DARPins ( คำย่อของdesigned ankyrin repeat proteins หรือโปรตีน ที่มีโครงสร้างซ้ำของแอนคิรินที่ออกแบบมา ) คือโปรตีนเลียนแบบแอนติบอดีที่ ได้รับการดัดแปลง ทางพันธุกรรม โดย ทั่วไปจะแสดงคุณสมบัติ การจับกับโปรตีนเป้าหมายที่มีความจำเพาะสูงและมีความสัมพันธ์สูง DARPins ได้มาจากโปรตีนที่มีโครงสร้างซ้ำของ แอนคิริน ตามธรรมชาติ ซึ่งเป็นหนึ่งในกลุ่มโปรตีนจับยึดที่พบได้บ่อยที่สุดในธรรมชาติ และมีหน้าที่หลากหลาย เช่น การส่งสัญญาณภายในเซลล์ การควบคุม และความสมบูรณ์ของโครงสร้างเซลล์ DARPins ประกอบด้วยโมดูลหรือโมทีฟซ้ำ อย่างน้อยสาม โมดูล โดยโมดูลที่อยู่ใกล้ปลาย N-terminal และ C-terminal มากที่สุดเรียกว่า "แคป" เนื่องจากทำหน้าที่ปกป้องแกนไฮโดรโฟบิกของโปรตีน จำนวนโมดูลภายในจะระบุด้วยตัวเลข (เช่น N1C, N2C, N3C, ...) ในขณะที่แคปจะระบุด้วย "N" หรือ "C" ตามลำดับ มวลโมเลกุลเช่น 14 หรือ 18 กิโลดาลตัน ( kDa ) สำหรับ DARPins ที่มีการทำซ้ำสี่ครั้ง (N2C) หรือห้าครั้ง (N3C) นั้นค่อนข้างเล็กเมื่อเทียบกับสารชีวภาพ (ประมาณ 10% ของขนาดของIgG )

DARPins ถือเป็นกลุ่มใหม่ของโปรตีนขนาดเล็กที่มีศักยภาพ เฉพาะเจาะจง และอเนกประสงค์ และถูกใช้เป็นเครื่องมือในการวิจัยการวินิจฉัยและการรักษา ต่างๆ ^{[ 1 ]} Molecular Partners AGบริษัทชีวเภสัชภัณฑ์ที่อยู่ในขั้นตอนการทดลองทางคลินิกและมีโมเลกุล DARPin หลายตัวอยู่ในขั้นตอนการพัฒนาทางคลินิกและก่อนคลินิก กำลังดำเนินการพัฒนา DARPin เพื่อการรักษาทั้งโดยการพัฒนาเองและร่วมกับพันธมิตร Athebio AG กำลังพัฒนาโครงสร้าง DARPin ให้ดียิ่งขึ้นโดยใช้แนวทางการร่วมมือกับพันธมิตร^{[ 2 ]}

นอกจากนี้ DARPins ยังสามารถใช้เป็น chaperone สำหรับการตกผลึกของโปรตีนที่ละลายได้และโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์ รวมถึงตัวรับที่เชื่อมโยงกับโปรตีน G (GPCRs) ไม่ว่าจะเป็นคู่พันธะหรือการรวมตัวที่แข็งแรงกับโปรตีนเป้าหมาย ซึ่งเป็นแนวคิดที่กำลังขยายไปสู่การกำหนดโครงสร้างโดย cryoEM ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

แพลตฟอร์ม DARPin ถูกค้นพบและพัฒนาขึ้นในห้องปฏิบัติการของAndreas Plückthunที่มหาวิทยาลัยซูริคประเทศสวิตเซอร์แลนด์ขณะศึกษาด้านวิศวกรรมและคลังแอนติบอดีรีคอมบิแนนท์^{[ 7 ]} DARPins ได้มาจากโปรตีนแอนคิรินที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ ซึ่งเป็นโปรตีนประเภทหนึ่งที่ทำหน้าที่เป็นตัวกลางใน การโต้ตอบระหว่างโปรตีนที่มีความสัมพันธ์สูงในธรรมชาติ

ไลบรารี DARPin ถูกออกแบบโดยการจัดเรียงลำดับของโมทีฟแอนคิรินซ้ำตามธรรมชาติหลายพันรายการ ( แต่ละรายการมี กรดอะมิโน ประมาณ 33 ตัว ) ร่วมกับการออกแบบตามโครงสร้างและวิธีการดีเอ็นเอลูกผสม^{[ 7 ]}โปรตีนเหล่านี้ประกอบด้วยหน่วยโครงสร้างที่ซ้ำกันซึ่งก่อตัวเป็นโดเมนโปรตีน ที่เสถียร พร้อมพื้นผิวการโต้ตอบเป้าหมายที่มีศักยภาพขนาดใหญ่ โดยทั่วไป DARPins ประกอบด้วยการทำซ้ำสี่หรือห้าครั้ง ซึ่งครั้งแรก (การทำซ้ำปิด N) และครั้งสุดท้าย (การทำซ้ำปิด C) ทำหน้าที่ปกป้องแกนโปรตีนที่ไม่ชอบน้ำจากสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำ DARPins สอดคล้องกับขนาดเฉลี่ยของโดเมนโปรตีนแอนคิรินซ้ำตามธรรมชาติ โปรตีนที่มีการทำซ้ำน้อยกว่าสามครั้ง (เช่น การทำซ้ำปิดและการทำซ้ำภายในหนึ่งครั้ง) จะไม่ก่อตัวเป็นโครงสร้างตติยภูมิ ที่เสถียรเพียงพอ ^{[ 8 ]}มวลโมเลกุลของ DARPin ขึ้นอยู่กับจำนวนการทำซ้ำทั้งหมด ดังแสดงในแผนภูมิต่อไปนี้:

มีการสร้าง ไลบรารีของ DARPins ที่มีสารตกค้างที่อาจเกิดการโต้ตอบกับเป้าหมายแบบสุ่มในระดับ DNA จากไลบรารีเหล่านี้ นักชีวเคมีสามารถเลือก DARPins เพื่อจับกับเป้าหมายที่ต้องการด้วยความสัมพันธ์ระดับ พิโคโมลาร์ และสามารถเลือกความจำเพาะได้โดยใช้การแสดงผลบนไรโบโซม^{[ 9 ]}หรือการแสดงผลบนฟาจ^{[ 10 ]}โดยใช้ลำดับสัญญาณที่อนุญาตให้มีการหลั่งแบบโคทรานสเลชัน^{[ 11 ]} DARPins สามารถออกแบบให้ทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นตัวรับตัวยับยั้ง ตัวกระตุ้นผกผันตัวยับยั้งเอนไซม์หรือตัวจับโปรตีนเป้าหมายอย่างง่าย^{[ 1 ]}

DARPins ถูกแสดงออกในไซโตพลาสซึมของEscherichia coliในระดับสูง (มากกว่า 10 กรัม/ลิตรในการหมัก, 1 กรัม/ลิตรในขวดเขย่า) ในรูปแบบที่ละลายได้^{[ 12 ]}โปรตีนแสดงความเสถียรต่อความร้อนและอุณหพลศาสตร์ สูง ( จุดกึ่งกลางของการเสียสภาพ : โดยปกติคือการคลายตัวที่สมดุล : ∆G > 9.5  กิโลแคลอรี/โมล ) เพิ่มขึ้นตามจำนวนการทำซ้ำที่เพิ่มขึ้น^{[ 7 ] [ 13 ] [ 14 ]} DARPins มีความเสถียรในซีรั่มเลือด ของมนุษย์ และสามารถออกแบบได้เพื่อไม่ให้มีเอพิโทปของ เซลล์ T

เนื่องจากมีความจำเพาะสูง ความเสถียร ศักยภาพ และความสัมพันธ์ที่ดี รวมถึงโครงสร้างที่ยืดหยุ่น DARPins จึงมีโหมดการจับแบบแข็ง^{[ 1 ] [ 9 ]}โครงสร้างแบบหลายความจำเพาะหรือหลายวาเลนซ์ที่สร้างขึ้นโดยการหลอมรวมทางพันธุกรรมแสดงให้เห็นว่า DARPins ที่หลอมรวมกันมีคุณสมบัติการจับที่คล้ายกับ DARPins โดเมนเดี่ยว^{[ 1 ]}การไม่มีซิสเทอีนในโครงสร้างทำให้สามารถออกแบบซิสเทอีนเฉพาะตำแหน่งได้ ทำให้สามารถเชื่อมต่อสารเคมีกับโมเลกุลได้ตรงตำแหน่ง กรดอะมิโนที่ไม่เป็นธรรมชาติสามารถนำมาใช้เพื่อจุดประสงค์เดียวกันได้^{[ 15 ]}

โดยศักยภาพแล้ว DARPins สามารถให้ประโยชน์ทางคลินิกได้โดยการเอาชนะข้อจำกัดของวิธีการรักษาแบบดั้งเดิม ซึ่งโดยทั่วไปจะมุ่งเป้าไปที่เส้นทางของโรคเพียงเส้นทางเดียว และอาจทำให้ประสิทธิภาพลดลง ในหลายกรณี ความซับซ้อนของโรคเกิดจากการควบคุมที่ผิดปกติของหลายเส้นทาง เทคโนโลยี DARPin สามารถนำมาใช้เพื่อสร้าง "multi-DARPins" ที่แตกต่างกันหลายพันตัวได้อย่างรวดเร็ว โดยที่โดเมนการจับจะเชื่อมต่อกัน (เช่น โดยตัวเชื่อม) ทำให้สามารถกำหนดเป้าหมายไปยังเส้นทางของโรคหลายเส้นทางได้ DARPins และ multi-DARPins ยังสามารถหลอมรวมกับองค์ประกอบที่ไม่ใช่ DARPin เช่น สารพิษ^{[ 16 ]}เพื่อสร้างยาบำบัดแบบกำหนดเป้าหมาย และการผลิตจะง่ายขึ้นเนื่องจาก DARPins มีความต้านทานต่อการรวมตัวกัน ความหลากหลายของรูปแบบและความแข็งแกร่งของ multi-DARPins ช่วยให้สามารถใช้วิธีการเชิงประจักษ์ (เช่น ผ่านการคัดกรองตามผลลัพธ์) เพื่อระบุ DARPins ที่มีศักยภาพในการออกฤทธิ์ในเส้นทางของโรคเฉพาะได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ประโยชน์ที่เป็นไปได้ของ DARPins ส่วนใหญ่เกิดจากลักษณะโครงสร้างและชีวฟิสิกส์ ขนาดที่เล็ก (14-18 kDa) เชื่อว่าจะช่วยให้สามารถแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้มากขึ้น และศักยภาพที่สูง (<5-100 pM) ทำให้ DARPins ออกฤทธิ์ได้ที่ความเข้มข้นต่ำ^{[ 17 ]} DARPins ละลายได้ที่ >100 g/L และความเสถียรและความสามารถในการละลายสูงถือเป็นคุณสมบัติที่พึงประสงค์สำหรับสารประกอบยา DARPins สามารถผลิตได้อย่างรวดเร็วและคุ้มค่า (เช่น จากE. coli ) คุณสมบัติทางเภสัชจลนศาสตร์ (PK) สามารถปรับได้โดยการรวมเข้ากับโมเลกุลที่ยืดอายุครึ่งชีวิต เช่น โพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG) หรือการจับกันของ DARPins กับอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ เนื่องจากคุณสมบัติทางชีวฟิสิกส์ที่เอื้ออำนวย^{[ 1 ]} DARPins จึงถือว่าสามารถพัฒนาได้สูงโดยใช้กระบวนการมาตรฐาน และอาจแสดงพฤติกรรมคลาสที่แข็งแกร่ง

DARPins ถูกใช้เป็นเครื่องมือวิจัย^{[ 1 ]}เป็นสารวินิจฉัย^{[ 17 ]}และเป็นสารบำบัด^{[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]} MP0112 ซึ่งเป็น DARPin ตัวแรกที่อยู่ในขั้นตอนการทดลองทางคลินิก เป็น สารยับยั้ง ปัจจัยการเจริญเติบโตของหลอดเลือด (VEGF) และได้เข้าสู่การทดลองทางคลินิกเพื่อรักษาโรคจอประสาทตาเสื่อมชนิดเปียก (wet AMD หรือที่รู้จักกันในชื่อ neovascular age-related macular degeneration) ^{[ 16 ]}และภาวะบวมน้ำที่จอประสาทตาจากเบาหวาน^{[ 22 ]}ในช่วงต้นปี 2010

ปัจจุบัน MP0112 กำลังอยู่ระหว่างการตรวจสอบในการทดลองทางคลินิกที่แตกต่างกัน 3 ครั้ง การทดลองสองครั้งแรกเป็นการศึกษาความปลอดภัยและประสิทธิภาพของ abicipar ในผู้ป่วย AMD ชนิดเปียก เพื่อสร้างความสามารถในการเปรียบเทียบระหว่างผู้ป่วยชาวญี่ปุ่นและผู้ป่วยที่ไม่ใช่ชาวญี่ปุ่น^{[ 18 ] [ 20 ]}การศึกษาครั้งที่สามคือการทดสอบความปลอดภัยและประสิทธิภาพของ abicipar ในผู้ป่วย DME ^{[ 19 ]}

ในเดือนกรกฎาคม พ.ศ. 2557 Molecular Partners ได้เริ่มการศึกษาในมนุษย์ครั้งแรกเพื่อตรวจสอบความปลอดภัย ความทนทาน และระดับในเลือดของ MP0250 ซึ่งเป็นตัวเลือก DARPin ตัวที่สอง ในผู้ป่วยมะเร็ง^{[ 21 ]}

บริษัท Molecular Partners AG มี DARPins เพิ่มเติมอีกหลายตัวที่อยู่ในขั้นตอนการพัฒนาทางคลินิกก่อนการใช้งานจริง โดยมีศักยภาพในการรักษาโรคต่างๆ หลากหลายด้าน รวมถึงจักษุวิทยา มะเร็งวิทยาภูมิคุ้มกันบำบัดมะเร็ง และภูมิคุ้มกันวิทยา