การแทรกแซง RNA ที่กำกับโดย DNA (ddRNAi) เป็น เทคนิค การปิดการทำงานของยีนที่ใช้โครงสร้าง DNAเพื่อกระตุ้น วิถี การแทรกแซง RNA (RNAi) ภายใน เซลล์ โครงสร้าง DNA ถูกออกแบบมาเพื่อแสดงRNA สองสายที่เสริมกันเอง โดยทั่วไปคือ RNA แบบแฮร์พินสั้น (shRNA) ซึ่งจะทำให้ยีน เป้าหมาย หรือยีนต่างๆ ถูกปิดการทำงานเมื่อได้รับการประมวลผล^{[ 1 ]} RNAใดๆรวมถึงmRNA ภายในเซลล์ หรือRNA ของไวรัสสามารถถูกปิดการทำงานได้โดยการออกแบบโครงสร้างเพื่อแสดง RNA สองสายที่เสริมกับmRNAเป้าหมาย ที่ต้องการ

^{กลไกนี้เพิ่งได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถทำงานในการรักษาเพื่อปิดการ ทำงาน}ของยีนที่ก่อให้เกิดโรคในแบบจำลองโรคต่างๆ รวมถึง^โรคไวรัสเช่นHIV [ ^{2 ]}ไวรัสตับอักเสบ B ^{[ 3 ]}หรือ ไวรัส ตับอักเสบ C [ ^{4 ]} และโรคที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนภายในร่างกาย เช่นมะเร็งปอดที่ดื้อยา^{[ 5 ]}อาการปวดเส้นประสาท [ ^{6 ] มะเร็ง}ระยะลุกลาม [ ^{7 ]}และ^โรคจอประสาทตาเสื่อม^{[ 8 ]}

ต่างจากRNA รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) ที่หมุนเวียนภายในเซลล์และปิดการทำงานของยีนชั่วคราว โครงสร้าง DNA จะถูกถอดรหัสอย่างต่อเนื่อง ทำให้มี siRNA ในเซลล์เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ซึ่งช่วยให้สามารถปิดการทำงานของยีนเป้าหมายได้ในระยะยาว ซึ่งมีศักยภาพที่จะก่อให้เกิดประโยชน์ทางคลินิกอย่างต่อเนื่องโดยลดการแทรกแซงทางการแพทย์^{[ 2 ] [ 4 ]}

รูปที่ 1 แสดงให้เห็นถึงโครงสร้าง DNA ddRNAi ที่พบได้บ่อยที่สุดซึ่งออกแบบมาเพื่อแสดงออก shRNA รูปนี้ประกอบด้วย ลำดับ โปรโมเตอร์ที่ขับเคลื่อนการแสดงออกของลำดับเซนส์และแอนติเซนส์ที่คั่นด้วยลำดับลูป ตามด้วยตัวยุติ การ ถอดรหัส ลำดับแอนติเซนส์ที่ประมวลผลจาก shRNA สามารถจับกับ RNA เป้าหมายและระบุการย่อยสลายได้ โครงสร้าง shRNA โดยทั่วไปจะเข้ารหัสลำดับเซนส์และแอนติเซนส์ที่มีความยาว 20–30 นิวคลีโอไทด์ความยืดหยุ่นในการออกแบบโครงสร้างเป็นไปได้ ตัวอย่างเช่น ตำแหน่งของลำดับเซนส์และแอนติเซนส์สามารถสลับกันได้ และการดัดแปลงและการเพิ่มเติมอื่นๆ สามารถเปลี่ยนแปลงการประมวลผล shRNA ภายในเซลล์ได้^{[ 9 ]}นอกจากนี้ ยังสามารถใช้ลำดับลูปโปรโมเตอร์และตัวยุติการถอดรหัสได้หลากหลาย^{[ 4 ​​]}

รูปแบบหนึ่งของสิ่งนี้คือมัลติคาสเซ็ต (รูปที่ 2b) ออกแบบมาเพื่อแสดง shRNA สองตัวขึ้นไป ซึ่งสามารถกำหนดเป้าหมายลำดับหลายลำดับสำหรับการย่อยสลายพร้อมกัน ซึ่งอาจเป็นประโยชน์ในสถานการณ์ต่างๆ เช่น เมื่อกำหนดเป้าหมายไวรัส ความแปรผันของลำดับตามธรรมชาติอาจทำให้ไซต์เป้าหมาย shRNA เดียวไม่สามารถจดจำได้ ป้องกันการย่อยสลาย RNA โครงสร้างมัลติคาสเซ็ตที่กำหนดเป้าหมายไซต์หลายไซต์ภายใน RNA ของไวรัสเดียวกันจะหลีกเลี่ยงปัญหานี้^{[ 4 ]}

การนำส่งดีเอ็นเอ ddRNAi เป็นความท้าทายสำคัญสำหรับการบำบัดด้วย RNAi มี เวกเตอร์ สำหรับการบำบัดด้วยยีน ที่ได้รับการอนุมัติทางการแพทย์จำนวนมาก ที่พัฒนาขึ้นเพื่อใช้ในการรักษา มีกลยุทธ์หลักสองประการในการอำนวยความสะดวกในการนำส่งดีเอ็นเอไปยังเซลล์เป้าหมาย ได้แก่ การใช้เวกเตอร์ไวรัสหรือ สารนำ ส่ง (transfection reagents) หลายประเภท

การส่งมอบโครงสร้าง ddRNAi ในร่างกายได้รับการพิสูจน์แล้วโดยใช้เวกเตอร์และสารเคมีหลากหลายชนิดที่มีเส้นทางการบริหาร (ROA) ^{ที่แตกต่างกัน [ 3 ] [ 4 ] [ 6 ] [ 8 ]}โครงสร้าง ddRNAi ยังได้รับการส่งมอบเข้าสู่เซลล์โฮสต์ภายนอกร่างกาย ได้สำเร็จ และจากนั้นจึงปลูกถ่ายกลับเข้าไปในโฮสต์ ^{[ 2 ] [ 7 ] [ 10 ]}

ตัวอย่างเช่น ในการทดลองทางคลินิกเฟส I ที่ศูนย์การแพทย์แห่งชาติซิตี้ออฟโฮป รัฐแคลิฟอร์เนีย ผู้ป่วยติดเชื้อ HIV สี่รายที่เป็นมะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิดไม่ใช่ฮอดจ์กินได้รับการรักษาสำเร็จด้วยเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด แบบออโตโลกัสที่ได้ รับการถ่ายทอดล่วงหน้าภายนอกร่างกายด้วยโครงสร้าง ddRNAi โดยใช้เวกเตอร์ไวรัสเลนติโครงสร้างนี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อแสดงออกถึง RNA บำบัดสามชนิด ซึ่งหนึ่งในนั้นคือ shRNA จึงสามารถต่อสู้กับการจำลองแบบของ HIV ได้สามวิธีที่แตกต่างกัน: ^{[ 2 ]}

• shRNA ซึ่งทำหน้าที่ยับยั้งการทำงานของยีน tat และ rev ในจีโนมของไวรัส HIV
• ไรโบไซม์ CCR5 ยับยั้งการเข้าสู่เซลล์ของไวรัส
• TAR คือ RNA ล่อเป้าที่ยับยั้งการเริ่มต้นการถอดรหัสของไวรัส

การแสดงออกของ shRNA อย่างต่อเนื่องได้รับการยืนยันในเซลล์ T เซลล์โมโนไซต์และเซลล์ Bมากกว่าหนึ่งปีหลังจากการปลูกถ่าย^{[ 2 ]}

Nervana เป็นโครงสร้าง V ที่อยู่ระหว่างการวิจัยซึ่งยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนไคเนส Cแกมมา (PKCγ) ซึ่งเป็นที่ทราบกันว่าเกี่ยวข้องกับอาการปวดเส้นประสาทและ ภาวะดื้อ ต่อมอร์ฟีน^{[ 6 ]}

มีการระบุลำดับ PKCγ ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ 2 ลำดับในสายพันธุ์แบบจำลองหลักทั้งหมดและมนุษย์ และมีการออกแบบทั้งแคสเซ็ต DNA เดี่ยวและคู่ในหลอดทดลองการแสดงออกของ PKCγ ถูกยับยั้งได้ถึง 80% เมื่อมีการส่งโครงสร้าง ddRNAi ที่คล้ายกันเข้าไปในไขสันหลังโดยใช้เวกเตอร์ไวรัสเลนติ พบว่าสามารถบรรเทาอาการปวดในแบบจำลองหนูที่เป็นโรคทางระบบประสาทได้^{[ 6 ]}

การพัฒนาความต้านทานต่อเคมีบำบัดเช่นแพคลิแทกเซลและซิสพลาตินในมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์เล็ก (NSCLC) มีความเกี่ยวข้องอย่างมากกับการแสดงออกของเบต้า III ทูบูลินที่ มากเกินไป การวิจัยโดยสถาบันมะเร็งเด็กแห่งออสเตรเลีย ( มหาวิทยาลัยนิวเซาท์เวลส์ ศูนย์วิจัยมะเร็งโลวี ) แสดงให้เห็นว่าการลดระดับเบต้า III ทูบูลินโดย ddRNAi ทำให้ การเติบโต ของเนื้องอก ช้าลง และเพิ่มความไวต่อเคมีบำบัดในแบบจำลองหนู^{[ 5 ]}

Tributarna เป็นดีเอ็นเอคาสเซ็ตสามชุดที่แสดงออกโมเลกุล shRNA สามโมเลกุล โดยแต่ละโมเลกุลจะกำหนดเป้าหมายไปที่เบต้า III ทูบูลินและยับยั้งการแสดงออกของมันอย่างรุนแรง การศึกษาในแบบจำลองหนูที่มีการปลูกถ่ายอวัยวะแบบออร์โธโทปิก ซึ่งส่งผ่านโครงสร้างนี้โดยใช้ เวกเตอร์ โพลีเอ ทิลีนิมีนที่ดัดแปลงแล้ว (jetPEI) ที่กำหนดเป้าหมายไปที่เนื้อเยื่อปอด กำลังดำเนินการอยู่

จีโนมของ ไวรัสตับอักเสบชนิดบี (HBV) มีเอนไซม์ ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสของตัวเองสำหรับการจำลองแบบ บริษัทไบโอมิกส์ ไบโอเทคโนโลยีส์ ได้ประเมินลำดับ siRNA ประมาณ 5,000 ลำดับของยีนนี้เพื่อหาประสิทธิภาพในการยับยั้งการแสดงออกของยีน โดยได้คัดเลือก 5 ลำดับสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม และพบว่ามีฤทธิ์ในการยับยั้งการแสดงออกของยีนเมื่อแปลงเป็นชุดการแสดงออกของ shRNA โครงสร้างแบบหลายชุดที่เรียกว่า Hepbarna กำลังอยู่ระหว่างการพัฒนาในระดับก่อนคลินิกสำหรับการนำส่งโดยใช้ เวกเตอร์ที่กำหนดเป้าหมายไปยังตับคือ ไวรัสอะเดโนแอสโซซิเอต 8 (AAV-8)

โรคกล้ามเนื้อเสื่อมโอคูโลฟาริงเจียล (OPMD) จัดเป็น โรคหายาก ปัจจุบันยังไม่มีการรักษาเนื่องจากเกิดจากการกลายพันธุ์ใน ยีน โปรตีนที่จับกับโพลี(A) นิวเคลียร์ 1 (PABPN1) การปิดกั้นยีนกลายพันธุ์โดยใช้ ddRNAi ถือเป็นแนวทางการรักษาที่มีศักยภาพ^{[ 11 ]}

นอกจากแนวทาง ex vivo ที่กล่าวถึงข้างต้นแล้ว ศูนย์การติดเชื้อและภูมิคุ้มกันแห่งอัมสเตอร์ดัม (CINIMA) ของมหาวิทยาลัยอัมสเตอร์ดัมประเทศเนเธอร์แลนด์ ยังทำการวิจัยอย่างกว้างขวางเกี่ยวกับศักยภาพในการรักษาของโครงสร้าง DNA แบบหลายคาสเซ็ตต์สำหรับ HIV ^{[ 12 ]}

เช่นเดียวกับการบำบัดด้วยยีน ทุกประเภท จำเป็นต้องมีการประเมินประเด็นด้านความปลอดภัยและความเป็นพิษหลายประการในระหว่างการพัฒนาเทคนิคการรักษาด้วย ddRNAi

เวกเตอร์การบำบัดยีนบางชนิดจะรวมเข้ากับจีโนมของโฮสต์ จึงทำหน้าที่เป็นสารก่อกลาย พันธุ์แบบแทรกซึม ปัญหานี้เป็นปัญหาเฉพาะกับเวกเตอร์เรโทรไวรัส ในยุคแรกๆ ซึ่งการแทรกซึมที่อยู่ติดกับยีนก่อมะเร็งส่งผลให้เกิดเนื้องอกต่อมน้ำเหลือง^{[ 13 ]}

เวกเตอร์ไวรัสอะดีโนแอสโซซิเอต (AAV) ถือว่ามีความเสี่ยงต่ำต่อการรวมเข้ากับจีโนมของโฮสต์ เนื่องจากการติดเชื้อ AAV ไม่ได้เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำให้เกิดมะเร็งในมนุษย์ แม้ว่าจะแพร่หลายในประชากรทั่วไปก็ตาม ยิ่งไปกว่านั้น การใช้เวกเตอร์ AAV ในทางคลินิกอย่างกว้างขวางก็ไม่มีหลักฐานบ่งชี้ถึงความเป็นสารก่อมะเร็งในขณะที่เวกเตอร์ไวรัสเลนติจะรวมเข้ากับจีโนม แต่ดูเหมือนว่าจะไม่มีแนวโน้มที่จะกระตุ้นการแสดงออกของยีนก่อมะเร็ง^{[ 14 ]}

ปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันต่อเวกเตอร์อะดีโนไวรัสส่งผลให้ผู้ป่วยเสียชีวิตในระหว่างการทดลองในมนุษย์ระยะแรก การติดตามตรวจสอบความเป็นพิษที่อาจเกิดขึ้นอย่างระมัดระวังในการทดสอบก่อนการใช้ในมนุษย์และการวิเคราะห์แอนติบอดีที่มีอยู่ก่อนแล้วต่อเวกเตอร์การบำบัดด้วยยีนในผู้ป่วยจะช่วยลดความเสี่ยงดังกล่าวได้

siRNA ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันผ่านการโต้ตอบกับตัวรับ Toll-like (TLR) ซึ่งนำไปสู่ การตอบสนอง ของอินเตอร์เฟรอน TLR เหล่านี้อยู่บนพื้นผิวด้านนอกของเซลล์ ดังนั้นโครงสร้าง ddRNAi ซึ่งถูกส่งตรงเข้าไปในพื้นที่ภายในเซลล์ จึงไม่คาดว่าจะกระตุ้นการตอบสนองดังกล่าว^{[ 15 ]}

การแสดงออกของ shRNA ในระดับสูงได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นพิษ กลยุทธ์ในการลดระดับการแสดงออกของ shRNA ^{[ 4 ]}หรือส่งเสริมการประมวลผล shRNA อย่างแม่นยำ^{[ 16 ]}สามารถบรรเทาปัญหานี้ได้

ในทางทฤษฎีแล้ว การปิดกั้นยีนโดยไม่ได้ตั้งใจซึ่งมีลำดับความคล้ายคลึงกับ shRNA ที่แสดงออกอาจเกิดขึ้นได้^{[ 17 ]}การคัดเลือกลำดับ shRNA อย่างระมัดระวังและการทดสอบโครงสร้างก่อนคลินิกอย่างละเอียดสามารถลดความเสี่ยงนี้ได้

• Rice, RR; Muirhead, AN; Harrison, BT; Kassianos, AJ; Sedlak, PL; Maugeri, NJ; Goss, PJ; Davey, JR; James, DE; Graham, MW (2005). "กลยุทธ์ที่เรียบง่ายและแข็งแกร่งสำหรับการสร้างโครงสร้าง RNA Interference ที่กำกับโดย DNA" RNA Interferenceวิธีการทางเอนไซม์วิทยา เล่มที่ 392 หน้า  405–419 doi : 10.1016/S0076-6879(04) 92024-1 ISBN 978-0-12-182797-7. PMID  15644195 .
• Liu, YP; Westerink, JT; Brake, O.; Berkhout, B. (2011). "เวกเตอร์เลนติไวรัสที่เหนี่ยวนำ RNAi สำหรับการบำบัดยีนต้าน HIV-1" Antiviral RNAiวิธีการทางชีววิทยาระดับโมเลกุล เล่มที่ 721 หน้า  293–311 doi : 10.1007 / 978-1-61779-037-9_18 ISBN 978-1-61779-036-2PMID 21431693​ ​