การเข้าร่วมการแข่งขันชิงแชมป์โลกครั้งแรกของเขาคือการแข่งขันกีฬาทางน้ำชิงแชมป์โลกปี 2001ที่ฟุกุโอกะ ซึ่งเขาจบอันดับที่ 30 ในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 2 ] [ 3 ]}

เมื่อวันที่ 17 พฤศจิกายน เขาทำลายสถิติระยะสั้นของอเมริกาใต้ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 23.82 วินาที^{[ 4 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2002 (25 เมตร)ที่มอสโกนิโคลัสจบอันดับที่ 23 ในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 5 ]}และอันดับที่ 13 ในการแข่งขันผีเสื้อ 50 เมตร^{[ 6 ]}

เขาว่ายน้ำในการแข่งขันว่ายน้ำแพนแปซิฟิกปี 2002โดยจบอันดับที่ 9 ในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 7 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกที่บาร์เซโลนา ในปี 2003 นิโคลัสได้อันดับที่ 40 ในการแข่งขันว่ายน้ำผีเสื้อ 50 เมตร^{[ 8 ]}

เมื่อวันที่ 10 กันยายน พ.ศ. 2547 ซานโตสทำลายสถิติอเมริกาใต้ระยะสั้นของการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร ด้วยเวลา 21.32 วินาที ซึ่งเกือบจะทำลายสถิติโลกที่เฟรเดอริค บูสเกต์ เคยทำไว้ ที่ 21.10 วินาที^{[ 9 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2004 (25 เมตร)ที่อินเดียนาโพลิส นิโคลัส ซานโตส ได้เหรียญเงินในการแข่งขันฟรีสไตล์ 4 × 100 เมตร^{[ 10 ]}และเหรียญทองแดงในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 11 ]}เขายังเข้าร่วมการแข่งขันผีเสื้อ 50 เมตร ซึ่งเขาถูกตัดสิทธิ์^{[ 12 ]}และการแข่งขันฟรีสไตล์ 100 เมตร ซึ่งเขาเข้าถึงรอบชิงชนะเลิศและได้อันดับที่ 8 ^{[ 13 ]}

ในการแข่งขันกีฬามหาวิทยาลัยฤดูร้อนปี 2005นิโคลัสได้รับเหรียญทองแดงในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 50 เมตรและว่ายน้ำผีเสื้อ 50 เมตร^{[ 14 ]}

ซานโตสว่ายน้ำในการแข่งขันว่ายน้ำแพนแปซิฟิกปี 2006โดยจบอันดับที่ 10 ในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 15 ]}

ในการแข่งขันกีฬาแพนอเมริกันเกมส์ปี 2007ที่ริโอเดจาเนโรเขาได้เป็นแชมป์ในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 4 × 100 เมตร โดยทีมบราซิลทำสถิติแพนอเมริกันเกมส์ใหม่ด้วยเวลา 3:15.90 ^{[ 16 ]}และยังได้เหรียญเงินในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.18 วินาที^{[ 17 ]}

นิโคลัสเข้าร่วมการแข่งขันกีฬามหาวิทยาลัยฤดูร้อนปี 2007ซึ่งเขาได้รับเหรียญทองในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร และเหรียญเงินในการแข่งขันผีเสื้อ 50 เมตร^{[ 18 ]}เขาทำลายสถิติการแข่งขันในประเภทฟรีสไตล์ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.12 วินาที^{[ 19 ]}

นิโคลัสเข้าร่วมการแข่งขันกีฬาโอลิมปิกฤดูร้อนปี 2008ในประเภทฟรีสไตล์ 50 เมตร โดยเขาเข้าถึงรอบรองชนะเลิศและจบการแข่งขันในอันดับที่ 16 ^{[ 20 ]}

เมื่อวันที่ 10 พฤษภาคม พ.ศ. 2552 เขาทำลายสถิติอเมริกาใต้ในการว่ายน้ำฟรีสไตล์ 4 × 100 เมตร ด้วยเวลา 3:14.45 ร่วมกับนิโคลัส โอลิเวียราเซซาร์ ซิเอโลและเฟอร์นันโด ซิลวา^{[ 21 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกที่กรุงโรม ในปี 2009 เขาผ่านเข้ารอบชิงชนะเลิศในประเภทผีเสื้อ 50 เมตร โดยจบอันดับที่ 5 ^{[ 22 ]}เขายังเข้าถึงรอบรองชนะเลิศในประเภทฟรีสไตล์ 50 เมตร ด้วยเวลา 21.69 วินาที และจบอันดับที่ 10 ^{[ 23 ]}ในวันที่ 2 กันยายน 2009 ในการแข่งขันJosé Finkel Trophyเขาชนะด้วยเวลา 21.55 วินาที ซึ่งทำลายสถิติส่วนตัวของเขา^{[ 24 ]}

เมื่อวันที่ 4 กันยายน พ.ศ. 2552 เขาทำลายสถิติอเมริกาในการว่ายท่าผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.87 วินาที สถิตินี้ถูกทำลายโดยเซซาร์ ซิเอโลเพียงสามปีต่อมา ด้วยเวลา 22.76 วินาที^{[ 25 ] [ 26 ]}

เมื่อวันที่ 15 พฤศจิกายน 2009 ในสระว่ายน้ำขนาดเล็ก (25 เมตร) เขาทำสถิติว่ายน้ำฟรีสไตล์ 50 เมตรได้ในเวลา 20.90 วินาที และกลายเป็นชาวอเมริกาใต้คนแรกที่ว่ายระยะทางนี้ได้ต่ำกว่า 21 วินาที เขาครองสถิติร่วมกับเซซาร์ ซิเอโลในสถิติอเมริกาใต้ระยะสั้นของการว่ายน้ำฟรีสไตล์ 50 เมตร: 21.32 วินาที เขาทำสถิตินี้ไว้ในปี 2004 และซิเอโลทำไว้ในปี 2008 ^{[ 27 ]}

เขาเป็นแชมป์ของการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2009ที่สิงคโปร์ในเดือนพฤศจิกายนปี 2009 โดยเอาชนะแชมป์โอลิมปิกโรลันด์ โชแมนในรอบชิงชนะเลิศทั้งประเภทผีเสื้อ 50 เมตรและฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 28 ] [ 29 ]}ในการแข่งขันชิงแชมป์โลกครั้งนี้ เขาทำลายสถิติอเมริกาใต้ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรด้วยเวลา 22.17 วินาทีที่เบอร์ลินและ 22.16 วินาทีที่สิงคโปร์ และทำลายสถิติอเมริกาใต้ในประเภทฟรีสไตล์ 50 เมตรด้วยเวลา 20.74 วินาทีที่เบอร์ลิน^{[ 30 ]}

ในเดือนสิงหาคม พ.ศ. 2553 ในการแข่งขันว่ายน้ำแพนแปซิฟิก พ.ศ. 2553ที่เมืองเออร์ไวน์ รัฐแคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา นิโคลัสได้รับเหรียญเงินในการแข่งขันว่ายน้ำท่าผีเสื้อ 50 เมตร^{[ 31 ]}นอกจากนี้เขายังจบอันดับที่ 13 ในการแข่งขันว่ายน้ำท่าฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 32 ]}

ในเดือนธันวาคม พ.ศ. 2553 ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2553 (25 เมตร)ที่ดูไบ นิโคลัส ซานโตส พร้อมด้วยเซซาร์ ซิเอโล , มาร์เซโล เชียริกินีและนิโคลัส โอลิเวียรา คว้าเหรียญทองแดงในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 4 × 100 เมตร ด้วยเวลา 3:05.74 ซึ่งเป็นสถิติอเมริกาใต้ เอาชนะทีมอเมริกัน^{[ 33 ]}นิโคลัสยังได้อันดับที่ 13 ในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 34 ]}และอันดับที่ 4 ในการแข่งขันว่ายน้ำผีเสื้อ 50 เมตร^{[ 35 ]}

ในการแข่งขันกีฬาแพนอเมริกันเกมส์ปี 2011ที่เมืองกัวดาลาฮารานิโคลัสได้รับเหรียญทองในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 4 × 100 เมตร^{[ 36 ]}

ในเดือนเมษายน พ.ศ. 2555 เขาทำสถิติส่วนตัวที่ดีที่สุดในการว่ายท่าผีเสื้อ 50 เมตรได้ 22.79 วินาที^{[ 25 ]}

เขาเข้าร่วมการแข่งขันกีฬาโอลิมปิกฤดูร้อนปี 2012ที่ลอนดอนในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 4 × 100 เมตร โดยจบการแข่งขันในอันดับที่ 9 ^{[ 20 ]}

ในเดือนธันวาคม พ.ศ. 2555 ขณะอายุ 32 ปี นิโคลัส ซานโตส ได้เข้าร่วมการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2555 (25 เมตร)ที่อิสตันบูลและคว้าเหรียญทองในการแข่งขันว่ายน้ำท่าผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.22 วินาที ซึ่งทำลายสถิติของการแข่งขัน^{[ 37 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกปี 2013ที่บาร์เซโลนาซานโตสผ่านเข้ารอบ ชิงชนะเลิศ ว่ายน้ำผีเสื้อ 50 เมตรเป็นอันดับหนึ่งด้วยเวลา 22.81 วินาที^{[ 38 ]}ในรอบชิงชนะเลิศ เวลาของเขาแย่ลงเป็น 23.21 วินาที จบอันดับที่ 4 ^{[ 39 ] [ 40 ]}ในการแข่งขันว่ายน้ำผสม 4 × 100 เมตร เขาจบอันดับที่ 12 ร่วมกับเลโอนาร์โด เด เดอุสเฟลิเป้ ลิมาและมาร์เซโล เชียริกินี^{[ 41 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2013ที่ปักกิ่ง ประเทศจีน ซานโตสทำลายสถิติอเมริกาใต้ระยะสั้นในประเภทผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.13 วินาที^{[ 42 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำแพนแปซิฟิกประจำปี 2014ที่โกลด์โคสต์ รัฐควีนส์แลนด์ ประเทศออสเตรเลีย เขาได้อันดับที่ 8 ในการแข่งขันผีเสื้อ 100 เมตร และอันดับที่ 16 ในการแข่งขันฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 43 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2014 (25 เมตร)ที่โดฮาประเทศกาตาร์ซานโตสคว้าเหรียญทองสองเหรียญในวันเดียวกัน เมื่อวันที่ 4 ธันวาคม ในการแข่งขันว่ายน้ำผลัดผสม 4 × 50 เมตรชายซึ่งประกอบด้วย ซานโตส, เซซาร์ ซิเอโล , เฟลิเป้ ฟรังซา ซิลวาและกิลเฮอร์เม กุยโดซึ่งซิเอโลถือว่าเป็น "ทีมในฝัน" (ประกอบด้วยผู้ได้รับเหรียญรางวัลหรือแชมป์โลกในประเภทบุคคลของตนเท่านั้น) บราซิลคว้าเหรียญทองด้วยเวลา 1:30.51 ซึ่งทำลายสถิติโลก^{[ 44 ]}ในวันเดียวกันนั้น เขายังคว้าเหรียญทองในการแข่งขันว่ายน้ำผลัดผสม 4 × 50 เมตรร่วมกับเฟลิเป้ ฟรังซา ซิลวา , เอเตียน เมเดรอสและลาริสซา โอลิเวียราทำลายสถิติอเมริกาใต้ด้วยเวลา 1:37.26 ซึ่งห่างจากสถิติโลกของสหรัฐอเมริกา (1:37.17) เพียง 0.09 วินาที^{[ 45 ]}ซานโตสยังพยายามป้องกันตำแหน่งแชมป์ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรชายซึ่งได้มาในอิสตันบูล 2012 ในรอบชิงชนะเลิศ เขาต้องเผชิญหน้ากับแชด เลอ โคลส์นักว่ายน้ำผีเสื้อที่ดีที่สุดในโลกในขณะนั้น แชมป์โลกและแชมป์โอลิมปิก ซานโตสทำลายสถิติอเมริกาด้วยเวลา 22.08 วินาที แต่พลาดเหรียญทองให้กับนักว่ายน้ำชาวแอฟริกาใต้ ซึ่งทำลายสถิติการแข่งขันด้วยเวลา 21.95 วินาที^{[ 46 ]}ซานโตสยังลงแข่งขันว่ายน้ำผีเสื้อ 100 เมตรชายโดยจบอันดับที่ 14 ^{[ 47 ]}

ในการแข่งขันกีฬาแพนอเมริกันเกมส์ปี 2015ที่เมืองโทรอนโตรัฐออนแทรีโอ ประเทศแคนาดา ซานโตสจบอันดับที่ 10 ในการแข่งขันว่ายน้ำฟรีสไตล์ 50 เมตร^{[ 48 ] [ 49 ]}

ในการแข่งขันกีฬาทางน้ำชิงแชมป์โลกปี 2015ที่เมืองคาซานซานโตส วัย 35 ปี คว้าเหรียญรางวัลที่สำคัญที่สุดเหรียญหนึ่งในอาชีพของเขา นั่นคือเหรียญเงินในการแข่งขันว่ายน้ำท่าผีเสื้อ 50 เมตรชาย^{[ 50 ] [ 51 ] [ 52 ]}เขากลายเป็นนักกีฬาที่อายุมากที่สุดที่ได้รับเหรียญรางวัลในประวัติศาสตร์ของการแข่งขันชิงแชมป์โลก โดยมีอายุ 35 ปี 171 วัน ทำลายสถิติของมาร์ค วาร์เน็ค นักกีฬาเหรียญทองว่ายน้ำท่ากบ 50 เมตร ในการแข่งขันที่มอนทรีออล ปี 2005 ซึ่งขึ้นแท่นรับรางวัลเมื่ออายุ 35 ปี 162 วัน ^{[ 53 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2016 (25 เมตร)ที่วินด์เซอร์ รัฐออนแทรีโอประเทศแคนาดา เขาได้รับเหรียญเงินในการแข่งขันว่ายน้ำผลัดผสม 4 × 50 เมตรร่วมกับEtiene Medeiros , Larissa OliveiraและFelipe Lima [ ^{54 ] นอกจาก}นี้เขายังจบอันดับที่ 9 ในการแข่งขันว่ายน้ำผีเสื้อ 50 เมตรชาย^{[ 55 ]}และอันดับที่ 32 ในการ แข่งขันว่ายน้ำฟรี สไตล์50 เมตรชาย^{[ 56 ]}

เมื่ออายุ 37 ปี ในการแข่งขัน Maria Lenk Trophy ที่จัดขึ้นในเดือนพฤษภาคม 2017 เขาสามารถทำลายสถิติอเมริกาในการว่ายน้ำท่าผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.61 วินาที ซึ่งใกล้เคียงกับสถิติโลก 22.43 วินาที ที่ Rafa Muñoz ทำไว้ในยุคชุดว่ายน้ำสุดหรู^{[ 57 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกปี 2017ที่บูดาเปสต์ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรชายเขาได้รับเหรียญเงินอีกครั้งด้วยเวลา 22.79 วินาที ^{[ 58 ]}เขาทำลายสถิติของตัวเอง: นักกีฬาที่อายุมากที่สุดในประวัติศาสตร์ที่ได้รับเหรียญรางวัลในการแข่งขันชิงแชมป์โลก

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2018ที่บูดาเปสต์เขาทำลายสถิติโลกระยะสั้นในประเภทผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 21.75 วินาที ^{[ 59 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2018 (25 เมตร)ที่เมืองหางโจวประเทศจีน ซานโตสคว้าเหรียญทอง ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรชายด้วยเวลา 21.81 วินาที ซึ่งเป็นสถิติใหม่ของการแข่งขัน^{[ 60 ]}เขายังได้รับเหรียญทองแดงในประเภทผลัดผสม 4 × 50 เมตรชายร่วมกับกิลเฮอร์เม กุยโด , เฟลิเป ลิมาและเซซาร์ ซิเอโล [ ^{61 ] ใน}ประเภทผลัดผสม 4 × 100 เมตรชายเขาจบอันดับที่ 4 ^{[ 62 ]}และยังจบอันดับที่ 9 ในประเภทผลัดผสม 4 × 50 เมตรชาย^{[ 63 ]}

เมื่ออายุ 39 ปี ในการแข่งขันว่ายน้ำ FINA Champions Swim Series ที่จัดขึ้นในเดือนพฤษภาคม 2019 ที่บูดาเปสต์ เขาสามารถทำลายสถิติอเมริกาในประเภทผีเสื้อ 50 เมตร ด้วยเวลา 22.60 วินาที ซึ่งเป็นเวลาที่ดีที่สุดของปี^{[ 64 ]}

ซานโตสเข้าร่วมการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกปี 2019ที่เมืองกวางจูประเทศเกาหลีใต้ด้วยคำเชิญจาก FINA เนื่องจาก CBDA ซึ่งเป็นสมาพันธ์ว่ายน้ำของบราซิล เชิญเฉพาะนักว่ายน้ำที่จะเข้าร่วมการแข่งขันโอลิมปิกเท่านั้น ที่นั่นเขาได้รับเหรียญทองแดงในการแข่งขันว่ายน้ำผีเสื้อ 50 เมตรชายขณะอายุ 39 ปี ซึ่งเป็นการ "ปรับปรุง" สถิติของเขาในฐานะนักว่ายน้ำที่อายุมากที่สุดในโลกที่ได้รับเหรียญรางวัลจากการแข่งขันชิงแชมป์โลก^{[ 65 ] [ 66 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2021 (25 เมตร)ที่อาบูดาบีสหรัฐอาหรับเอมิเรตส์ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรชายซานโตสคว้าเหรียญทองด้วยเวลา 21.93 วินาที^{[ 67 ]}ด้วยวัยเกือบ 42 ปี เขาทำลายสถิติของตัวเองในฐานะนักว่ายน้ำที่อายุมากที่สุดที่เคยคว้าแชมป์โลก^{[ 68 ]}เขายังกลายเป็นชาวบราซิลคนที่สองที่ได้รับเหรียญรางวัลมากที่สุดในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกระยะสั้น รองจากเซซาร์ ซิเอโลเท่านั้น^{[ 69 ]}

ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลกปี 2022ที่บูดาเปสต์ ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรเขาได้รับเหรียญเงินเหรียญที่สามในการแข่งขันชิงแชมป์โลก และเป็นเหรียญที่สี่ติดต่อกันในวัย 42 ปี ด้วยเวลา 22.78 วินาที ซึ่งเป็นการทำลายสถิติของเขาในฐานะนักว่ายน้ำที่อายุมากที่สุดในประวัติศาสตร์ที่ได้รับเหรียญรางวัลในการแข่งขันชิงแชมป์โลก^{[ 70 ]}

เมื่อวันที่ 14 ธันวาคม 2022 ในการแข่งขันว่ายน้ำชิงแชมป์โลก FINA ปี 2022 (25 เมตร)ที่เมลเบิร์น ประเทศออสเตรเลีย ในประเภทผีเสื้อ 50 เมตรซานโตสคว้าแชมป์โลกสมัยที่ 4 ด้วยเวลา 21.78 วินาที ทำลายสถิติการแข่งขัน โดยช้ากว่าสถิติโลกของตัวเองที่ 21.75 วินาที เพียง 0.03 วินาที ด้วยอายุ 42 ปี 303 วัน เขาทำลายสถิติโลกกินเนสส์ ของตัวเองในฐานะนักว่ายน้ำที่อายุมากที่สุดที่คว้าแชมป์โลก และเป็นนักว่ายน้ำคนเดียวและคนแรกของโลกที่เป็นแชมป์โลก 4 สมัยในประเภทผีเสื้อ 50 เมตร หลังจากพิธี ^มอบเหรียญทอง เขาประกาศเลิกเล่นกีฬา^{[ 71 ] [ 72 ] [ 73 ] [ 74 ] [ 75 ]}