การทดสอบเอนไซม์เป็น วิธี การทางห้องปฏิบัติการสำหรับการวัด กิจกรรม ของเอนไซม์ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการศึกษาจลนศาสตร์ ของเอนไซม์และการยับยั้งเอนไซม์

ปริมาณหรือความเข้มข้นของเอนไซม์สามารถแสดงได้ใน หน่วย โมลาร์เช่นเดียวกับสารเคมีอื่นๆ หรือในหน่วยกิจกรรมของเอนไซม์ก็ได้

กิจกรรมของเอนไซม์เป็นการวัดปริมาณของเอนไซม์ที่ออกฤทธิ์อยู่ และขึ้นอยู่กับสภาวะทางกายภาพต่างๆซึ่งควรระบุให้ชัดเจน

คำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

${\displaystyle \mathrm {a} =\mathrm {n} _{\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V} }$

ที่ไหน

${\displaystyle \mathrm {a} }$= กิจกรรมของเอนไซม์

${\displaystyle \mathrm {n} _{\text{t}}}$= จำนวนโมลของสารตั้งต้นที่ถูกเปลี่ยนต่อหน่วยเวลา

${\displaystyle \mathrm {r} }$= อัตราการเกิดปฏิกิริยา

${\displaystyle \mathrm {V} }$= ปริมาตรปฏิกิริยา

หน่วย SI คือkatalโดย 1 katal = 1  mol s ⁻¹ (โมลต่อวินาที) แต่หน่วยนี้มีขนาดใหญ่เกินไป ค่าที่ใช้งานได้จริงและใช้กันทั่วไปมากกว่าคือหน่วยเอนไซม์ (U) = 1 μmol min ⁻¹ (ไมโครโมลต่อนาที) 1 U เทียบเท่ากับ 16.67 นาโน katals ^{[ 1 ]}

กิจกรรมของเอนไซม์ตามที่ระบุใน katal โดยทั่วไปหมายถึงกิจกรรมของสารตั้งต้นเป้าหมายตามธรรมชาติที่คาดการณ์ไว้ของเอนไซม์ กิจกรรมของเอนไซม์ยังสามารถระบุเป็นกิจกรรมของสารตั้งต้นมาตรฐานบางอย่าง เช่นเจลาตินซึ่งวัดเป็นหน่วยย่อยเจลาติน (GDU) หรือโปรตีนนม ซึ่งวัดเป็นหน่วยจับตัวเป็นก้อนของนม (MCU) หน่วย GDU และ MCU ขึ้นอยู่กับความเร็วในการย่อยเจลาตินหรือโปรตีนนมของเอนไซม์ 1 กรัม ตามลำดับ 1 GDU เท่ากับประมาณ 1.5 MCU ^{[ 2 ]}

ปริมาณสารตั้งต้นที่เพิ่มขึ้นจะทำให้ปฏิกิริยากับเอนไซม์เร็วขึ้น อย่างไรก็ตาม เมื่อถึงจุดหนึ่งแล้ว อัตราการเกิดปฏิกิริยาจะคงที่ เนื่องจากปริมาณของตำแหน่งที่ออกฤทธิ์ได้ยังคงที่

กิจกรรมจำเพาะของเอนไซม์เป็นหน่วยวัดที่ใช้กันทั่วไปอีกหน่วยหนึ่ง ซึ่งก็คือค่ากิจกรรมของเอนไซม์ต่อมิลลิกรัมของโปรตีนทั้งหมด (แสดงในหน่วย μmol min ⁻¹ mg ⁻¹ ) กิจกรรมจำเพาะเป็นการวัดความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ในสารผสม โดยคิดเป็นไมโครโมลของผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากเอนไซม์ในช่วงเวลาที่กำหนด (นาที) ภายใต้สภาวะที่กำหนด ต่อมิลลิกรัมของโปรตีนทั้งหมด กิจกรรมจำเพาะเท่ากับอัตราการเกิดปฏิกิริยาคูณด้วยปริมาตรของปฏิกิริยาหารด้วยมวลของโปรตีนทั้งหมด หน่วย SI คือ katal/kg แต่หน่วยที่ใช้งานได้จริงมากกว่าคือ μmol/(mg*min)

กิจกรรมจำเพาะคือการวัดกระบวนการทำงานของเอนไซม์ (ความสามารถของเอนไซม์ในการประมวลผล) ที่ความเข้มข้น ของสารตั้งต้นเฉพาะ (โดยปกติคือความเข้มข้นอิ่มตัว) และโดยทั่วไปจะมีค่าคงที่สำหรับเอนไซม์บริสุทธิ์

กระบวนการไทเทรตตำแหน่งออกฤทธิ์สามารถทำได้เพื่อขจัดข้อผิดพลาดที่เกิดจากความแตกต่างในชุดการเพาะเลี้ยงและ/หรือเอนไซม์ที่พับตัวผิดรูป และปัญหาที่คล้ายคลึงกัน นี่เป็นการวัดปริมาณเอนไซม์ที่ออกฤทธิ์ โดยคำนวณได้จากการไทเทรตปริมาณตำแหน่งออกฤทธิ์โดยใช้สารยับยั้งแบบผันกลับไม่ได้ จากนั้นควรแสดงค่ากิจกรรมจำเพาะในหน่วย μmol min ⁻¹ mg ⁻¹เอนไซม์ที่ออกฤทธิ์ หากทราบน้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์ สามารถคำนวณ อัตราการหมุนเวียนหรือ μmol ผลิตภัณฑ์ต่อวินาทีต่อ μmol ของเอนไซม์ที่ออกฤทธิ์ ได้จากค่ากิจกรรมจำเพาะ อัตราการหมุนเวียนสามารถมองเห็นได้เป็นจำนวนครั้งที่แต่ละโมเลกุลของเอนไซม์ดำเนินการวัฏจักรเร่งปฏิกิริยาต่อวินาที

อัตราการเกิดปฏิกิริยาคือความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่หายไป (หรือผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้น) ต่อหน่วยเวลา (mol L ⁻¹ s ⁻¹ )

เปอร์เซ็นต์ความบริสุทธิ์คือ 100% × (ค่ากิจกรรมจำเพาะของตัวอย่างเอนไซม์ / ค่ากิจกรรมจำเพาะของเอนไซม์บริสุทธิ์) ตัวอย่างที่ไม่บริสุทธิ์จะมีค่ากิจกรรมจำเพาะต่ำกว่า เนื่องจากมวลบางส่วนไม่ใช่เอนไซม์จริง หากทราบค่ากิจกรรมจำเพาะของเอนไซม์บริสุทธิ์ 100% แล้ว ตัวอย่างที่ไม่บริสุทธิ์จะมีค่ากิจกรรมจำเพาะต่ำกว่า ทำให้สามารถคำนวณความบริสุทธิ์และได้ผลลัพธ์ที่ชัดเจน

การทดสอบเอนไซม์ทั้งหมดจะวัดการบริโภคสารตั้งต้นหรือการผลิตผลิตภัณฑ์เมื่อเวลาผ่านไป มีวิธีการวัดความเข้มข้นของสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์ที่แตกต่างกันมากมาย และเอนไซม์หลายชนิดสามารถทดสอบได้หลายวิธี นักชีวเคมีมักศึกษาปฏิกิริยาที่เร่งด้วยเอนไซม์โดยใช้การทดลองสี่ประเภท: ^{[ 3 ]}

• การทดลองหาอัตราเริ่มต้นเมื่อเอนไซม์ผสมกับสารตั้งต้นในปริมาณมากเกินพอ สารตัวกลางระหว่างเอนไซม์และสารตั้งต้นจะเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วในช่วงเริ่มต้น จากนั้นปฏิกิริยาจะเข้าสู่สภาวะสมดุล ซึ่งสารตัวกลางระหว่างเอนไซม์และสารตั้งต้นจะคงที่โดยประมาณตลอดเวลา และอัตราการเกิดปฏิกิริยาจะเปลี่ยนแปลงค่อนข้างช้า โดยทั่วไปจะวัดอัตราในช่วงเวลาสั้นๆ หลังจากเข้าสู่สภาวะสมดุลแล้ว โดยการตรวจสอบการสะสมของผลิตภัณฑ์ตามเวลา เนื่องจากการวัดทำในช่วงเวลาสั้นมากและเนื่องจากมีสารตั้งต้นมากเกินไป จึงสามารถประมาณได้ว่าปริมาณสารตั้งต้นอิสระมีค่าประมาณเท่ากับปริมาณสารตั้งต้นเริ่มต้น การทดลองหาอัตราเริ่มต้นนั้นง่ายที่สุดในการดำเนินการและวิเคราะห์ โดยค่อนข้างปราศจากความซับซ้อน เช่น ปฏิกิริยาย้อนกลับและการเสื่อมสภาพของเอนไซม์ ดังนั้นจึงเป็นประเภทของการทดลองที่ใช้กันมากที่สุดในจลนศาสตร์ของเอนไซม์
• การทดลองเส้นโค้งความคืบหน้าในการทดลองเหล่านี้ พารามิเตอร์จลนศาสตร์จะถูกกำหนดจากสมการความเข้มข้นของสารตั้งต้นหรือผลิตภัณฑ์เป็นฟังก์ชันของเวลา ความเข้มข้นของสารตั้งต้นหรือผลิตภัณฑ์จะถูกบันทึกไว้หลังจากช่วงการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วในช่วงแรก และเป็นระยะเวลานานพอที่จะทำให้ปฏิกิริยาเข้าสู่สมดุล การทดลองเส้นโค้งความคืบหน้าถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในยุคแรกๆ ของจลนศาสตร์เอนไซม์ แต่ปัจจุบันไม่ค่อยนิยมใช้แล้ว
• การทดลองจลนศาสตร์แบบชั่วคราวในการทดลองเหล่านี้ พฤติกรรมของปฏิกิริยาจะถูกติดตามในช่วงการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วในช่วงแรก จนกระทั่งสารตัวกลางเข้าสู่ช่วงจลนศาสตร์แบบสภาวะคงที่ การทดลองเหล่านี้ทำได้ยากกว่าการทดลองสองประเภทข้างต้น เนื่องจากต้องใช้เทคนิคเฉพาะทาง (เช่นการสลายตัวด้วยแสงแฟลชของสารประกอบที่ถูกกักไว้) หรือการผสมอย่างรวดเร็ว (เช่นการไหลแบบหยุดการไหลแบบดับ หรือการไหลแบบต่อเนื่อง)
• การทดลองการผ่อนคลายในการทดลองเหล่านี้ ส่วนผสมสมดุลของเอนไซม์ สารตั้งต้น และผลิตภัณฑ์จะถูกรบกวน เช่น โดย การเปลี่ยนแปลง อุณหภูมิความดันหรือค่า pH และจะมีการตรวจสอบการกลับคืนสู่สมดุล การวิเคราะห์การทดลองเหล่านี้จำเป็นต้องพิจารณาปฏิกิริยาที่ผันกลับได้อย่างสมบูรณ์ นอกจากนี้ การทดลองการผ่อนคลายค่อนข้างไม่ไวต่อรายละเอียดเชิงกลไก ดังนั้นจึงไม่ค่อยได้ใช้สำหรับการระบุกลไก แม้ว่าจะสามารถใช้ได้ภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมก็ตาม

การทดสอบเอนไซม์สามารถแบ่งออกเป็นสองกลุ่มตามวิธีการเก็บตัวอย่าง ได้แก่การทดสอบแบบต่อเนื่องซึ่งเป็นการทดสอบที่ให้ค่ากิจกรรมอย่างต่อเนื่อง และการทดสอบแบบไม่ต่อเนื่องซึ่งเป็นการเก็บตัวอย่าง หยุดปฏิกิริยา แล้วจึงวัดความเข้มข้นของสารตั้งต้น/ผลิตภัณฑ์

การทดสอบแบบต่อเนื่องสะดวกที่สุด เพราะการทดสอบเพียงครั้งเดียวก็สามารถบอกอัตราการเกิดปฏิกิริยาได้โดยไม่ต้องดำเนินการเพิ่มเติมใดๆ การทดสอบแบบต่อเนื่องมีหลายประเภท

ใน การวิเคราะห์ด้วยสเปก โทรโฟโตเมตรีคุณจะติดตามการเกิดปฏิกิริยาโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงปริมาณแสงที่สารละลายดูดซับ หากแสงนั้นอยู่ในช่วงแสงที่มองเห็นได้ คุณจะสามารถมองเห็นการเปลี่ยนแปลงสีของสารละลายได้ และการวิเคราะห์แบบนี้เรียกว่าการวิเคราะห์เชิงสี (colorimetric assays ) การวิเคราะห์ MTTซึ่งเป็นการวิเคราะห์ปฏิกิริยารีดอกซ์โดยใช้สีย้อมเตตราโซเลียมเป็นสารตั้งต้น เป็นตัวอย่างของการวิเคราะห์เชิงสี

มักใช้แสง UV เนื่องจากโคเอนไซม์ทั่วไปNADHและNADPHดูดซับแสง UV ใน รูปแบบ ที่ลดลงแต่ไม่ดูดซับในรูปแบบที่ถูกออกซิ ไดซ์ ดังนั้น ออก ซิโดรีดักเทสที่ใช้ NADH เป็นสารตั้งต้นจึงสามารถทดสอบได้โดยการติดตามการลดลงของการดูดซับ UV ที่ความยาวคลื่น 340 นาโนเมตร ขณะที่มันบริโภคโคเอนไซม์^{[ 4 ]}

การทดสอบโดยตรงเทียบกับการทดสอบแบบเชื่อมโยง

แม้ว่าปฏิกิริยาของเอนไซม์จะไม่ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสง แต่ก็ยังสามารถใช้การวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรโฟโตเมตริกสำหรับเอนไซม์ได้โดยใช้การวิเคราะห์แบบคู่ขนานในที่นี้ ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาหนึ่งจะถูกใช้เป็นสารตั้งต้นของปฏิกิริยาอื่นที่ตรวจจับได้ง่าย ตัวอย่างเช่น รูปที่ 1 แสดงการวิเคราะห์แบบคู่ขนานสำหรับเอนไซม์เฮกโซไคเนสซึ่งสามารถวิเคราะห์ได้โดยการเชื่อมโยงการผลิตกลูโคส-6-ฟอสเฟตกับการผลิต NADPH โดยใช้กลูโคส-6-ฟอสเฟตดีไฮโดร จีเน ส

การเรืองแสงเกิดขึ้นเมื่อโมเลกุลปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่น หนึ่งออก มาหลังจากดูดซับแสงที่มีความยาวคลื่นต่างกัน การวิเคราะห์ด้วยวิธีฟลูออโรเมตริกใช้ความแตกต่างของค่าการเรืองแสงระหว่างสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์เพื่อวัดปฏิกิริยาของเอนไซม์ โดยทั่วไปแล้วการวิเคราะห์ด้วยวิธีนี้มีความไวมากกว่าการวิเคราะห์ด้วยวิธีสเปกโทรโฟโตเมตริกมาก แต่ก็อาจเกิดปัญหาจากการรบกวนของสิ่งเจือปนและความไม่เสถียรของสารประกอบเรืองแสงหลายชนิดเมื่อสัมผัสกับแสงได้

ตัวอย่างของการทดสอบเหล่านี้คือการใช้โคเอนไซม์นิวคลีโอไทด์ NADH และ NADPH อีกครั้ง ในที่นี้ รูปแบบที่ลดลงจะเรืองแสง และรูปแบบที่ถูกออกซิไดซ์จะไม่เรืองแสง ดังนั้นปฏิกิริยาออกซิเดชันจึงสามารถติดตามได้จากการลดลงของการเรืองแสง และปฏิกิริยารีดักชันโดยการเพิ่มขึ้น^{[ 5 ]}นอกจากนี้ยังมีสารตั้งต้นสังเคราะห์ที่ปล่อยสีย้อมเรืองแสงในปฏิกิริยาที่เร่งด้วยเอนไซม์ เช่น 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside สำหรับการทดสอบβ-galactosidaseหรือ 4-methylumbelliferyl-butyrate สำหรับการทดสอบCandida rugosa lipase ^{[ 6 ]}

แคลอริเมตรีคือการวัดความร้อนที่ปล่อยออกมาหรือดูดซับโดยปฏิกิริยาเคมี การทดสอบเหล่านี้มีความทั่วไปมาก เนื่องจากปฏิกิริยาหลายอย่างเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงความร้อน และด้วยการใช้ไมโครแคลอริเมตรี ไม่จำเป็นต้องใช้เอนไซม์หรือสารตั้งต้นมากนัก การทดสอบเหล่านี้สามารถใช้ในการวัดปฏิกิริยาที่ไม่สามารถทดสอบด้วยวิธีอื่นได้^{[ 7 ]}

เคมีเรืองแสงคือการปล่อยแสงออกมาจากปฏิกิริยาเคมี ปฏิกิริยาของเอนไซม์บางชนิดผลิตแสง และสามารถวัดแสงนี้เพื่อตรวจจับการเกิดผลิตภัณฑ์ได้ การทดสอบประเภทนี้มีความไวสูงมาก เนื่องจากแสงที่เกิดขึ้นสามารถบันทึกได้ด้วยฟิล์มถ่ายภาพเป็นเวลาหลายวันหรือหลายสัปดาห์ แต่การวัดปริมาณอาจทำได้ยาก เนื่องจากแสงที่ปล่อยออกมาจากปฏิกิริยาทั้งหมดจะไม่ถูกตรวจจับได้

การตรวจจับเอนไซม์ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสด้วยปฏิกิริยาเคมีเรืองแสง (ECL) เป็นวิธีการทั่วไปในการตรวจจับแอนติบอดีในเวสเทิร์นบลอตติงอีกตัวอย่างหนึ่งคือเอนไซม์ลูซิเฟอเรสซึ่งพบในหิ่งห้อยและผลิตแสงได้เองตามธรรมชาติจากสารตั้งต้นลูซิเฟอริน

การกระเจิงแสงแบบสถิตเป็นการวัดผลคูณของมวลโมลาร์เฉลี่ยถ่วงน้ำหนักและความเข้มข้นของโมเลกุลขนาดใหญ่ในสารละลาย เมื่อความเข้มข้นรวมของสารหนึ่งชนิดหรือมากกว่านั้นคงที่ตลอดช่วงเวลาการวัด สัญญาณการกระเจิงจะเป็นการวัดโดยตรงของมวลโมลาร์เฉลี่ยถ่วงน้ำหนักของสารละลาย ซึ่งจะเปลี่ยนแปลงไปตามการก่อตัวหรือการแตกตัวของสารประกอบเชิงซ้อน ดังนั้นการวัดนี้จึงสามารถหาปริมาณสัดส่วนของสารประกอบเชิงซ้อนรวมถึงจลนศาสตร์ได้ด้วย การวิเคราะห์จลนศาสตร์ของโปรตีนด้วยการกระเจิงแสงเป็นเทคนิคทั่วไปที่ไม่ต้องใช้เอนไซม์

ไมโครสเกลเทอร์โมโฟเรซิส (MST) ^{[ 8 ]}วัดขนาด ประจุ และเอนโทรปีของการไฮเดรชั่นของโมเลกุล/ซับสเตรตที่สมดุล^{[ 9 ]}การเคลื่อนที่แบบเทอร์โมโฟเรซิสของซับสเตรตที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์จะเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อถูกดัดแปลงโดยเอนไซม์ กิจกรรมของเอนไซม์นี้สามารถวัดได้ด้วยความละเอียดของเวลาสูงแบบเรียลไทม์^{[ 10 ]}การใช้วัสดุของวิธีการ MST แบบออปติคอลทั้งหมดนั้นต่ำมาก โดยใช้ปริมาตรตัวอย่างเพียง 5 μl และความเข้มข้นของเอนไซม์ 10 nM เท่านั้นในการวัดค่าคงที่อัตราของเอนไซม์สำหรับกิจกรรมและการยับยั้ง MST ช่วยให้นักวิเคราะห์สามารถวัดการดัดแปลงของซับสเตรตที่แตกต่างกันสองชนิดพร้อมกัน ( มัลติเพล็กซ์ ) หากซับสเตรตทั้งสองชนิดติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์ที่แตกต่างกัน ดังนั้นจึงสามารถทำการทดลองการแข่งขันของซับสเตรตได้

การทดสอบแบบไม่ต่อเนื่อง คือการเก็บตัวอย่างจากปฏิกิริยาของเอนไซม์เป็นช่วงๆ และวัดปริมาณผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นหรือปริมาณการใช้สารตั้งต้นในตัวอย่างเหล่านั้น

การวิเคราะห์ด้วยวิธีเรดิโอเมตริกส์เป็นการวัดการรวมตัวของกัมมันตภาพรังสีเข้าไปในสารตั้งต้นหรือการปลดปล่อยกัมมันตภาพรังสีออกจากสารตั้งต้นไอโซโทปกัมมันตภาพรังสีที่ใช้บ่อยที่สุดในการวิเคราะห์เหล่านี้คือ^14C , ^32P , ^35Sและ^125Iเนื่องจากไอโซโทปกัมมันตภาพรังสีช่วยให้สามารถติดฉลากเฉพาะอะตอมเดียวของสารตั้งต้นได้ การวิเคราะห์เหล่านี้จึงมีความไวและความจำเพาะสูงมาก มักใช้ในชีวเคมีและมักเป็นวิธีเดียวในการวัดปฏิกิริยาเฉพาะในสารสกัดดิบ (ส่วนผสมที่ซับซ้อนของเอนไซม์ที่เกิดขึ้นเมื่อเซลล์แตกตัว)

โดยปกติแล้ว การวัดปริมาณกัมมันตภาพรังสีในขั้นตอนเหล่านี้จะใช้เครื่องนับแสงวับ (scintillation counter )

การทดสอบโครมาโทกราฟีจะวัดการเกิดผลิตภัณฑ์โดยการแยกส่วนผสมของปฏิกิริยาออกเป็นส่วนประกอบต่างๆ โดยใช้ โคร มาโทกราฟีซึ่งโดยทั่วไปจะทำโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) แต่ก็สามารถใช้เทคนิคที่ง่ายกว่าอย่างโครมาโทกราฟีแบบชั้นบางได้เช่นกัน แม้ว่าวิธีการนี้อาจต้องใช้วัสดุจำนวนมาก แต่ความไวของการทดสอบสามารถเพิ่มขึ้นได้โดยการติดฉลากสารตั้งต้น/ผลิตภัณฑ์ด้วยแท็กกัมมันตรังสีหรือเรืองแสง ความไวของการทดสอบยังเพิ่มขึ้นได้ด้วยการเปลี่ยนโปรโตคอลไปใช้เครื่องมือโครมาโทกราฟีที่ได้รับการปรับปรุง (เช่น โครมาโทกราฟีของเหลวแรงดันสูงพิเศษ) ซึ่งทำงานที่แรงดันปั๊มสูงกว่าเครื่องมือ HPLC หลายเท่า (ดูโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง#แรงดันปั๊ม ) ^{[ 11 ]}

ปัจจัยหลายประการส่งผลต่อผลลัพธ์ของการทดสอบ และบทวิจารณ์ล่าสุดได้สรุปพารามิเตอร์ต่างๆ ที่จำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบเพื่อให้การทดสอบดำเนินไปได้อย่างราบรื่น

เอนไซม์ส่วนใหญ่ไม่สามารถทนต่อความเข้มข้นของเกลือที่สูงมากได้ ไอออนจะไปรบกวนพันธะไอออนิก ที่อ่อนแอ ของโปรตีนโดยทั่วไปเอนไซม์จะทำงานได้ในความเข้มข้นของเกลือ 1-500 มิลลิโมลาร์ อย่างไรก็ตามก็มีข้อยกเว้นอยู่บ้าง เช่นสาหร่ายที่ชอบเกลือ และแบคทีเรียที่ ชอบเกลือ

เอนไซม์ทั้งหมดทำงานในช่วงอุณหภูมิที่เฉพาะเจาะจงสำหรับสิ่งมีชีวิต การเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิโดยทั่วไปจะนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของอัตราการเกิดปฏิกิริยา อย่างไรก็ตาม มีขีดจำกัดของการเพิ่มขึ้น เนื่องจากอุณหภูมิที่สูงขึ้นจะนำไปสู่การลดลงของอัตราการเกิดปฏิกิริยาอย่างรวดเร็ว ซึ่งเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของโปรตีนอันเนื่องมาจากการแตกตัวของ พันธะ ไอออนิกและพันธะไฮโดรเจน ที่อ่อนแอ ซึ่งทำให้โครงสร้างสามมิติของบริเวณออกฤทธิ์ของเอนไซม์มีความเสถียร^{[ 12 ]}อุณหภูมิที่ "เหมาะสมที่สุด" สำหรับเอนไซม์ของมนุษย์มักจะอยู่ระหว่าง 35 ถึง 40 °C อุณหภูมิเฉลี่ยของมนุษย์คือ 37 °C เอนไซม์ของมนุษย์จะเริ่มเสียสภาพอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่า 40 °C เอนไซม์จากอาร์ เคียที่ ทนความร้อน ซึ่งพบในน้ำพุร้อนมีความเสถียรได้ถึง 100 °C ^{[ 13 ]}อย่างไรก็ตาม แนวคิดเรื่องอัตราที่ "เหมาะสมที่สุด" ของปฏิกิริยาของเอนไซม์นั้นเป็นสิ่งที่ทำให้เข้าใจผิด เนื่องจากอัตราที่สังเกตได้ที่อุณหภูมิใด ๆ เป็นผลคูณของสองอัตรา คือ อัตราการเกิดปฏิกิริยาและอัตราการเสียสภาพ หากคุณใช้การทดสอบที่วัดกิจกรรมในช่วงเวลาหนึ่งวินาที ผลลัพธ์ที่ได้จะมีกิจกรรมสูงที่อุณหภูมิสูง แต่หากคุณใช้การทดสอบที่วัดการเกิดผลิตภัณฑ์ในช่วงเวลาหนึ่งชั่วโมง ผลลัพธ์ที่ได้จะมีกิจกรรมต่ำที่อุณหภูมิเหล่านั้น

เอนไซม์ส่วนใหญ่มีความไวต่อค่าpHและมีช่วงการทำงานที่เฉพาะเจาะจง เอนไซม์ทุกตัวมีค่า pH ที่เหมาะสมที่สุด ค่า pH สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้โดยการทำให้โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์เสียสภาพ (เปลี่ยนแปลง) ผ่านการทำลาย พันธะ ไอออนิกและพันธะไฮโดรเจนเอนไซม์ส่วนใหญ่ทำงานได้ดีในช่วง pH 6 ถึง 8 อย่างไรก็ตาม เปปซินในกระเพาะอาหารทำงานได้ดีที่สุดที่ pH 2 และทริปซินที่ pH 8

การเพิ่มความเข้มข้นของสารตั้งต้นจะเพิ่มอัตราการเกิดปฏิกิริยา (กิจกรรมของเอนไซม์) อย่างไรก็ตาม ความอิ่มตัวของเอนไซม์จะจำกัดอัตราการเกิดปฏิกิริยา เอนไซม์จะอิ่มตัวเมื่อตำแหน่งออกฤทธิ์ของโมเลกุลทั้งหมดถูกครอบครองเกือบตลอดเวลา ณ จุดอิ่มตัว ปฏิกิริยาจะไม่เร็วขึ้นอีก ไม่ว่าคุณจะเติมสารตั้งต้นเพิ่มเข้าไปมากแค่ไหนก็ตาม กราฟอัตราการเกิดปฏิกิริยาจะคงที่

โมเลกุลขนาดใหญ่จำนวนมากในสารละลายจะเปลี่ยนแปลงอัตราและค่าคงที่สมดุลของปฏิกิริยาเอนไซม์ผ่านผลที่เรียกว่าการแออัดของโมเลกุลขนาดใหญ่^{[ 14 ]}

• การทดสอบ MTT
• การไฮโดรไลซิสของฟลูออเรสซีนไดอะซิเตต
• พารา -ไนโตรฟีนิลฟอสเฟต

• เอนไซม์จำกัด
• การทดสอบร่องรอยดีเอ็นเอส
• จลนศาสตร์ของเอนไซม์

• สื่อที่เกี่ยวข้องกับการทดสอบเอนไซม์ในวิกิมีเดียคอมมอนส์
• "ขั้นตอนการทดสอบ - OpenWetWare" OpenWetWare มูลนิธิ BioBricks สืบค้นเมื่อ27กรกฎาคม2022