เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอ

เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอ
ผู้ผลิต	Roche , Illumina , Life Technologies , Beckman Coulter , Pacific Biosciences , MGI/BGI , Oxford Nanopore Technologies

เครื่องวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอเป็นเครื่องมือทางวิทยาศาสตร์ที่ใช้ในการทำให้ กระบวนการ วิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอ เป็นไปโดยอัตโนมัติ โดยเมื่อได้รับตัวอย่างดีเอ็นเอเครื่องวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอจะใช้ในการกำหนดลำดับของเบส ทั้งสี่ ได้แก่ G ( กัวนีน ), C ( ไซโตซีน ), A ( อะดีนีน ) และ T ( ไทมีน ) จากนั้นจะรายงานผลลัพธ์ออกมาเป็นสตริง ข้อความ เรียกว่า "รีด" เครื่องวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอบางชนิดอาจจัดเป็นเครื่องมือทางแสง ได้เช่นกัน เนื่องจากมันวิเคราะห์สัญญาณแสงที่เกิดจากฟลูออโรโครมที่ติดอยู่กับนิ วคลีโอไท ด์

เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติเครื่องแรก ซึ่งคิดค้นโดยLloyd M. Smithได้รับการแนะนำโดยApplied Biosystemsในปี 1987 ^{[ 1 ]}เครื่องนี้ใช้การจัดลำดับแบบ Sangerซึ่งเป็นเทคโนโลยีที่เป็นพื้นฐานของเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอ "รุ่นแรก" ^{[ 2 ] [ 3 ]} และทำให้ โครงการจีโนมมนุษย์เสร็จสมบูรณ์ในปี 2001 ^{[ 4 ]}เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอรุ่นแรกนี้โดยพื้นฐานแล้วเป็น ระบบ อิเล็กโทรโฟเรซิส อัตโนมัติ ที่ตรวจจับการเคลื่อนที่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ติดฉลาก ดังนั้น เครื่องจัดลำดับเหล่านี้จึงสามารถใช้ในการกำหนดจีโนไทป์ของเครื่องหมายทางพันธุกรรมได้เช่นกัน โดยที่ต้องการเพียงแค่กำหนดความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ (เช่นไมโครแซทเทลไลต์ , AFLP )

โครงการจีโนมมนุษย์กระตุ้นให้เกิดการพัฒนาแพลตฟอร์มที่มีราคาถูกกว่า มีประสิทธิภาพสูง และแม่นยำกว่า ซึ่งรู้จักกันในชื่อ เครื่องจัดลำดับรุ่นต่อไป ( Next Generation Sequencersหรือ NGS) เพื่อจัดลำดับจีโนมมนุษย์ แพลตฟอร์ม เหล่านี้ได้แก่ 454, SOLiDและIlluminaเครื่องจัดลำดับรุ่นต่อไปได้เพิ่มอัตราการจัดลำดับดีเอ็นเออย่างมาก เมื่อเทียบกับวิธีการ Sanger ก่อนหน้านี้ สามารถเตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอได้โดยอัตโนมัติในเวลาเพียง 90 นาที^{[ 5 ]}ในขณะที่สามารถจัดลำดับจีโนมมนุษย์ได้ด้วยความครอบคลุม 15 เท่าในเวลาเพียงไม่กี่วัน^{[ 6 ]}

เครื่องถอดรหัสลำดับดีเอ็นเอรุ่นที่สามที่ทันสมัยกว่า เช่น PacBio SMRTและOxford Nanoporeมีศักยภาพในการถอดรหัสลำดับโมเลกุลที่มีความยาวมาก เมื่อเทียบกับเทคโนโลยีที่อ่านลำดับสั้น เช่น Illumina SBS หรือ DNBSEQ ของ MGI Tech

เนื่องจากข้อจำกัดของเทคโนโลยีการจัดลำดับดีเอ็นเอ การอ่านของเทคโนโลยีเหล่านี้จำนวนมากจึงสั้นเมื่อเทียบกับความยาวของจีโนมดังนั้นการอ่านจึงต้องถูกประกอบเข้าด้วยกันเป็นคอนติ๊กที่ ยาวขึ้น ^{[ 7 ]}ข้อมูลอาจมีข้อผิดพลาดที่เกิดจากข้อจำกัดของเทคนิคการจัดลำดับดีเอ็นเอหรือข้อผิดพลาดระหว่างการขยายสัญญาณ PCRผู้ผลิตเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอใช้วิธีการต่างๆ มากมายในการตรวจจับว่ามีเบสดีเอ็นเอใดบ้าง โปรโตคอลเฉพาะที่ใช้ในแพลตฟอร์มการจัดลำดับที่แตกต่างกันมีผลกระทบต่อข้อมูลสุดท้ายที่สร้างขึ้น ดังนั้นการเปรียบเทียบคุณภาพข้อมูลและต้นทุนระหว่างเทคโนโลยีต่างๆ จึงเป็นงานที่ท้าทาย ผู้ผลิตแต่ละรายมีวิธีการของตนเองในการแจ้งข้อผิดพลาดและคะแนนการจัดลำดับ อย่างไรก็ตาม ข้อผิดพลาดและคะแนนระหว่างแพลตฟอร์มต่างๆ ไม่สามารถเปรียบเทียบกันได้โดยตรงเสมอไป เนื่องจากระบบเหล่านี้อาศัยวิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน การเลือกเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอและวิธีการที่ดีที่สุดจึงมักขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของการทดลองและงบประมาณที่มีอยู่^{[ 2 ]}

วิธี การจัดลำดับดีเอ็นเอครั้งแรกได้รับการพัฒนาโดย Gilbert (1973) ^{[ 8 ]}และ Sanger (1975) ^{[ 9 ]} Gilbert ได้นำเสนอวิธีการจัดลำดับโดยอาศัยการดัดแปลงทางเคมีของดีเอ็นเอ ตามด้วยการตัดที่เบสเฉพาะ ในขณะที่เทคนิคของ Sanger นั้นอาศัย การยุติสาย โซ่ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ วิธีการของ Sanger ได้รับความนิยมเนื่องจากมีประสิทธิภาพมากขึ้นและมีกัมมันตภาพรังสีต่ำ เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติเครื่องแรกคือ AB370A ซึ่งเปิดตัวในปี 1986 โดยApplied Biosystems AB370A สามารถจัดลำดับตัวอย่างได้พร้อมกัน 96 ตัวอย่าง 500 กิโลเบสต่อวัน และมีความยาวในการอ่านสูงสุดถึง 600 เบส นี่คือจุดเริ่มต้นของ "เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอรุ่นแรก" ^{[ 2 ] [ 3 ]}ซึ่งใช้การจัดลำดับแบบ Sanger ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ เรืองแสงและเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ประกบอยู่ระหว่างแผ่นกระจก - เจลแผ่น ความก้าวหน้าครั้งสำคัญถัดมาคือการเปิดตัว AB310 ในปี 1995 ซึ่งใช้พอลิเมอร์เชิงเส้นในหลอดแคปิลลารีแทนเจลแผ่นสำหรับการแยกสาย DNA โดยอิเล็กโทรโฟเรซิส เทคนิคเหล่านี้เป็นพื้นฐานสำหรับการทำโครงการจีโนมมนุษย์ ให้เสร็จสมบูรณ์ ในปี 2001 ^{[ 4 ]}โครงการจีโนมมนุษย์กระตุ้นให้เกิดการพัฒนาแพลตฟอร์มที่ราคาถูกกว่า มีประสิทธิภาพสูง และแม่นยำกว่า ซึ่งรู้จักกันในชื่อเครื่องจัดลำดับรุ่นต่อไป (Next Generation Sequencers หรือ NGS) ในปี 2005 454 Life Sciencesได้เปิดตัวเครื่องจัดลำดับ 454 ตามมาด้วย Solexa Genome Analyzer และ SOLiD (Supported Oligo Ligation Detection) โดย Agencourt ในปี 2006 Applied Biosystems เข้าซื้อกิจการ Agencourt ในปี 2006 และในปี 2007 Rocheซื้อ 454 Life Sciences ในขณะที่ Illumina ซื้อ Solexa Ion Torrent เข้าสู่ตลาดในปี 2010 และถูกซื้อกิจการโดย Life Technologies (ปัจจุบันคือThermo Fisher Scientific ) และBGIเริ่มผลิตเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอในประเทศจีนหลังจากเข้าซื้อกิจการComplete Genomicsภายใต้บริษัทใน เครือ MGIระบบ NGS เหล่านี้ยังคงเป็นที่นิยมมากที่สุดเนื่องจากมีต้นทุน ความแม่นยำ และประสิทธิภาพที่แข่งขันได้

เมื่อไม่นานมานี้ มีการเปิดตัวเครื่องถอดรหัสลำดับดีเอ็นเอรุ่นที่สาม วิธีการถอดรหัสลำดับที่ใช้โดยเครื่องถอดรหัสลำดับเหล่านี้ไม่จำเป็นต้องมีการขยายดีเอ็นเอ (ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส – PCR) ซึ่งช่วยเร่งกระบวนการเตรียมตัวอย่างก่อนการถอดรหัสลำดับและลดข้อผิดพลาด นอกจากนี้ ข้อมูลการถอดรหัสลำดับจะถูกเก็บรวบรวมจากปฏิกิริยาที่เกิดจากการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ในสายเสริมในแบบเรียลไทม์ บริษัทสองแห่งได้นำเสนอวิธีการที่แตกต่างกันในเครื่องถอดรหัสลำดับรุ่นที่สามของตน เครื่องถอดรหัสลำดับ ของ Pacific Biosciencesใช้เทคนิคที่เรียกว่า Single-molecule real-time (SMRT) ซึ่งข้อมูลการถอดรหัสลำดับจะถูกสร้างขึ้นจากแสง (ที่จับภาพโดยกล้อง) ที่ปล่อยออกมาเมื่อมีการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ลงในสายเสริมโดยเอนไซม์ที่มีสีย้อมเรืองแสงบริษัท Oxford Nanopore Technologiesเป็นอีกบริษัทหนึ่งที่กำลังพัฒนาเครื่องถอดรหัสลำดับรุ่นที่สามโดยใช้ระบบอิเล็กทรอนิกส์ที่ใช้เทคโนโลยีการตรวจ จับ นาโนพอเร

บริษัทต่างๆ ดังต่อไปนี้ ได้พัฒนา ผลิต และจำหน่ายเครื่องถอดรหัสลำดับดีเอ็นเอ เป็นต้น

เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอ 454 เป็นเครื่องจัดลำดับรุ่นใหม่เครื่องแรกที่ประสบความสำเร็จในเชิงพาณิชย์^{[ 10 ]}พัฒนาโดย454 Life Sciencesและถูกซื้อโดยRocheในปี 2550 454 ใช้การตรวจจับไพโรฟอสเฟตที่ปล่อยออกมาจาก ปฏิกิริยาของ ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสเมื่อเพิ่มนิวคลีโอไทด์ลงในสายพันธุ์แม่แบบ

Roche ผลิตระบบสองระบบโดยใช้เทคโนโลยีไพโรซีเควนซิง ได้แก่ ระบบ GS FLX+ และระบบ GS Junior ^{[ 11 ]}ระบบ GS FLX+ ให้ความยาวในการอ่านประมาณ 1,000 คู่เบส ในขณะที่ระบบ GS Junior ให้ความยาวในการอ่าน 400 คู่เบส^{[ 12 ] [ 13 ]}ระบบ 454 GS FLX Titanium ซึ่งเป็นรุ่นก่อนหน้าของ GS FLX+ เปิดตัวในปี 2551 โดยให้ผลลัพธ์ข้อมูล 0.7G ต่อการทำงานหนึ่งครั้ง มีความแม่นยำ 99.9% หลังจากการกรองคุณภาพ และความยาวในการอ่านสูงสุด 700 คู่เบส ในปี 2552 Roche เปิดตัว GS Junior ซึ่งเป็นเครื่องซีเควนเซอร์ 454 รุ่นตั้งโต๊ะที่มีความยาวในการอ่านสูงสุด 400 คู่เบส และมีการเตรียมไลบรารีและการประมวลผลข้อมูลที่ง่ายขึ้น

ข้อดีอย่างหนึ่งของระบบ 454 คือความเร็วในการทำงาน สามารถลดจำนวนคนทำงานลงได้ด้วยการเตรียมไลบรารีแบบอัตโนมัติและการทำ PCR แบบอิมัลชันแบบกึ่งอัตโนมัติ ข้อเสียของระบบ 454 คือมีแนวโน้มที่จะเกิดข้อผิดพลาดเมื่อประเมินจำนวนเบสในสายยาวของนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกัน ซึ่งเรียกว่าข้อผิดพลาดโฮโมพอลิเมอร์และเกิดขึ้นเมื่อมีเบสที่เหมือนกัน 6 ตัวขึ้นไปในแถวเดียวกัน^{[ 14 ]}ข้อเสียอีกประการหนึ่งคือราคาของสารเคมีค่อนข้างแพงกว่าเมื่อเทียบกับเครื่องจัดลำดับรุ่นต่อไปอื่นๆ

ในปี 2556 Roche ประกาศว่าจะปิดการพัฒนาเทคโนโลยี 454 และเลิกใช้เครื่องจักร 454 อย่างสมบูรณ์ในปี 2559 เมื่อเทคโนโลยีดังกล่าวไม่สามารถแข่งขันได้อีกต่อไป^{[ 15 ] [ 16 ]}

Roche ผลิตเครื่องมือซอฟต์แวร์จำนวนหนึ่งซึ่งได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลลำดับ 454 ^{[ 17 ]}เช่น

• GS Run Processorแปลงภาพดิบที่สร้างขึ้นจากลำดับการรันให้เป็นค่าความเข้ม^{[ 18 ]}กระบวนการนี้ประกอบด้วยสองขั้นตอนหลัก ได้แก่ การประมวลผลภาพและการประมวลผลสัญญาณ ซอฟต์แวร์ยังใช้การปรับมาตรฐาน การแก้ไขสัญญาณ การระบุเบส และคะแนนคุณภาพสำหรับแต่ละการอ่าน ซอฟต์แวร์จะส่งออกข้อมูลในรูปแบบไฟล์ Standard Flowgram Format (หรือ SFF) เพื่อใช้ในแอปพลิเคชันการวิเคราะห์ข้อมูล (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper หรือ GS Amplicon Variant Analyzer)
• GS De Novo Assemblerเป็นเครื่องมือสำหรับ การประกอบจีโนมทั้งหมด แบบ de novoที่มีขนาดสูงสุด 3GB จากข้อมูล shotgun reads เพียงอย่างเดียวหรือรวมกับข้อมูล paired end ที่สร้างโดย sequencers 454 นอกจากนี้ยังรองรับการประกอบทรานสคริปต์แบบ de novo (รวมถึงการวิเคราะห์) และการตรวจจับตัวแปรไอโซฟอร์มด้วย^{[ 17 ]}
• GS Reference Mapperจับคู่ลำดับการอ่านสั้นกับจีโนมอ้างอิงสร้างลำดับคอนเซนซัสซอฟต์แวร์สามารถสร้างไฟล์เอาต์พุตสำหรับการประเมิน ซึ่งระบุการแทรก การลบ และ SNP สามารถจัดการกับจีโนมขนาดใหญ่และซับซ้อนได้ทุกขนาด^{[ 17 ]}
• สุดท้ายนี้GS Amplicon Variant Analyzerจะจัดเรียงการอ่านจากตัวอย่างแอมพลิคอนเทียบกับข้อมูลอ้างอิง โดยระบุตัวแปร (เชื่อมโยงหรือไม่เชื่อมโยง) และความถี่ของตัวแปรเหล่านั้น นอกจากนี้ยังสามารถใช้เพื่อตรวจจับตัวแปรที่ไม่รู้จักและตัวแปรที่มีความถี่ต่ำได้อีกด้วย โดยมีเครื่องมือกราฟิกสำหรับการวิเคราะห์การจัดเรียง^{[ 17 ]}

Illuminaผลิตเครื่องจัดลำดับรุ่นใหม่หลายเครื่องโดยใช้เทคโนโลยีที่ได้มาจากManteia Predictive Medicineและพัฒนาโดย Solexa ^{[ 19 ]} Illumina ผลิตเครื่องจัดลำดับรุ่นใหม่หลายเครื่องโดยใช้เทคโนโลยีนี้ รวมถึง HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq และ HiScanSQ ซึ่งสามารถประมวลผลไมโครอาร์เรย์ได้ ด้วย ^{[ 20 ]}

เทคโนโลยีที่นำไปสู่เครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอเหล่านี้ได้รับการเผยแพร่ครั้งแรกโดย Solexa ในปี 2549 ในชื่อ Genome Analyzer ^{[ 10 ]} Illumina ซื้อ Solexa ในปี 2550 Genome Analyzer ใช้การจัดลำดับโดยวิธีการสังเคราะห์ รุ่นแรกผลิตได้ 1G ต่อรอบ ในปี 2552 ผลผลิตเพิ่มขึ้นจาก 20G ต่อรอบในเดือนสิงหาคมเป็น 50G ต่อรอบในเดือนธันวาคม ในปี 2553 Illumina ได้เปิดตัว HiSeq 2000 ซึ่งมีผลผลิต 200 และ 600G ต่อรอบ ซึ่งจะใช้เวลา 8 วัน เมื่อเปิดตัว HiSeq 2000 เป็นหนึ่งในแพลตฟอร์มการจัดลำดับที่ถูกที่สุด โดยมีราคา 0.02 ดอลลาร์ต่อล้านเบส ตามต้นทุนของ สถาบันจีโนมิก ส์ ปักกิ่ง

ในปี 2011 Illumina ได้เปิดตัวเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอแบบตั้งโต๊ะชื่อ MiSeq เมื่อเปิดตัว MiSeq สามารถสร้างข้อมูลได้ 1.5G ต่อรอบด้วยการอ่านแบบคู่ปลาย 150bp การจัดลำดับสามารถทำได้ภายใน 10 ชั่วโมงเมื่อใช้การเตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอแบบอัตโนมัติ^{[ 10 ]}

Illumina HiSeq ใช้เครื่องมือซอฟต์แวร์สองตัวในการคำนวณจำนวนและตำแหน่งของคลัสเตอร์ DNA เพื่อประเมินคุณภาพการจัดลำดับ: ระบบควบคุม HiSeq และเครื่องวิเคราะห์แบบเรียลไทม์ วิธีการเหล่านี้ช่วยประเมินว่าคลัสเตอร์ที่อยู่ใกล้เคียงรบกวนซึ่งกันและกันหรือไม่^{[ 10 ]}

Life Technologies (ปัจจุบันคือThermo Fisher Scientific ) ผลิตเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอภายใต้ แบรนด์ Applied BiosystemsและIon Torrent Applied Biosystems ผลิตแพลตฟอร์มการจัดลำดับรุ่นใหม่ SOLiD ^{[ 21 ]}และเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอแบบ Sanger เช่น 3500 Genetic Analyzer ^{[ 22 ]}ภายใต้แบรนด์ Ion Torrent Applied Biosystems ผลิตเครื่องจัดลำดับรุ่นใหม่สี่เครื่อง ได้แก่ Ion PGM System, Ion Proton System, Ion S5 และ Ion S5xl systems ^{[ 23 ]}เชื่อกันว่าบริษัทกำลังพัฒนาเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอแบบเส้นเลือดฝอยรุ่นใหม่ชื่อ SeqStudio ซึ่งจะวางจำหน่ายในช่วงต้นปี 2018 ^{[ 24 ]}

บริษัท Applied Biosystemsเข้าซื้อกิจการ SOLiD Systems ในปี 2549 SOLiD ใช้การจัดลำดับโดยการเชื่อมต่อและการเข้ารหัสฐานคู่ระบบ SOLiD รุ่นแรกเปิดตัวในปี 2550 โดยสร้างความยาวในการอ่าน 35bp และข้อมูล 3G ต่อรอบ หลังจากการอัปเกรดห้าครั้ง ระบบจัดลำดับ 5500xl ก็ได้เปิดตัวในปี 2553 ซึ่งเพิ่มความยาวในการอ่านเป็น 85bp อย่างมาก ปรับปรุงความแม่นยำได้ถึง 99.99% และสร้างข้อมูล 30G ต่อรอบ 7 วัน^{[ 10 ]}

ความยาวการอ่านที่จำกัดของ SOLiD ยังคงเป็นข้อจำกัดที่สำคัญ^{[ 25 ]}และในระดับหนึ่งได้จำกัดการใช้งานไว้เฉพาะการทดลองที่ความยาวการอ่านไม่สำคัญมากนัก เช่น การจัดลำดับใหม่และการวิเคราะห์ทรานสคริปโตม และเมื่อเร็ว ๆ นี้ ChIP-Seq และการทดลองเมทิลเลชัน^{[ 10 ]}เวลาในการเตรียมตัวอย่าง DNA สำหรับระบบ SOLiD เร็วขึ้นมากด้วยระบบอัตโนมัติในการเตรียมไลบรารีการจัดลำดับ เช่น ระบบ Tecan ^{[ 10 ]}

ข้อมูลพื้นที่สีที่สร้างโดยแพลตฟอร์ม SOLiD สามารถถอดรหัสเป็นเบส DNA เพื่อการวิเคราะห์เพิ่มเติมได้ อย่างไรก็ตาม ซอฟต์แวร์ที่พิจารณาข้อมูลพื้นที่สีดั้งเดิมจะให้ผลลัพธ์ที่แม่นยำกว่า Life Technologies ได้ออก BioScope ^{[ 26 ]}ซึ่งเป็นแพ็คเกจวิเคราะห์ข้อมูลสำหรับการจัดลำดับใหม่ ChiP-Seq และการวิเคราะห์ทรานสคริปโตม โดยใช้อัลกอริทึม MaxMapper เพื่อแมปการอ่านพื้นที่สี

Beckman Coulter (ปัจจุบันคือ Danaher ) เคยผลิตเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอแบบยุติสายโซ่และแบบอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบเส้นเลือดฝอยภายใต้ชื่อรุ่น CEQ รวมถึง CEQ 8000 ^{[ 27 ]}ปัจจุบันบริษัทผลิตระบบวิเคราะห์พันธุกรรม GeXP ซึ่งใช้การจัดลำดับแบบยุติด้วยสีย้อม [ ^{28 ] วิธี}นี้ใช้ เท อร์โมไซเคิลในลักษณะเดียวกับPCRในการทำให้ดีเอ็นเอแตกตัว จับคู่ และขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ทำให้ชิ้นส่วนที่จัดลำดับแล้วขยายใหญ่ขึ้น^{[ 29 ] [ 30 ]}

Pacific Biosciencesผลิตระบบการจัดลำดับ PacBio RS และ Sequel โดยใช้ วิธี การจัดลำดับแบบเรียลไทม์โมเลกุลเดี่ยวหรือ SMRT ^{[ 31 ]}ระบบนี้สามารถสร้างความยาวในการอ่านได้หลายพันคู่เบส ข้อผิดพลาดในการอ่านดิบที่สูงขึ้นจะได้รับการแก้ไขโดยใช้ฉันทามติแบบวงกลม ซึ่งอ่านสายเดียวกันซ้ำแล้วซ้ำเล่า หรือใช้กลยุทธ์การประกอบ ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม ^{[ 32 ]}นักวิทยาศาสตร์รายงานความแม่นยำ 99.9999% ด้วยกลยุทธ์เหล่านี้^{[ 33 ]}ระบบ Sequel เปิดตัวในปี 2015 ด้วยความจุที่เพิ่มขึ้นและราคาที่ต่ำลง^{[ 34 ] [ 35 ]}

เครื่องจัดลำดับ MinION ของ Oxford Nanopore Technologiesใช้ เทคโนโลยี การจัดลำดับนาโนพอเร ที่พัฒนาขึ้น เพื่อการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก^{[ 37 ]}อุปกรณ์มีความยาวสี่นิ้วและรับพลังงานจากพอร์ต USB MinION ถอดรหัส DNA โดยตรงเมื่อโมเลกุลถูกดึงด้วยอัตรา 450 เบส/วินาที ผ่านนาโนพอเรที่แขวนอยู่ในเมมเบรน^{[ 38 ]}การเปลี่ยนแปลงของกระแสไฟฟ้าบ่งชี้ว่ามีเบสใดอยู่ ในตอนแรก อุปกรณ์มีความแม่นยำ 60 ถึง 85 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับ 99.9 เปอร์เซ็นต์ในเครื่องจักรทั่วไป^{[ 39 ]}แม้แต่ผลลัพธ์ที่ไม่แม่นยำก็อาจมีประโยชน์เพราะสร้างความยาวในการอ่านที่ยาว^{[ 40 ]}ในช่วงต้นปี 2021 นักวิจัยจากมหาวิทยาลัยบริติชโคลัมเบียได้ใช้แท็กโมเลกุลพิเศษและสามารถลดอัตราข้อผิดพลาดของอุปกรณ์จาก 5 ถึง 15 เปอร์เซ็นต์ เหลือต่ำกว่า 0.005 เปอร์เซ็นต์ แม้ว่าจะจัดลำดับ DNA ที่ยาวหลายส่วนพร้อมกันก็ตาม^{[ 41 ]}มีผลิตภัณฑ์รุ่นต่อยอดอีกสองรุ่นที่พัฒนามาจาก MinION เครื่องแรกคือ GridION ซึ่งเป็นเครื่องจัดลำดับที่มีขนาดใหญ่กว่าเล็กน้อย สามารถประมวลผลเซลล์ไหล MinION ได้สูงสุด 5 เซลล์พร้อมกัน และเครื่องที่สองคือ PromethION ซึ่งใช้รูพรุนมากถึง 100,000 รูแบบขนาน เหมาะสำหรับการจัดลำดับปริมาณมาก^{[ 42 ]}

MGIผลิตเครื่องจัดลำดับดีเอ็นเอความเร็วสูงสำหรับการวิจัยทางวิทยาศาสตร์และการใช้งานทางคลินิก เช่น DNBSEQ-G50, DNBSEQ-G400 และ DNBSEQ-T7 ภายใต้เทคโนโลยี DNBSEQ ที่เป็นกรรมสิทธิ์^{[ 43 ]}โดยใช้ เทคโนโลยี การจัดลำดับดีเอ็นเอนาโนบอลและการสังเคราะห์ตัวยึดโพรบแบบผสมผสาน ซึ่งดีเอ็นเอนาโนบอล (DNBs) จะถูกโหลดลงบนชิปอาร์เรย์ที่มีรูปแบบผ่านระบบของเหลว และต่อมาจะมีการเพิ่มไพรเมอร์สำหรับการจัดลำดับลงในบริเวณอะแดปเตอร์ของ DNBs เพื่อการไฮบริดไดเซชัน DNBSEQ-T7 สามารถสร้างการอ่านแบบสั้นได้ในปริมาณมาก โดยสามารถจัดลำดับจีโนมมนุษย์ได้มากถึง 60 จีโนมต่อวัน^{[ 44 ]} DNBSEQ-T7 ถูกใช้เพื่อสร้างการอ่านแบบคู่ปลาย 150 bp โดยจัดลำดับ 30X เพื่อจัดลำดับจีโนมของ SARS-CoV-2 หรือ COVID-19 เพื่อระบุความโน้มเอียงทางพันธุกรรมในการเกิดโรค COVID-19 ที่รุนแรง^{[ 45 ]} นักวิจัยจาก China National GeneBankใช้เทคนิคใหม่ในการเรียง ลำดับไลบรารีแบบ PCR -free บนอาร์เรย์ DNBSEQ แบบ PCR-free ของ MGI เพื่อให้ได้ลำดับจีโนมทั้งหมดแบบ PCR -free อย่างแท้จริงเป็นครั้งแรก ^{[ 46 ]} MGISEQ-2000 ถูกนำมาใช้ในการเรียงลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยวเพื่อศึกษาพยาธิกำเนิดและการฟื้นตัวในผู้ป่วย COVID-19 ดังที่ตีพิมพ์ในNature Medicine ^{[ 47 ]}

เทคโนโลยีการถอดรหัสลำดับดีเอ็นเอในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่ามีผู้เล่นหลักคือIllumina (ธันวาคม 2019) ตามมาด้วยPacBio , MGIและOxford Nanopore