การกลายพันธุ์แบบอิ่มตัวของลำดับ ( SeSaM ) เป็น วิธี การกลายพันธุ์แบบสุ่ม ทางเคมีและ เอนไซม์ที่ใช้สำหรับการวิวัฒนาการแบบกำหนดทิศทางของโปรตีนและเอนไซม์เป็นหนึ่งในเทคนิคการกลายพันธุ์แบบอิ่มตัวที่ ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุด ในขั้นตอน ปฏิกิริยาPCRสี่ ขั้นตอน นิ วคลีโอไทด์ฟอสฟอโรไทโอเอตจะถูกแทรกเข้าไปใน ลำดับ ยีนถูกตัด และชิ้นส่วนที่ได้จะถูกต่อให้ยาวขึ้นด้วยนิวคลีโอไทด์สากลหรือนิวคลีโอไทด์ ที่เสื่อม สภาพ จากนั้นนิวคลีโอไทด์เหล่านี้จะถูกแทนที่ด้วยนิวคลีโอไทด์มาตรฐาน ทำให้เกิดการกระจายตัวของ การกลายพันธุ์ของ กรดนิวคลีอิก อย่างกว้างขวาง ทั่วลำดับยีน โดยมีแนวโน้มที่ จะเกิด การผันแปรและเน้นเป็นพิเศษที่การกลายพันธุ์แบบจุดต่อเนื่อง ซึ่งเป็นสิ่งที่ทำได้ยากด้วยเทคนิคการกลายพันธุ์อื่นๆ เทคนิคนี้ได้รับการพัฒนาโดยศาสตราจารย์Ulrich Schwanebergที่มหาวิทยาลัย Jacobs University Bremenและมหาวิทยาลัย RWTH Aachen

SeSaM ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อเอาชนะข้อจำกัดหลักหลายประการที่พบเมื่อทำงานกับวิธีการกลายพันธุ์มาตรฐานโดยอาศัยเทคนิค PCR ที่มีข้อผิดพลาดง่าย (epPCR) เทคนิค epPCR เหล่านี้อาศัยการใช้พอลิเมอเรสดังนั้นจึงมีข้อจำกัดซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากสถานการณ์ที่ทำการแทนที่กรดนิวคลีอิกเพียงครั้งเดียว แต่เกิดขึ้นได้ยากมาก และการแทนที่เหล่านี้มักเกิดขึ้นในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงและเป็นที่ต้องการเท่านั้น นอกจากนี้การเปลี่ยนตำแหน่งของกรดนิวคลีอิกมีโอกาสน้อยกว่าการเปลี่ยนตำแหน่งและต้องใช้พอลิเมอเรสที่ออกแบบมาโดยเฉพาะโดยมีการเปลี่ยนแปลงอคติ[ ^{1 ] ลักษณะ}เหล่านี้ของการแลกเปลี่ยนกรดนิวคลีอิกที่เร่งปฏิกิริยาโดย epPCR ร่วมกับข้อเท็จจริงที่ว่ารหัสพันธุกรรมเสื่อมสภาพทำให้ความหลากหลายที่เกิดขึ้นในระดับกรดอะมิโน ลดลง การแทนที่แบบเดียวกันนำไปสู่การรักษากรดอะมิโน หรือการกลายพันธุ์แบบอนุรักษ์ที่มีคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีที่คล้ายคลึงกัน เช่น ขนาดและความชอบน้ำเป็นสิ่งที่พบได้ทั่วไป^{[ 2 ] [ 3 ]}ด้วยการแนะนำเบสสากลแบบไม่จำเพาะเจาะจงในทุกตำแหน่งของลำดับยีน SeSaM เอาชนะอคติของพอลิเมอเรสที่สนับสนุนการแทนที่ชั่วคราวในตำแหน่งเฉพาะ แต่เปิดลำดับยีนทั้งหมดให้กับการแลกเปลี่ยนกรดอะมิโนที่หลากหลาย^{[ 4 ​​]}

ในระหว่างการพัฒนาวิธี SeSaM มีการปรับเปลี่ยนหลายอย่างที่ช่วยให้สามารถนำการกลายพันธุ์หลายอย่างพร้อมกันได้^{[ 5 ]}ความก้าวหน้าอีกประการหนึ่งของวิธีนี้เกิดขึ้นจากการนำเบสที่เสื่อมสภาพมาใช้แทนอิโนซีน สากล และการใช้พอลิเมอเรส DNA ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม ซึ่งช่วยเพิ่มอัตราส่วนของทรานส์เวอร์ชันที่นำเข้ามา^{[ 6 ]}วิธี SeSaM-TV+ ที่ได้รับการดัดแปลงนี้ยังช่วยให้สามารถนำการแลกเปลี่ยนนิวคลีโอไทด์สองครั้งติดต่อกันได้ ซึ่งขยายขอบเขตของกรดอะมิโนที่สามารถแทนที่ได้อย่างมาก

ด้วยการปรับปรุงหลายประการ รวมถึงการประยุกต์ใช้พอ ลิเมอเรสไคเม อรา ที่ได้รับการปรับปรุง ในขั้นตอนที่ III ของวิธีการ SeSaM-TV-II ^{[ 7 ] [ 8 ]}และการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ดีเจเนอเรตทางเลือกเพื่อการแทนที่ เบส ไทมีนและไซโตซีน อย่างมีประสิทธิภาพ และความถี่การกลายพันธุ์ที่เพิ่มขึ้นใน SeSaM-P/R ^{[ 9 ]}ไลบรารีที่สร้างขึ้นได้รับการปรับปรุงเพิ่มเติมในแง่ของจำนวนทรานส์เวอร์ชัน และจำนวนการกลายพันธุ์ต่อเนื่องเพิ่มขึ้นเป็น 2–4 การกลายพันธุ์ต่อเนื่อง โดยมีอัตราการกลายพันธุ์ต่อเนื่องสูงถึง 30% ^{[ 10 ]}

วิธีการ SeSaM ประกอบด้วยขั้นตอนที่ใช้ PCR สี่ขั้นตอน ซึ่งสามารถดำเนินการได้ภายในสองถึงสามวัน ส่วนสำคัญได้แก่ การใส่ฟอสฟอโรไทโอเอตนิวคลีโอไทด์ การแตกตัวทางเคมีที่ตำแหน่งเหล่านั้น การใส่เบสสากลหรือเบสเสื่อมสภาพ และการแทนที่ด้วยนิวคลีโอไทด์ธรรมชาติที่ทำให้เกิดการกลายพันธุ์แบบจุด

ในขั้นแรก จะมีการแทรกซีเควนซ์ “SeSaM” สากลโดยใช้ PCR ร่วมกับไพรเมอร์เฉพาะยีนที่จับอยู่ด้านหน้าและด้านหลังของยีนที่สนใจ จากนั้นจะทำการขยายยีนที่สนใจพร้อมกับบริเวณข้างเคียงเพื่อนำซีเควนซ์ SeSaM_fwd และ SeSaM_rev เหล่านี้เข้าไป และสร้างแม่แบบสำหรับขั้นตอน PCR ต่อไป

แม่แบบ fwd และแม่แบบ rev ที่สร้างขึ้นเหล่านี้จะถูกขยายจำนวนในปฏิกิริยา PCR ด้วยส่วนผสมของฟอสฟอโรไทโอเอตและนิวคลีโอไทด์มาตรฐานที่กำหนดไว้ล่วงหน้า เพื่อให้แน่ใจว่าการกลายพันธุ์ที่แทรกเข้าไปนั้นกระจายตัวอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งความยาวของยีน ผลิตภัณฑ์ PCR จากขั้นตอนที่ 1 จะถูกตัดอย่างจำเพาะเจาะจงที่พันธะฟอสฟอโรไทโอเอต ทำให้เกิดกลุ่มของชิ้นส่วน DNA สายเดี่ยวที่มีความยาวแตกต่างกัน โดยเริ่มต้นจากไพรเมอร์สากล

ในขั้นตอนที่ 2 ของ SeSaM สายดีเอ็นเอเดี่ยวจะถูกต่อเติมด้วยเบสสากลหรือเบสเสื่อมสภาพหนึ่งถึงหลายตัว (ขึ้นอยู่กับการดัดแปลง SeSaM ที่ใช้) โดยมีเอนไซม์เทอร์มินัลดีออกซีนิวคลีโอไทด์ทรานสเฟอเรส (TdT) เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา ขั้นตอนนี้เป็นขั้นตอนสำคัญในการสร้างการกลายพันธุ์ต่อเนื่องที่เป็นลักษณะเฉพาะ เพื่อสุ่มกลายพันธุ์โคดอนทั้งหมด

ต่อมา ในขั้นตอนที่ 3 จะทำการทำ PCR โดยการรวมชิ้นส่วน DNA สายเดี่ยวเข้ากับแม่แบบย้อนกลับที่มีความยาวเต็มที่ที่สอดคล้องกัน เพื่อสร้างยีนสายคู่ที่มีความยาวเต็มที่ ซึ่งรวมถึงเบสสากลหรือเบสที่เสื่อมสภาพในลำดับของยีนนั้น

โดยการแทนที่เบสสากล/เบสเสื่อมสภาพในลำดับยีนด้วยนิวคลีโอไทด์มาตรฐานแบบสุ่มในขั้นตอนที่ 4 ของ SeSaM จะสร้างลำดับยีนแบบเต็มความยาวที่หลากหลายซึ่งมีการกลายพันธุ์แบบแทนที่ รวมถึงการกลายพันธุ์แบบทรานส์เวอร์ชันและการกลายพันธุ์แบบแทนที่ที่ตามมาในปริมาณมาก

SeSaM ใช้ในการปรับโปรตีนให้เหมาะสมโดยตรงในระดับกรดอะมิโน แต่ยังใช้ในการระบุตำแหน่งกรดอะมิโนเบื้องต้นเพื่อทดสอบในการกลายพันธุ์แบบอิ่มตัวสำหรับการแลกเปลี่ยนกรดอะมิโนที่เหมาะสม SeSaM ประสบความสำเร็จในการนำไปใช้ในแคมเปญวิวัฒนาการแบบกำหนดทิศทางจำนวนมากของเอนไซม์ประเภทต่างๆ เพื่อปรับปรุงคุณสมบัติที่เลือกไว้ เช่น เซลลูเลสเพื่อความต้านทานต่อของเหลวไอออนิก^{[ 11 ]}โปรตีเอสที่มีความทนทานต่อผงซักฟอกเพิ่มขึ้น^{[ 12 ]}กลูโคสออกซิเดสสำหรับการใช้งานวิเคราะห์^{[ 13 ]}ไฟเทสที่มีความเสถียรต่อความร้อนเพิ่มขึ้น^{[ 14 ]}และโมโนออกซิเจเนสที่มีประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยาที่ดีขึ้นโดยใช้ตัวให้อิเล็กตรอนทางเลือก^{[ 15 ]} SeSaM ได้รับการคุ้มครองสิทธิบัตรโดย US770374 B2 ในกว่า 13 ประเทศ และเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีแพลตฟอร์มของSeSaM -Biotech GmbH