ในXenopus laevisการกำหนดชั้นเนื้อเยื่อต้นกำเนิดทั้งสามชั้น ( เอนโดเดิร์มเมโซเดิร์มและเอกโตเดิร์ม ) เกิดขึ้นในระยะบลาสตูลา^{[ 1 ]}มีความพยายามอย่างมากในการกำหนดปัจจัยที่กำหนดเอนโดเดิร์มและเมโซเดิร์ม ในทางกลับกัน มีเพียงไม่กี่ตัวอย่างของยีนที่จำเป็นสำหรับ การกำหนด เอกโตเดิร์มที่ได้รับการอธิบายไว้ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา โมเลกุลแรกที่ระบุว่าจำเป็นสำหรับการกำหนดเอกโตเดิร์มคือยูบิควิตินไลเกสEctodermin (Ecto, TIF1-γ, TRIM33) ต่อมาพบว่าเอนไซม์ดีบูบิควิตินเนตติ้งFAM/USP9xสามารถเอาชนะผลกระทบของการยูบิควิตินเนชันที่ทำโดย Ectodermin ใน Smad4 ได้ (Dupont et al., 2009) มีการเสนอปัจจัยการถอดรหัสสองตัวเพื่อควบคุมการแสดงออกของยีนเฉพาะของเอกโตเดอร์ม ได้แก่POU91/Oct3/4 ^{[ 2 ]}และFoxIe1/Xema [ ^{3 ] [ 4 ] ปัจจัย}ใหม่ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับเอกโตเดอร์มXFDL156ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีความสำคัญต่อการยับยั้งการแยกตัวของมีโซเดอร์มจากเซลล์ที่มีศักยภาพหลายอย่าง^{[ 5 ]}

โปรตีน Ectodermin ซึ่งถูกระบุครั้งแรกใน ตัวอ่อน Xenopusส่งเสริมการกำหนดชะตากรรมของเนื้อเยื่อชั้นนอกและยับยั้งการก่อตัวของเนื้อเยื่อชั้นกลางที่เกิดจากการส่งสัญญาณของTransforming Growth Factor β (TGFβ)และBone Morphogenic Proteins (BMP) ซึ่งเป็นสมาชิกของ TGFβ-superfamily ^{[ 6 ]}เมื่อลิแกนด์ TGFβ จับกับตัวรับ TGFβ จะทำให้เกิดการกระตุ้นตัวส่งสัญญาณ R-Smads ( Smad2 , Smad3 ) Smad4 สร้างคอมเพล็กซ์กับ R-Smads ที่ถูกกระตุ้นและกระตุ้นการถอดรหัสของยีนเฉพาะเพื่อตอบสนองต่อสัญญาณ TGFβ เส้นทาง BMP ส่งสัญญาณในลักษณะเดียวกัน แต่ผ่าน R-Smads ประเภทอื่น ( Smad1 , Smad5และSmad8 ) ปัจจัยการถอดรหัส Smad4 เป็นตัวกลางร่วมเพียงตัวเดียวที่ใช้ร่วมกันระหว่างเส้นทาง TGFβ และ BMP ^{[ 7 ]}ในระหว่างการกำหนดลักษณะของเอกโตเดิร์ม หน้าที่ของ Smad4 จะถูกควบคุมโดยการยูบิควิตินเนชันและการดีบูบิควิตินเนชันที่ทำโดยเอกโตเดิร์มมินและ FAM ตามลำดับ สถานะการยูบิควิตินเนชันของ Smad4 จะเป็นตัวกำหนดว่ามันสามารถตอบสนองต่อสัญญาณที่ได้จาก TGFβ และ BMP ได้หรือไม่^{[ 6 ] [ 8 ]}สมดุลของกิจกรรม ตำแหน่ง และจังหวะเวลาของตัวส่งสัญญาณ TGFβ และ BMP, Smad4, FAM และเอกโตเดิร์มมินควรเกิดขึ้นเพื่อให้สามารถปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนที่จำเป็นสำหรับการสร้าง ชั้นเนื้อเยื่อต้นกำเนิด ได้

ไลบรารีcDNAจากระยะบลาสตูลาของตัวอ่อนกบถูกโคลนลงในพลาสมิดแสดงออก RNA เพื่อสร้าง mRNA สังเคราะห์ จากนั้น mRNA ถูกฉีดเข้าไปใน ตัวอ่อน Xenopus หลายตัว ในระยะสี่เซลล์ และตรวจสอบใน ตัวอ่อน บลาสตูลา ตอนต้น เพื่อดูการขยายตัวของบริเวณเครื่องหมายเอกโตเดอร์มัลSox2และการลดลงของการแสดงออกของเครื่องหมายเมโซเดอร์มัลXbraเอกโตเดอร์มินเป็นหนึ่งใน 50 โคลนที่แสดงฟีโนไทป์นี้เมื่อฉีดเข้าไปในตัวอ่อน^{[ 6 ]}การระบุ FAM ทำได้โดยการ คัดกรอง siRNAเพื่อค้นหาดีอุบิควิทิเนสที่ควบคุมการตอบสนองต่อ TGFβ

mRNA ของ Ectodermin ถูกส่งมาจากแม่ไปยังขั้วสัตว์ของไข่ ในระยะบลาสตูลาตอนต้นของเอ็มบริโอ mRNA และโปรตีนของ Ectodermin จะสร้างการไล่ระดับความเข้มข้นจากขั้วสัตว์ (ความเข้มข้นสูงสุด) ลงไปยังโซนขอบ (ความเข้มข้นต่ำสุด) เพื่อป้องกันสัญญาณ TGFβ และ nodalที่กระตุ้นเมโซเดอร์มที่มาจากขั้วพืช mRNA ของ Ectodermin มีความเข้มข้นสูงในด้านหลังของเอ็มบริโอ และเมื่อสิ้นสุดระยะนี้ การแสดงออกจะค่อยๆ หายไป^{[ 6 ]} Smad4 ถูกยูบิควิตินโดย Ectodermin ในนิวเคลียสและส่งออกไปยังไซโตพลาสซึมซึ่งสามารถถูกดีบูบิควิตินโดย FAM ด้วยวิธีนี้ Smad4 สามารถนำกลับมาใช้ใหม่และทำงานได้อีกครั้ง แม้ว่าจะไม่มีโปรไฟล์การแสดงออกของ FAM ในตัวอ่อนระยะแรกในXenopusแต่ในปลาซีบรา FAM homolog จะแสดงออกอย่างแพร่หลายในระยะสองเซลล์ แต่เมื่อการพัฒนาดำเนินต่อไปก็จะแสดงออกเฉพาะในระบบประสาทส่วนกลางของศีรษะเท่านั้น^{[ 9 ]}

Ectodermin เป็นยูบิควิติน E3 ไลเกสที่ยับยั้งวิถีการส่งสัญญาณ TGFβ และ BMP โดยการยับยั้ง Smad4 ผ่านการยูบิควิตินของไลซีน 519 และผ่านการจับกับฟอสโฟ-Smad2 โดยตรง^{[ 6 ] [ 8 ]}การฉีด Ecto mRNA ในบริเวณขอบทำให้เกิดการขยายตัวของเครื่องหมายเอ็กโทเดอร์มัลระยะเริ่มต้น Sox2 และการลดลงของเครื่องหมายเมโซเดอร์มัล (Xbra, Eomes , Vent-1, Mix-1 และ Mixer) ในทางตรงกันข้ามจะเกิดขึ้นในการทดลองน็อคดาวน์ของ Ectodermin โดยใช้กลยุทธ์มอร์โฟลิโน ตัวอ่อนจะไวต่อการตอบสนองของ Activin มากขึ้น แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นและการขยายตัวของการแสดงออกของยีนเฉพาะเมโซเดอร์มัล และลดการแสดงออกของแผ่นประสาทและเครื่องหมายหนังกำพร้า (Sox2 และไซโตเคราตินตามลำดับ) สอดคล้องกับกิจกรรมยูบิควิตินไลเกสที่ขึ้นอยู่กับ RING-finger ของ Ectodermin มิวแทนต์ RING-finger ของ Ecto (C97A/C100A) จะไม่ทำงานเมื่อเพิ่มฟังก์ชัน^{[ 6 ]}การเพิ่มฟังก์ชันของ FAM จะเพิ่มการตอบสนองจาก BMP และ TGFβ และการสูญเสียฟังก์ชันโดยการกลายพันธุ์ในสารตกค้างที่สำคัญต่อกิจกรรมของมันทำให้เกิดการยับยั้งการตอบสนองของ TGFβ

หน้าที่ระดับโมเลกุลของเอ็กโทเดอร์มินในมนุษย์ที่ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบของ Smad4 บ่งชี้ว่าหน้าที่เฉพาะนี้ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในสายพันธุ์สัตว์มีกระดูกสันหลัง^{[ 6 ]}ความเหมือนกันของลำดับระหว่างโฮโมล็อก FAM สูงกว่า 90% เมื่อเปรียบเทียบโฮโมล็อกของXenopus , ปลาซีบรา, หนู และมนุษย์ ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจได้รับการอนุรักษ์ไว้ในสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ด้วย^{[ 9 ]}อันที่จริง การปิดใช้งานยีนแบบน็อคเอาท์ในตัวอ่อนหนูแสดงให้เห็นว่าหน้าที่ของเอ็กโทเดอร์มินในฐานะตัวยับยั้งการส่งสัญญาณ TGF-beta ได้รับการอนุรักษ์ไว้^{[ 10 ]}ตัวอ่อนที่ขาดเอ็กโทเดอร์มินแสดงให้เห็นถึงการพัฒนาที่บกพร่องของเอนโดเดอร์มส่วนหน้า (AVE) ซึ่งเป็นเนื้อเยื่อแรกที่ถูกกระตุ้นโดยสัญญาณ TGF-beta ในตัวอ่อนหนู สอดคล้องกับการสูญเสียตัวยับยั้ง ตัวอ่อน ectodermin-/- แสดงให้เห็นการกระตุ้น AVE ที่ขยายใหญ่ขึ้น เนื่องจาก AVE เป็นแหล่งธรรมชาติของสารต้าน TGF-beta ที่หลั่งออกมา การขยายตัวของ AVE ในระยะแรกนี้จึงทำให้เกิดการยับยั้งลิแกนด์ TGF-beta นอกเซลล์ในระยะต่อมา ส่งผลให้ตัวอ่อนขาดการพัฒนาของมีโซเดอร์ม แบบจำลองนี้ได้รับการยืนยันโดยการค้นพบว่าตัวอ่อน ectodermin-/- สามารถกลับคืนสู่สภาพปกติ (AVE ปกติ การพัฒนาของมีโซเดอร์มปกติ) ได้โดยการลดปริมาณทางพันธุกรรมของลิแกนด์ TGF-beta หลักของตัวอ่อน คือ Nodal นอกจากนี้ การลบ ectodermin ออกจากเนื้อเยื่อเฉพาะส่วนของเอพิบลาสต์ (ซึ่งเป็นแหล่งกำเนิดของมีโซเดอร์ม แต่ไม่ใช่ AVE) ซึ่งเป็นการสนับสนุนบทบาทของ ectodermin ในฐานะสารยับยั้ง TGF-beta นั้น ทำให้ AVE ไม่ได้รับผลกระทบ แต่ในครั้งนี้กลับทำให้เกิดการขยายตัวของเซลล์มีโซเดอร์มส่วนหน้า ซึ่งบ่งชี้ถึงการตอบสนองต่อสัญญาณ TGF-beta ที่เพิ่มขึ้น โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้ได้ยืนยันด้วยเครื่องมือทางพันธุกรรมถึงบทบาทของเอ็กโทเดอร์มินในระดับเซลล์ในฐานะตัวยับยั้งการตอบสนองของ Smad4 ซึ่งเคยระบุไว้ก่อนหน้านี้ในตัวอ่อน Xenopus และเซลล์ไลน์ของมนุษย์

ในช่วงต้นของการพัฒนาในกบ Xenopusปัจจัยการถอดรหัส FoxI1e/Xema จะกระตุ้นการสร้างความแตกต่างของเซลล์ผิวหนังและยับยั้งยีนเฉพาะของเอนโดเดิร์มและเมโซเดิร์มในส่วนปลายของตัวอ่อน (Suri et al., 2005) มีการเสนอว่า FoxI1e ทำงานก่อนที่เอ็กโทเดิร์มจะแตกต่างไปเป็นผิวหนังและระบบประสาทส่วนกลาง

Mir และคณะ (2005) ระบุ FoxI1e (Xema) โดยคัดเลือกยีนที่ถูกควบคุมการแสดงออกลดลงภายใต้สัญญาณกระตุ้นการสร้างมีโซเดอร์มในเอกโตเดอร์มเมื่อเปรียบเทียบกับบริเวณพืชของ ตัวอ่อน บลาสตูลา ในระยะเริ่มต้น นอกจากนี้ยังพบการแสดงออกของยีนนี้ในระดับสูงในหมวกสัตว์ของตัวอ่อนที่ขาด VegT เมื่อเปรียบเทียบกับชนิดปกติ

mRNA ของ FoxI1e ถูกแสดงออกในระยะไซโกต (ระยะ 8.5) และมีระดับการแสดงออกที่สูงขึ้นในช่วงต้นของการเกิดแกสตรูเลชัน และคงระดับนั้นไว้ในนิวรูลา หางบัด จนถึงระยะลูกอ๊อดตอนต้น^{[ 4 ]} FoxI1e มีรูปแบบการแสดงออกแบบโมเสกที่แปลกประหลาด โดยจะแสดงออกครั้งแรกในเอกโตเดอร์มด้านหลัง และในขณะที่แกสตรูลาดำเนินไป การแสดงออกจะผ่านไปยังด้านท้อง และการแสดงออกจะถูกควบคุมลดลงในด้านหลังเมื่อแผ่นประสาทกำลังก่อตัว^{[ 11 ]} FoxI1e ขึ้นอยู่กับสัญญาณ BMP ในระยะนิวรูลา ซึ่งจำกัดตำแหน่งของ FoxI1e ไว้ที่ด้านท้องของเอกโตเดอร์ม

FoxI1e/Xema จัดอยู่ในกลุ่ม FoxI1 ซึ่งเป็นตระกูลปัจจัยถอดรหัสแบบ fork head ที่ทราบกันว่ามีส่วนร่วมในการสร้างเมโซเดิร์ม การพัฒนาตา^{[ 12 ]}และการกำหนดส่วนหัวด้านท้อง^{[ 13 ]}มีการเสนอว่า Notch และ/หรือNODALซึ่งแสดงออกในบริเวณพืช/เมโซเดิร์มของตัว อ่อน บลาสตูลา ในระยะแรก อาจเป็นตัวยับยั้ง FoxI1e ได้^{[ 3 ] [ 11 ]}

การยับยั้งการเจริญเติบโตของ mRNA ของ FoxI1e โดยมอร์โฟลิโนที่ปิดกั้นการต่อเชื่อมแสดงให้เห็นความผิดปกติในการพัฒนาของหนังกำพร้าและระบบชั้นใน และลดการแสดงออกของยีนเฉพาะของเอกโตเดิร์ม ในขณะที่การแสดงออกมากเกินไปของ FoxI1e ยับยั้งการก่อตัวของเมโซเดิร์มและเอนโดเดิร์ม โครงสร้างพืชก่อตัวเป็นมวลบลาสตูลาตอนปลายซึ่งโดยปกติจะก่อให้เกิดเอนโดเดิร์มและเมโซเดิร์ม เมื่อฉีดด้วย mRNA ของ FoxI1e พวกมันสามารถแสดงเครื่องหมายเฉพาะของเอกโตเดิร์ม (E-cadherin ของเอกโตเดิร์มทั้งหมด, ไซโตเคราตินของเยื่อบุผิว, เครื่องหมายยอดประสาท Slug และเครื่องหมายประสาท Sox-2) ในขณะที่เครื่องหมายของเอนโดเดิร์ม (เอนโดเดอร์มิน, Xsox17a) ลดลงในการแสดงออก^{[ 3 ] [ 4 ]}

โปรตีนp53จับกับโปรโมเตอร์ของยีนเมโซเดอร์มัลระยะเริ่มต้น^{[ 14 ]} p53 เป็นทรานสคริปต์ที่ฝากมาจากแม่ซึ่งสร้างคอมเพล็กซ์ปัจจัยการถอดรหัสกับ Smad2 และขับเคลื่อนการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำเมโซเดอร์มและการกระตุ้นยีนเป้าหมายของ TGFβ ^{[ 15 ]}โปรตีน นิวเคลียร์ นิ้วสังกะสี (Zn) XFDL159 ซึ่งแสดงออกในหมวกสัตว์ ทำหน้าที่เป็นปัจจัยเอกโตเดอร์มซึ่งกำหนดเอกโตเดอร์มโดยการยับยั้ง p53 จากการกระตุ้นยีนสำหรับการแยกความแตกต่างของเมโซเดอร์ม^{[ 5 ]}

การสร้างไลบรารี cDNA จากส่วนปลายของตัวอ่อนในระยะ 11.5 โคลนลงในเวกเตอร์การแสดงออกและสร้าง mRNA จากนั้นจึงฉีด RNA สังเคราะห์เข้าไปในตัวอ่อน และเก็บส่วนปลายของตัวอ่อนที่เก็บรวบรวมมาเพื่อ ทำการบำบัด ด้วยแอคติวิน Xbra ได้รับการกู้คืนโดยการเลือกโคลนที่ยับยั้งเครื่องหมายเมโซเดอร์มัล Xbra ^{[ 5 ]}

เนื่องจาก XFDL156 เป็นปัจจัยที่โต้ตอบกับ p53 ตำแหน่งของโปรตีนนี้จึงอยู่ในนิวเคลียส (Sasai et al., 2008) mRNA ของ XFDL156 ถูกฝากจากแม่และแสดงออกโดยไซโกต ไทม์ไลน์การแสดงออกของยีนแสดงให้เห็นระดับการแสดงออกที่สูงขึ้นในระยะแกสตรูลาตอนต้น และลดลงครึ่งหนึ่งในระยะแกสตรูลาตอนกลาง และการแสดงออกก็จางหายไปเมื่อถึงระยะที่ 20 ^{[ 5 ]}

โดเมนซิงค์ฟิงเกอร์ XFDR จับกับบริเวณควบคุมของ p53 ซึ่งตั้งอยู่ที่โดเมนปลายด้าน C และการแสดงออกของโดเมนนี้ไม่ได้รับผลกระทบจากการมีอยู่ของปัจจัยถอดรหัส activin, FoxI1e หรือ XLPOU91

การสูญเสียการทำงานของมอร์โฟลิโน ทำให้เกิดการแบ่งตัวของมีโซเดอร์มัลที่ไม่ถูกต้องในบริเวณเอกโตเดอร์มัล ซึ่งเกิดจากการปลดปล่อยเครื่องหมายมีโซเดอร์มัล (Xbra, VegT และ Mix.2) การเพิ่มการทำงานทำให้การแสดงออกของเครื่องหมายมีโซเดอร์มัลลดลง^{[ 5 ]}

โฮโมล็อกของมนุษย์และหนูของ XFDR156 สามารถเสริมการทำงานของ XFDR ในการโต้ตอบกับ p53 และยับยั้งไม่ให้ทำหน้าที่เป็นปัจจัยการถอดรหัส^{[ 5 ]}

• 
  การเหนี่ยวนำให้เกิดเอ็กโทเดิร์มในระยะบลาสตูลาตอนต้นในตัวอ่อนกบXenopus