นยีนที่ไม่ทำงานโปรตีนหากมีการแปล อย่างไรก็ตาม นี่เป็นกระบวนการที่ไม่มีประสิทธิภาพ เนื่องจากการรวมตัวแบบโฮโมโลกัสมีส่วนทำให้เกิดการรวมตัวของ DNA เพียง 10 ⁻²ถึง 10 ^{−3 เท่านั้น [ 6 ] [ 7 ]}บ่อยครั้งที่เครื่องหมายการคัดเลือกยาบนโครงสร้างถูกใช้เพื่อเลือกเซลล์ที่เกิดเหตุการณ์การรวมตัวขึ้น

เซลล์ต้นกำเนิดเหล่านี้ซึ่งขณะนี้ขาดจีนดังกล่าว สามารถนำมาใช้ในร่างกายได้ เช่น ในหนู โดยการใส่เข้าไปในตัวอ่อนระยะแรก หากหนูไคเมอริกที่ได้มีพันธุกรรมที่เปลี่ยนแปลงในเซลล์สืบพันธุ์ ก็สามารถส่งต่อพันธุกรรมนี้ไปยังลูกหลานได้^{[ 6 ]}

ใน สิ่งมีชีวิต แบบดิพลอยด์ซึ่งมีอัลลีล สองแบบ สำหรับยีนส่วนใหญ่ และอาจมีหลายยีนที่เกี่ยวข้องซึ่งทำงานร่วมกันในบทบาทเดียวกัน จะต้องมีการดำเนินการเปลี่ยนแปลงและคัดเลือกเพิ่มเติมจนกว่ายีนเป้าหมายทุกตัวจะถูกกำจัดออกไปการผสมพันธุ์แบบคัดเลือกอาจจำเป็นเพื่อให้ได้สัตว์ ที่มี อัลลีลทั้งสองข้างถูกกำจัดออกไป

ปัจจุบันมีวิธีการสามวิธีที่ใช้ซึ่งเกี่ยวข้องกับการกำหนดเป้าหมายลำดับ DNA อย่างแม่นยำเพื่อทำให้เกิดการแตกของสายคู่ เมื่อเกิดเหตุการณ์นี้ กลไกการซ่อมแซมของเซลล์จะพยายามซ่อมแซมการแตกของสายคู่นี้ โดยมักจะผ่านการเชื่อมต่อปลายที่ไม่เหมือนกัน (NHEJ) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเชื่อมต่อปลายที่ถูกตัดทั้งสองเข้าด้วยกันโดยตรง^{[ 7 ]}กระบวนการนี้อาจทำได้ไม่สมบูรณ์ ดังนั้นบางครั้งจึงทำให้เกิดการแทรกหรือการลบของคู่เบส ซึ่งทำให้เกิดการกลายพันธุ์แบบเฟรมชิฟต์การกลายพันธุ์เหล่านี้สามารถทำให้ยีนที่เกิดการกลายพันธุ์นั้นไม่ทำงาน จึงทำให้เกิดการน็อคเอาท์ของยีนนั้น กระบวนการนี้มีประสิทธิภาพมากกว่าการรวมตัวแบบโฮโมโลจัส และดังนั้นจึงสามารถใช้สร้างน็อคเอาท์แบบไบอัลลีลิกได้ง่ายกว่า^{[ 7 ]}

นิวคลีเอสแบบซิงค์ฟิงเกอร์ประกอบด้วยโดเมนจับกับ DNA ที่สามารถกำหนดเป้าหมายลำดับ DNA ได้อย่างแม่นยำ^{[ 7 ]}ซิงค์ฟิงเกอร์แต่ละตัวสามารถจดจำโคดอนของลำดับ DNA ที่ต้องการได้ ดังนั้นจึงสามารถประกอบเป็นโมดูลเพื่อจับกับลำดับเฉพาะได้^{[ 9 ]}โดเมนจับเหล่านี้เชื่อมโยงกับเอนโดนิวคลีเอสแบบจำกัดที่สามารถทำให้เกิดการแตกของสายคู่ (DSB) ใน DNA ได้^{[ 7 ]}กระบวนการซ่อมแซมอาจทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ทำลายการทำงานของยีน^{[ 10 ]}

นิวคลีเอสแบบเอฟเฟคเตอร์คล้ายตัวกระตุ้นการถอดรหัส ( TALENs ) ยังมีโดเมนการจับกับ DNA และนิวคลีเอสที่สามารถตัด DNA ได้^{[ 11 ]}บริเวณการจับกับ DNA ประกอบด้วยกรดอะมิโนที่ซ้ำกันซึ่งแต่ละส่วนจะจดจำคู่เบสเดี่ยวของลำดับ DNA เป้าหมายที่ต้องการ^{[ 9 ]}หากการตัดนี้มุ่งเป้าไปที่บริเวณการเข้ารหัสยีน และการซ่อมแซมโดย NHEJ ทำให้เกิดการแทรกและการลบ มักจะส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์แบบเฟรมชิฟต์ ซึ่งจะทำให้การทำงานของยีนหยุดชะงัก^{[ 11 ]}

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) เป็นเทคนิคทางวิศวกรรมพันธุกรรมที่ช่วยให้สามารถแก้ไขจีโนมได้อย่างแม่นยำ การประยุกต์ใช้ CRISPR อย่างหนึ่งคือการกำจัดยีน ซึ่งเกี่ยวข้องกับการปิดใช้งานหรือ "กำจัด" ยีนเฉพาะในสิ่งมีชีวิต^{[ 12 ]}

กระบวนการกำจัดยีนด้วย CRISPR ประกอบด้วยสามขั้นตอนหลัก ได้แก่ การออกแบบ RNA นำทาง (gRNA) ที่กำหนดเป้าหมายไปยังตำแหน่งเฉพาะในจีโนม การส่ง gRNA และเอนไซม์ Cas9 (ซึ่งทำหน้าที่เหมือนกรรไกรโมเลกุล) ไปยังเซลล์เป้าหมาย และการปล่อยให้เซลล์ซ่อมแซมส่วนที่ถูกตัดใน DNA เมื่อเซลล์ซ่อมแซมส่วนที่ถูกตัดแล้ว มันอาจจะเชื่อมปลายที่ถูกตัดเข้าด้วยกัน ทำให้ยีนไม่ทำงาน หรืออาจเกิดการกลายพันธุ์ที่ขัดขวางการทำงานของยีน

เทคนิคนี้สามารถใช้ได้กับสิ่งมีชีวิตหลากหลายชนิด รวมถึงแบคทีเรีย ยีสต์พืชและสัตว์และช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถศึกษาการทำงานของยีนเฉพาะโดยการสังเกตผลกระทบจากการขาดหายไปของยีนนั้น การตัดต่อยีนด้วย CRISPR เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการทำความเข้าใจพื้นฐานทางพันธุกรรมของโรคและการพัฒนายารักษาใหม่ ๆ

การกำจัดยีนโดยใช้ CRISPR เช่นเดียวกับเทคนิคทางวิศวกรรมพันธุกรรมอื่นๆ มีศักยภาพที่จะก่อให้เกิดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์หรือเป็นอันตรายต่อสิ่งมีชีวิต ดังนั้นจึงควรใช้ด้วยความระมัดระวัง^{[ 9 ] [ 13 ]} Cas9 ที่จับคู่กันจะทำให้เกิดการแตกของสายคู่ใน DNA ^{[ 9 ]}ตามหลักการเดียวกับนิ้วสังกะสีและ TALENs ความพยายามในการซ่อมแซมการแตกของสายคู่เหล่านี้มักส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์แบบเฟรมชิฟต์ซึ่งส่งผลให้ยีนไม่ทำงาน^{[ 9 ]}เทคโนโลยี CRISPR-Cas9 แบบไม่รุกรานประสบความสำเร็จในการกำจัดยีนที่เกี่ยวข้องกับภาวะซึมเศร้าและความวิตกกังวลในหนู ซึ่งเป็นการส่งมอบที่ประสบความสำเร็จครั้งแรกที่ผ่านอุปสรรคเลือด-สมองเพื่อเปิดใช้งานการดัดแปลงยีน^{[ 14 ]}

การแทรกยีน (Gene knock-in) คล้ายกับการกำจัดยีน (Gene knockout) แต่เป็นการแทนที่ยีนหนึ่งด้วยยีนอื่นแทนที่จะลบยีนนั้นออกไป

^{การน็อคเอาต์ยีนแบบมีเงื่อนไขช่วยให้สามารถลบยีนในเนื้อเยื่อ ได้}อย่างจำเพาะเจาะจง วิธีนี้จำเป็นต้องใช้แทนการน็อคเอาต์ยีนหากการกลายพันธุ์แบบไม่มีผลจะนำไปสู่การตายของตัวอ่อน [ ^{15 ]}หรือหากเนื้อเยื่อหรือเซลล์ชนิดใดชนิดหนึ่งมีความสำคัญเป็นพิเศษ วิธีนี้ทำได้โดยการแนะนำลำดับสั้นๆ ที่เรียกว่าไซต์ loxP รอบๆ ยีน ลำดับเหล่านี้จะถูกนำเข้าสู่เซลล์สืบพันธุ์โดยใช้กลไกเดียวกับการน็อคเอาต์ จากนั้นเซลล์สืบพันธุ์นี้สามารถนำไปผสมกับเซลล์สืบพันธุ์อื่นที่มีCre-recombinaseซึ่งเป็นเอนไซม์ของไวรัสที่สามารถจดจำลำดับเหล่านี้ ทำการรีคอมบิเนส และลบยีนที่อยู่ระหว่างไซต์เหล่านี้^{[ 16 ]}ต่อมาได้มีการสร้างและนำ recombinase อื่นๆ มาใช้ในการทดลองน็อคเอาต์แบบมีเงื่อนไข^{[ 17 ]}

การกำจัดยีนส่วนใหญ่ใช้เพื่อทำความเข้าใจบทบาทของยีนหรือบริเวณDNA ที่เฉพาะเจาะจงโดยการเปรียบเทียบ สิ่งมีชีวิต ที่ถูกกำจัดยีน กับสิ่งมีชีวิตปกติที่มีพื้นฐานทางพันธุกรรม ที่คล้ายคลึงกัน ^{[ 18 ]}

สิ่งมีชีวิตน็อคเอาท์ยังถูกใช้เป็น เครื่องมือ คัดกรองในการพัฒนายาเพื่อกำหนดเป้าหมายกระบวนการทางชีวภาพหรือข้อบกพร่อง ที่เฉพาะ เจาะจงโดยใช้น็อคเอาท์ที่เฉพาะเจาะจง หรือเพื่อทำความเข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ของยาโดยใช้คลังสิ่งมีชีวิตน็อคเอาท์ ที่ครอบคลุม จีโนมทั้งหมดเช่น ในSaccharomyces cerevisiae ^{[ 19 ]}

• ยีนที่จำเป็น
• การลดระดับยีน
• การกำจัดยีนแบบมีเงื่อนไข
• เซลล์สืบพันธุ์
• การปิดกั้นยีน
• การแก้ไขจีโนม
• การสูญพันธุ์ตามแผน
• รีคอมไบน์นิ่ง
• ไมโอสแตติน
• สีน้ำเงินเบลเยียม

• แผนภาพการทดแทนยีนเป้าหมาย
• ฐานข้อมูลการตัดต่อยีนของ Frontiers in Bioscience (มีให้ใช้งานเฉพาะในคลังข้อมูลเท่านั้น)
• กลุ่มความร่วมมือหนูทดลองน็อกเอาต์นานาชาติ
• คลังเก็บข้อมูล KOMP
• [1]
• [2]