การทำให้บริสุทธิ์ แบบคู่ขนานโดยอาศัย ความสัมพันธ์ ( Tandem affinity purificationหรือTAP ) เป็นเทคนิคการทำให้บริสุทธิ์โดยอาศัยภูมิคุ้มกัน (immunoprecipitation ) สำหรับการศึกษา ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนเป้าหมายคือการสกัดเฉพาะโปรตีนที่สนใจจากเซลล์โดยอยู่ในรูปสารประกอบเชิงซ้อนกับ โปรตีนอื่นๆ ที่มีปฏิสัมพันธ์ด้วย TAP ใช้ลูกปัด อะกาโรส สองชนิด ที่จับกับโปรตีนที่สนใจและสามารถแยกออกจากสารละลายเซลล์ได้โดยการปั่นเหวี่ยง โดยไม่รบกวน ทำให้เสียสภาพ หรือปนเปื้อนสารประกอบเชิงซ้อนที่เกี่ยวข้อง เพื่อให้โปรตีนที่สนใจสามารถจับกับลูกปัดได้ จึงมีการติดแท็กที่ออกแบบมาเป็นพิเศษ ซึ่งเรียกว่าแท็ก TAP

วิธีการ TAP ดั้งเดิมเกี่ยวข้องกับการรวมแท็ก TAP เข้ากับปลาย Cของโปรตีนที่กำลังศึกษา แท็ก TAP ประกอบด้วยส่วนประกอบสามส่วน ได้แก่ เพปไทด์ที่จับกับ แคลโมดูลิน (CBP) ตำแหน่งการตัดของเอนไซม์โปรตีเอส TEV และ โดเมน โปรตีน A สอง โดเมน ซึ่งจับกับIgG อย่างแน่นหนา (ทำให้แท็ก TAP เป็นแท็ก เอพิโทปชนิดหนึ่ง) ^{[ 1 ]}

มีการเสนอรูปแบบการผสมผสานระหว่างแท็ก/ลูกปัด/ตัวทำละลายอื่นๆ อีกมากมายนับตั้งแต่มีการเผยแพร่หลักการ TAP เป็นครั้งแรก

แท็กนี้เรียกอีกอย่างว่าแท็ก TAP ปลายซี (C-terminal TAP tag) เนื่องจาก มีเวอร์ชัน ปลายเอ็น (N-terminal)ให้เลือกใช้ด้วยเช่นกัน อย่างไรก็ตาม วิธีการที่จะอธิบายต่อไปนี้จะถือว่าใช้แท็กปลายซี แม้ว่าหลักการเบื้องหลังวิธีการนั้นจะยังคงเหมือนเดิมก็ตาม

การติดแท็ก TAP ถูกคิดค้นโดยทีมวิจัยที่ทำงานในห้องปฏิบัติการชีววิทยาโมเลกุลแห่งยุโรปในช่วงปลายทศวรรษ 1990 (Rigaut et al., 1999, ^{[ 2 ]} Puig et al., 2001 ^{[ 3 ]} ) และเสนอให้เป็นเครื่องมือใหม่สำหรับการสำรวจโปรตีโอม ทีมงานได้ใช้มันเพื่อจำแนกลักษณะของโปรตีนเชิงซ้อนหลายชนิด (Rigaut et al., 1999, ^{[ 2 ]} Caspary et al. 1999, ^{[ 4 ]} Bouveret et al., 2000, ^{[ 5 ]} Puig et al., 2001 ^{[ 3 ]} ) การประยุกต์ใช้เทคนิคนี้ในวงกว้างครั้งแรกเกิดขึ้นในปี 2545 ซึ่งทีมวิจัยได้ทำงานร่วมกับนักวิทยาศาสตร์ของบริษัทโปรตีโอมิกส์ Cellzome เพื่อพัฒนาแผนที่ภาพของการโต้ตอบของคอมเพล็กซ์โปรตีนหลายชนิดมากกว่า 230 ชนิดในเซลล์ยีสต์โดยการติดแท็ก TAP ให้กับโปรตีนแต่ละชนิดอย่างเป็นระบบ รายงานความสำเร็จครั้งแรกของการใช้เทคโนโลยีแท็ก TAP ในพืชเกิดขึ้นในปี 2547 (Rohila et al., 2547, ^{[ 6 ]} )

มีหลายวิธีในการนำโปรตีนลูกผสมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน หากเจ้าบ้านเป็นยีสต์วิธีหนึ่งอาจเป็นการใช้พลาสมิดซึ่งจะแปลโปรตีนลูกผสมภายในเจ้าบ้านในที่สุด ไม่ว่าจะใช้วิธีใดก็ตาม ควรคงระดับการแสดงออกของโปรตีนลูกผสมให้ใกล้เคียงกับระดับธรรมชาติมากที่สุด เมื่อโปรตีนลูกผสมถูกแปลภายในเจ้าบ้านแล้ว มันจะทำปฏิกิริยากับโปรตีนอื่นๆ โดยในอุดมคติแล้วจะเป็นไปในลักษณะที่ไม่ได้รับผลกระทบจากแท็ก TAP

จากนั้น โปรตีนที่ติดแท็ก (พร้อมกับคู่พันธะของมัน) จะถูกดึงกลับมาโดยใช้กระบวนการคัดเลือกตามความสัมพันธ์

ลูกปัดชนิดแรกที่เติมเข้าไปนั้นเคลือบด้วยอิมมูโนโกลบูลิน จีซึ่งจะจับกับปลายสุดด้านนอกของแท็ก TAP ลูกปัดที่มีโปรตีนที่สนใจจะถูกแยกออกจากสารละลายโดยการปั่นเหวี่ยง จากนั้นโปรตีนจะถูกปล่อยออกจากลูกปัดโดยเอนไซม์ ( TEV โปรตีเอส ) ซึ่งจะทำลายแท็กที่ตำแหน่งการตัดของ TEV ตรงกลาง

หลังจากขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ครั้งแรกนี้ จะมีการเติมลูกปัดชนิดที่สอง (เคลือบด้วยแคลโมดูลิน ) ลงในโปรตีนที่ถูกปล่อยออกมา ซึ่งจะจับกับส่วนที่เหลือของแท็ก TAP ที่ยังคงอยู่บนโปรตีนได้แบบย้อนกลับได้ ลูกปัดจะถูกแยกออกอีกครั้งโดยการปั่นเหวี่ยง เพื่อกำจัดสิ่งปนเปื้อนและโปรตีเอส TEV ออกไป ^{[ 3 ]}สุดท้าย ลูกปัดจะถูกปล่อยออกมาโดยEGTAเหลือไว้เพียงสารละลายธรรมชาติที่มีเฉพาะโปรตีนที่สนใจ โปรตีนคู่หูที่จับอยู่ และส่วน CBP ที่เหลือของแท็ก TAP

จากนั้นสามารถนำสารละลายที่ได้จากการชะล้างไปวิเคราะห์โดยใช้เจลอิเล็กโทรโฟเรซิสและแมสสเปกโทรเม ตรี เพื่อระบุคู่พันธะของโปรตีนได้

ข้อดีของวิธีนี้คือสามารถกำหนดโปรตีนคู่หูได้อย่างแท้จริงในเชิงปริมาณในร่างกายโดยไม่ต้องมีความรู้เกี่ยวกับองค์ประกอบที่ซับซ้อนมาก่อน นอกจากนี้ยังง่ายต่อการดำเนินการและมักให้ผลผลิตสูง^{[ 3 ]}หนึ่งในอุปสรรคของการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนคือการปนเปื้อนของโปรตีนเป้าหมาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อเราไม่มีความรู้เกี่ยวกับโปรตีนนั้นมาก่อน TAP นำเสนอวิธีการที่มีประสิทธิภาพและมีความเฉพาะเจาะจงสูงในการทำให้โปรตีนเป้าหมายบริสุทธิ์ หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ด้วยความสัมพันธ์ 2 ครั้งติดต่อกัน โอกาสที่สารปนเปื้อนจะยังคงอยู่ในสารละลายจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

อย่างไรก็ตาม ยังมีความเป็นไปได้ที่แท็กที่เพิ่มเข้าไปในโปรตีนอาจบดบังการจับกันของโปรตีนใหม่กับคู่พันธะของมัน นอกจากนี้ แท็กอาจส่งผลต่อระดับการแสดงออกของโปรตีนด้วย ในทางกลับกัน แท็กอาจไม่ปรากฏให้เห็นอย่างเพียงพอในลูกปัดจับยึด ทำให้ผลลัพธ์คลาดเคลื่อนไป

นอกจากนี้ ยังอาจมีความเป็นไปได้ที่โปรตีนจะถูกแยกออกโดยโปรตีเอส TEVแม้ว่าสิ่งนี้ไม่น่าจะเกิดขึ้นบ่อยนักเนื่องจากโปรตีเอส TEV มีความจำเพาะ สูง ^{[ 7 ]}

เนื่องจากวิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการล้างอย่างน้อย 2 รอบ จึงอาจไม่เหมาะสมสำหรับการตรวจสอบปฏิกิริยาโปรตีนชั่วคราวซึ่งแตกต่างจาก วิธีการ ยีสต์ทูไฮบริดหรือ การเชื่อมโยงข้าม ในร่างกายด้วยอะนาล็อกกรดอะมิโนที่ไวต่อแสงอย่างไรก็ตาม วิธีนี้เป็นวิธีที่ดีสำหรับการทดสอบปฏิกิริยาโปรตีนที่เสถียร และช่วยให้สามารถตรวจสอบได้ในระดับต่างๆ โดยการควบคุมจำนวนครั้งที่ทำการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเชิงซ้อน

ในปี พ.ศ. 2545 แท็ก TAP ถูกนำมาใช้ครั้งแรกกับการวิเคราะห์มวลสารด้วยสเปกโทรเมตรีในแนวทางขนาดใหญ่เพื่อวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของยีสต์อย่างเป็นระบบโดยการระบุลักษณะของคอมเพล็กซ์โปรตีนหลายชนิด^{[ 8 ]}การศึกษานี้เปิดเผยคอมเพล็กซ์ 491 คอมเพล็กซ์ โดย 257 คอมเพล็กซ์เป็นคอมเพล็กซ์ใหม่ทั้งหมด ส่วนที่เหลือเป็นที่คุ้นเคยจากการวิจัยอื่น ๆ แต่ในขณะนี้พบว่าเกือบทั้งหมดมีส่วนประกอบใหม่ พวกเขาสร้างแผนที่ที่เชื่อมโยงส่วนประกอบโปรตีนทั้งหมดในเชิงหน้าที่ในเครือข่ายที่ซับซ้อน

การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์อื่นๆ อีกมากมายเกี่ยวข้องกับการใช้แท็ก TAP ด้วยเช่นกัน งานวิจัยของ EMBO (Dziembowski, 2004) ระบุคอมเพล็กซ์ใหม่ที่จำเป็นสำหรับการกักเก็บและการตัดต่อ pre-mRNA ในนิวเคลียส พวกเขาได้ทำให้บริสุทธิ์คอมเพล็กซ์ไตรเมอร์ใหม่ที่ประกอบด้วยซับยูนิตอีก 3 ซับยูนิต (Snu17p, Bud13p และ Pml1p) และพบว่าซับยูนิตเหล่านี้ไม่จำเป็นต่อการอยู่รอด แต่จำเป็นสำหรับการตัดต่อ pre-mRNA อย่างมีประสิทธิภาพ (การกำจัดอินทรอน) ในปี 2006 Fleischer และคณะได้ระบุโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับคอมเพล็กซ์ไรโบโซมของยูคาริโอตอย่างเป็นระบบ^{[ 9 ]}พวกเขาใช้การคัดกรองโปรตีโอมิกส์ด้วยสเปกโทรเมตรีมวลหลายด้านเพื่อระบุคอมเพล็กซ์ไรโบโซมของยีสต์ จากนั้นใช้การติดแท็ก TAP เพื่อเชื่อมโยงโปรตีนทั้งหมดเหล่านี้เข้าด้วยกันในเชิงฟังก์ชัน

หลักการของการทำให้บริสุทธิ์แบบคู่ขนานของคอมเพล็กซ์โปรตีนหลายชนิดไม่ได้จำกัดอยู่เฉพาะการรวมกันของแท็ก CBP และ Protein A ที่ใช้ในงานดั้งเดิมของ Rigaut et al. (1999) เท่านั้น ตัวอย่างเช่น การรวมกันของแท็ก FLAG และ HA ได้ถูกนำมาใช้ตั้งแต่ปี 2000 โดยกลุ่มของ Nakatani ^{[ 10 ] [ 11 ]}เพื่อทำให้บริสุทธิ์คอมเพล็กซ์โปรตีนจำนวนมากจากเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม มีการเสนอการรวมกันของแท็กอื่นๆ อีกมากมายนับตั้งแต่มีการตีพิมพ์หลักการ TAP

• สื่อที่เกี่ยวข้องกับTandem affinity purification ใน Wikimedia Commons