การวัดแสงด้วยใยแก้วนำแสง
การวัดแสงด้วยไฟเบอร์ออปติกเป็น เทคนิค การถ่ายภาพแคลเซียมที่บันทึก กิจกรรม แคลเซียม (Ca 2+ ) ระดับ 'รวม' หรือระดับประชากร [ 1 ]จากเซลล์ชนิดเฉพาะภายในบริเวณสมองหรือเครือข่ายการทำงานเพื่อศึกษาวงจรประสาท[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]กิจกรรมแคลเซียมระดับประชากรสามารถสัมพันธ์กับงานด้านพฤติกรรม เช่น การเรียนรู้เชิงพื้นที่ การเรียกคืนความทรงจำ และพฤติกรรมที่มุ่งเป้าหมาย[ 7 ]เทคนิคนี้เกี่ยวข้องกับการผ่าตัดฝังใยแก้วนำแสงเข้าไปในสมองของสัตว์ที่มีชีวิต ประโยชน์สำหรับนักวิจัยคือใยแก้วนำแสงนั้นฝังได้ง่ายกว่า รุกล้ำน้อยกว่า และมีราคาถูกกว่าวิธีการวัดแคลเซียมแบบอื่น อีกทั้งยังมีน้ำหนักและความเครียดต่อสัตว์น้อยกว่าเมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์ขนาดเล็ก นอกจากนี้ยังช่วยให้สามารถถ่ายภาพบริเวณสมองที่ทำงานร่วมกันหลายบริเวณและบูรณาการกับเทคนิคทางประสาทวิทยาศาสตร์อื่นๆ ได้ ข้อจำกัดของการวัดแสงด้วยใยแก้วนำแสง ได้แก่ ความละเอียดระดับเซลล์และความละเอียดเชิงพื้นที่ต่ำ และข้อเท็จจริงที่ว่าสัตว์จะต้องถูกผูกติดกับมัดใยแก้วนำแสงที่แข็งแรง ซึ่งอาจส่งผลกระทบต่อพฤติกรรมตามธรรมชาติของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมขนาดเล็ก เช่น หนู
คำอธิบายทางเทคนิค
การวัดด้วยไฟเบอร์โฟโตเมตรีอาศัยการแสดงออกของตัวบ่งชี้แคลเซียม ที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (GECIs) เช่นGCaMP หรือ RCaMP ซึ่งสามารถกำหนดเป้าหมายไปยังเซลล์เฉพาะโดยใช้ โปรโมเตอร์เฉพาะเซลล์เช่นCa2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) และhuman synapsin (hSyn) ซึ่งให้การแสดงออกของเซลล์ประสาทกระตุ้นและเซลล์ประสาททั่วไปตามลำดับ[ 1 ]โปรโมเตอร์เหล่านี้สามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายเซลล์ประสาทชนิดต่างๆ รวมถึงเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ประสาทที่แสดงการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียม เช่นแอสโทรไซต์โดยใช้โปรโมเตอร์glial fibrillary acidic protein (GFAP) [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]ทั้งในเซลล์ประสาทและแอสโทรไซต์ กิจกรรมของเซลล์ในรูปแบบของศักย์ไฟฟ้าการปล่อยสารสื่อประสาท การเปลี่ยนแปลงในความยืดหยุ่นของไซแนปส์และการถอดรหัสยีนนั้นเชื่อมโยงกับการไหลเข้าของไอออน Ca 2+ [ 5 ]
การเปลี่ยนแปลงระดับแคลเซียมภายในเซลล์ที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมเหล่านี้ สามารถตรวจสอบได้โดยการใส่ GECI เข้าไปในเซลล์ เมื่อความเข้มข้นของไอออนแคลเซียมต่ำ GECI จะแสดงการเรืองแสงที่อ่อนหรือไม่เรืองแสงเลย หลังจากที่ไอออน ไหลเข้า โปรตีนเรืองแสงที่ GECI บรรจุอยู่ (เช่น mScarlet หรือGFP ) จะถูกกระตุ้นเมื่อมีการจับกับ Ca2 +การฉายแสงที่มีความยาวคลื่นที่ถูกต้องผ่านใยแก้วนำแสงไปยังโปรตีนเหล่านี้จะกระตุ้น GECI ที่เรืองแสงแล้ว ซึ่งจะปล่อยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นต่ำกว่า ( การเลื่อนของสโตกส์ ) จากนั้นโฟตอนเหล่านี้จะถูกส่งกลับผ่านใยแก้วนำแสงและถูกนับโดยตัวตรวจจับ
การเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนซ์สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมภายในเซลล์ตามสัดส่วน[ 12 ]ตัวบ่งชี้แคลเซียมที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการวัดด้วยไฟเบอร์โฟโตเมตรี (และ วิธีการถ่ายภาพ ในร่างกาย อื่นๆ ) คือ GCaMP6 แม้ว่า GECI เพิ่มเติมจะยังคงได้รับการพัฒนาอย่างต่อเนื่องด้วยสเปกตรัมฟลูออเรสเซนซ์ จลนศาสตร์ อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน และความไวต่อแคลเซียม ที่เป็นเอกลักษณ์ [ 13 ] [ 14 ]ตัวบ่งชี้เหล่านี้สามารถแสดงออกในสมองได้สองวิธีหลัก ได้แก่การแสดงออกของไวรัส[ 15 ]และสายพันธุ์หนูทรานส์เจ นิ ก[ 16 ]เมื่อเร็วๆ นี้ มีรายการตัวบ่งชี้เพิ่มมากขึ้นที่สามารถใช้ในการวัดสัญญาณเคมีต่างๆ เช่น dLight สำหรับบันทึก การส่งสัญญาณ โดปามีนหรือ OxLight สำหรับบันทึกโอเร็กซินเป็นต้น[ 15 ] [ 17 ] [ 18 ] GCaMP, RCaMP, dLight และตัวบ่งชี้อื่นๆ จะถูกกระตุ้นด้วยแหล่งกำเนิดแสงที่ความยาวคลื่น ที่เหมาะสม และปล่อยแสงของตัวเองออกมา ทำให้สามารถบันทึกการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมหรือสารสื่อประสาทได้ตลอดเวลา[ 3 ] [ 15 ] [ 19 ] [ 13 ] [ 20 ] [ 21 ]
ระบบการวัดแสงด้วยใยแก้วนำแสงได้รับการออกแบบมาเพื่อส่งคลื่นแสงกระตุ้นที่แม่นยำซึ่งจำเพาะต่อแคลเซียม (เช่น GCaMP) หรือตัวบ่งชี้สารสื่อประสาท (เช่น dLight) [ 3 ]แสงนี้เดินทางผ่านใยแก้วนำแสงไปยังใยแก้วนำแสงที่ฝังอยู่ในบริเวณสมองหรือบริเวณที่สนใจ ตัวบ่งชี้แคลเซียมซึ่งแสดงออกในลักษณะเฉพาะของเซลล์จะถูกกระตุ้นด้วยแสงนี้ และในทางกลับกันจะปล่อยสัญญาณของตัวเองออกมาซึ่งเดินทางกลับผ่านใยแก้วนำแสงเดียวกัน[ 3 ] [ 4 ] [ 22 ]สัญญาณการปล่อยที่รวบรวมได้เหล่านี้จะถูกแยกสเปกตรัมโดยกระจกไดโครอิก ผ่านตัวกรอง และโฟกัสไปที่โฟโตดีเทคเตอร์ กล้องวิทยาศาสตร์ หรือ PMT [ 3 ]สัญญาณที่รวบรวมได้แสดงถึงการเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนซ์ (ΔF) เมื่อเทียบกับค่าพื้นฐานเริ่มต้น (F) ในทางกลับกัน นักวิจัยสามารถสังเกตสัญญาณที่สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียม (ΔF/F) ข้อมูล อนุกรม เวลานี้สามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้ไปป์ไลน์โอเพ นซอร์สหลากหลาย เช่นpMAT [ 23 ] pyPhotometry [ 24 ]และGuPPy [ 25 ]
ที่สำคัญ สัญญาณ ไอโซสเบสติกเป็นสัญญาณที่ไม่ขึ้นกับแคลเซียม (เช่น ประมาณ 405-415 นาโนเมตร) ซึ่งแตกต่างจากความยาวคลื่นที่ขึ้นกับแคลเซียม (เช่น 470 นาโนเมตรสำหรับ GCaMP) เนื่องจาก GCaMP มีสองสถานะ คือ จับกับ Ca 2+และไม่จับกับ Ca 2+ ดังนั้นโครงสร้างโปรตีนทั้งสองจึงมีสเปกตรัมการกระตุ้นและการปล่อยแสงที่เป็นเอกลักษณ์ ความยาวคลื่นของการกระตุ้นที่ GCaMP มีการดูดกลืนแสงเท่ากันทั้งที่มีและไม่มี Ca 2+คือสัญญาณไอโซสเบสติกและกำหนดเส้นฐานการเรืองแสงที่ไม่ขึ้นกับแคลเซียม การเคลื่อนไหวของสัตว์และการเรืองแสงอัตโนมัติ ของเนื้อเยื่อ จะสะท้อนอยู่ในสัญญาณที่ไม่ขึ้นกับแคลเซียมนี้ และสามารถลบหรือถดถอยเพื่อเปิดเผยการเปลี่ยนแปลงที่แท้จริงของการเรืองแสงได้[ 26 ]
ตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (GECIs)
การแสดงออก
การแสดงออกที่เหมาะสมที่สุดของตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (GECIs) สามารถทำได้สองวิธี: เวกเตอร์ไวรัสอะดีโนแอสโซซิเอตและสายพันธุ์หนูแปลงพันธุกรรม[ 15 ] [ 16 ]การฉีดไวรัสต้องใช้การฉีด GECI เข้าไปในบริเวณสมองที่สนใจ [ 15 ] ไวรัสนี้สามารถกำหนดเป้าหมายให้ติดเชื้อเซลล์ชนิดเฉพาะได้โดยใช้โปรโมเตอร์เฉพาะเซลล์ เช่นCaMKIIและGFAPเพื่อกำหนดเป้าหมายเซลล์ประสาทกระตุ้นและแอสโทรไซต์ตามลำดับ วิธีนี้ทำให้สามารถบันทึกกิจกรรมประสาทจากประชากรย่อยของเซลล์ประสาทหรือเซลล์เกลียที่กำหนดทางพันธุกรรมผ่านใยแก้วนำแสงที่ฝังไว้ได้[ 1 ]การแสดงออกของไวรัสต้องใช้การไตเตรตการเจือจางเพื่อให้ได้การแสดงออกที่เหมาะสมที่สุดในสมอง ซึ่งอาจจำเป็นแทนการใช้สายพันธุ์หนูแปลงพันธุกรรมสำหรับการทดลองบางอย่าง การแสดงออกของ GECIs ยังสามารถทำได้โดยใช้สายพันธุ์แปลงพันธุกรรมที่ช่วยให้มีการแสดงออกอย่างแพร่หลายทั่วทั้งสมอง ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ของหนูหรือหนูแรต การแสดงออกอาจแตกต่างกันไปในแต่ละบริเวณของสมอง ซึ่งอาจก่อให้เกิดความท้าทายในระหว่างการบันทึก[ 16 ]
จีเคเอ็มพี
GCaMPเป็นตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (GECI) ซึ่งมักใช้ในวิธีการสร้างภาพหลายวิธี[ 19 ] GCaMP จะปล่อยแสงฟลูออเรสเซนต์เมื่อตัวบ่งชี้จับกับไอออนแคลเซียม (Ca 2+ ) สัญญาณแคลเซียมนี้เชื่อมโยงโดยตรงกับรูปแบบการตอบสนองของระบบประสาท การปล่อยสารสื่อประสาท และความตื่นตัวของเยื่อหุ้มเซลล์[ 27 ]ความยาวคลื่นกระตุ้นสำหรับ GCaMP และสัญญาณไอโซสเบสติกของมันอยู่ที่ประมาณ 470 นาโนเมตรและ 415 นาโนเมตร (สีน้ำเงิน) ตามลำดับ เป้าหมายคือการกระตุ้นด้วยแสงที่จุดดูดซับสูงสุดและ จุด ไอโซสเบสติกของตัวบ่งชี้ จุดไอโซสเบสติกของ GCaMP คือสัญญาณที่ไม่ขึ้นกับแคลเซียม ประมาณ 405-415 นาโนเมตร ซึ่งกำหนดจาก GCaMP ที่มีสถานะการทำงานสองสถานะ คือ จับกับไอออนแคลเซียมและไม่จับกับไอออนแคลเซียม สถานะทั้งสองนี้มีสเปกตรัมการกระตุ้นและการปล่อยแสงของโปรตีนที่ไม่ซ้ำกัน ความยาวคลื่นของการกระตุ้นที่สถานะโปรตีนทั้งสองนี้มีการดูดกลืนแสงเท่ากันคือจุดไอโซสเบสติกและกำหนดฟลูออเรสเซนซ์พื้นฐาน การเคลื่อนไหวและออโตฟลูออเรสเซนซ์สะท้อนให้เห็นในสัญญาณที่ไม่ขึ้นกับแคลเซียมนี้ และสามารถลบหรือถดถอยเพื่อเปิดเผยการเปลี่ยนแปลงที่แท้จริงของฟลูออเรสเซนซ์ของเซลล์ในระหว่างภารกิจทางพฤติกรรมหรือการจัดการทดลอง[ 26 ]
ความยาวคลื่นการปล่อยแสงของ GCaMP อยู่ที่ประมาณ 525 นาโนเมตร (สีเขียว) ซึ่งสามารถวิเคราะห์และหาความสัมพันธ์ได้ตลอดช่วงเวลาในการทำภารกิจทางพฤติกรรม
การวัดแสงด้วยใยแก้วนำแสงหลายสี
เพื่อสังเกตพลวัตของแคลเซียมพร้อมกันในเซลล์หลายประเภท นักวิจัยได้รวม GECI สองตัวขึ้นไปในบริเวณสมองเดียวกัน[ 3 ] [ 28 ]ตัวอย่างเช่น กลุ่มวิจัยได้บันทึกการเรืองแสงจาก GECI สีเขียวและสีแดง GCaMP6f และ jRGECO1a ซึ่งแสดงออกแตกต่างกันในเซลล์ประสาทแบบมีหนามที่เส้นทางตรงและทางอ้อมของ striatal ในหนูที่เคลื่อนไหวได้อย่างอิสระ[ 29 ]การแสดงออกของ GECI หลายตัวในบริเวณสมองเดียวกันไม่เพียงแต่สามารถทำได้ในเซลล์ประสาทสองชุด ดังที่แสดงในงานวิจัยก่อนหน้านี้ การบันทึกแคลเซียมจำนวนมากพร้อมกันนี้ยังสามารถทำได้กับเซลล์หลายประเภท เช่น เซลล์ประสาทและเซลล์แอสโทรไซต์ เซลล์ประเภทเหล่านี้แสดงโปรโมเตอร์เฉพาะ เช่น GFAP และ hSyn และสามารถกำหนดเป้าหมาย GECI ได้อย่างเฉพาะเจาะจงด้วยวิธีนี้ กลุ่มวิจัยอีกกลุ่มหนึ่งประสบความสำเร็จในการวัดแสงด้วยไฟเบอร์แบบสองสีโดยใช้โปรโมเตอร์เฉพาะของเซลล์แอสโทรไซต์และเซลล์ประสาทในขณะที่หนูทำ ภารกิจ ความจำในการทำงาน (T-maze) อย่างอิสระ [ 30 ]
อุปกรณ์
เป้าหมายของการวัดด้วยใยแก้วนำแสงคือการส่ง สกัด และบันทึกสัญญาณแคลเซียมจำนวนมากจากกลุ่มเซลล์เฉพาะภายในบริเวณสมองที่สนใจอย่างแม่นยำ เพื่อเข้าถึงสัญญาณ ต้องฝังท่อ/ใยแก้วนำแสงด้วยวิธีการผ่าตัดที่ตำแหน่งการแสดงออกของ GECI ใยแก้วนำแสงนี้สามารถรวบรวมสัญญาณแคลเซียมในระดับประชากรเท่านั้น ไม่ใช่กิจกรรมของเซลล์แต่ละเซลล์[ 1 ]นอกจากนี้ ใยแก้วนำแสงยังช่วยให้สามารถบันทึกจากโครงสร้างสมองทั้งส่วนลึกและส่วนตื้น และลดความเสียหายของเนื้อเยื่อให้น้อยที่สุด ซึ่งแตกต่างจากเลนส์ GRIN หรือหน้าต่างคอร์เท็กซ์
GCaMPมีสเปกตรัมการกระตุ้นและการปล่อยแสงจำเพาะที่ประมาณ 470 นาโนเมตรและ 530 นาโนเมตร ตามลำดับ[ 27 ] แหล่งกำเนิดแสง LEDเป็นหนึ่งในแหล่งกำเนิดแสงที่นิยมใช้มากที่สุด เนื่องจากกำลังแสง ต่ำ ที่จำเป็นในการกระตุ้น GECI การส่งสัญญาณการกระตุ้นและการปล่อยแสงแบบสองทิศทางจากสมองไปยังอุปกรณ์สร้างภาพนั้นได้รับการประสานงานโดยกระจกไดโครอิกและตัวกรองการกระตุ้น/การปล่อยแสง อุปกรณ์สร้างภาพมีสามประเภทที่แตกต่างกัน ได้แก่โฟโตดีเท คเตอร์ หลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ (PMT)และกล้อง วิทยาศาสตร์ เมื่อเก็บสัญญาณจากบริเวณสมองเดียว มักจะใช้โฟโตดีเทคเตอร์หรือ PMT เนื่องจากสามารถรับสัญญาณได้อย่างรวดเร็วและมีอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (SNR) สูง ในทางกลับกัน เมื่อเก็บสัญญาณจากหลายบริเวณสมอง จะต้องใช้กล้องวิทยาศาสตร์หรือโฟโตดีเทคเตอร์หรือ PMT หลายตัว
โดยรวมแล้ว ระบบนี้ช่วยให้สามารถเชื่อมต่อระหว่างท่อส่งแสง แหล่งกำเนิดแสง และอุปกรณ์สร้างภาพได้ การส่งแสงไปยัง GECI อย่างแม่นยำนั้นทำได้โดยท่อส่งแสง/ใยแก้วนำแสง และสัญญาณการปล่อยแสงจะถูกรวบรวมโดยอุปกรณ์สร้างภาพในระหว่างการบันทึก
ตัวอย่างของระบบวัดแสงด้วยใยแก้วนำแสงที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ได้แก่Neurophotometrics , InscopixและMightexBio
ข้อดีและข้อจำกัด
วิธีการทางวิทยาศาสตร์ทุกวิธีล้วนมีข้อควรพิจารณาที่ต้องคำนึงถึงก่อนนำไปใช้ การวัดด้วยใยแก้วนำแสงมีข้อดีหลายประการเหนือกว่าเทคนิคอื่นๆ สำหรับการถ่ายภาพแคลเซียม แต่ก็มีข้อจำกัดอยู่เช่นกัน
ประโยชน์
สำหรับบุคคลในห้องปฏิบัติการที่ต้องการบูรณาการการถ่ายภาพแคลเซียมเข้ากับการทดลองของตน แต่อาจยังไม่มีงบประมาณหรือเงื่อนไขทางเทคนิคที่เพียงพอ การวัดด้วยใยแก้วนำแสงเป็นวิธีการที่เข้าถึงได้ง่าย ใยแก้วนำแสงนั้นง่ายต่อการฝัง ไม่รุกราน และมีราคาถูกกว่าวิธีการวัดแคลเซียมอื่นๆ เช่น การถ่ายภาพด้วยโฟตอนหนึ่งหรือสองตัว[ 14 ]เหมาะสำหรับแบบจำลองพฤติกรรมระยะยาว[ 31 ]เนื่องจากมีน้ำหนักและความเครียดต่อสัตว์น้อยกว่าเมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์ขนาดเล็ก วิธีนี้จำกัดการเคลื่อนไหวของสัตว์น้อยกว่าวิธีการอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญ ทำให้สัตว์ทดลองสามารถเคลื่อนไหวได้อย่างอิสระและมีพฤติกรรมที่เป็นธรรมชาติมากขึ้นในแบบจำลองหนูขนาดใหญ่ เป็นเทคนิคอเนกประสงค์ที่ช่วยให้สามารถถ่ายภาพบริเวณสมองที่โต้ตอบกันหลายบริเวณและบูรณาการกับออปโตเจเนติกส์[ 32 ]สรีรวิทยาไฟฟ้า[ 33 ]และเทคนิคทางประสาทวิทยาศาสตร์ระดับระบบอื่นๆ เมื่อไม่นานมานี้ เทคนิคนี้สามารถเชื่อมโยงกับตัวบ่งชี้เรืองแสงอื่นๆ สำหรับกิจกรรมของสารสื่อประสาทหรือการเปลี่ยนแปลงค่า pH ได้[ 15 ] [ 21 ]
ข้อจำกัด
เมื่อวางแผนการทดลอง สิ่งสำคัญคือต้องพิจารณาข้อจำกัดหลักของการวัดแสงด้วยไฟเบอร์โฟโตเมตรี นั่นคือ ความละเอียดของเซลล์และพื้นที่ต่ำ การขาดความละเอียดทางแสง นี้ อาจเกิดจากการรวบรวมกิจกรรมที่กระจุกตัวอยู่ภายในขอบเขตการมองเห็น ทำให้สามารถสังเกตการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ได้เพียง 'โดยรวม' เท่านั้น[ 5 ]แม้ว่าขนาดของท่อส่งแสงจะมีขนาดเล็กกว่าเทคโนโลยีที่ใช้ในวิธีการสร้างภาพแคลเซียมอื่นๆ เช่น กล้องจุลทรรศน์แบบหนึ่งโฟตอนและสองโฟตอน แต่สัตว์จะต้องถูกผูกติดกับมัดไฟเบอร์ที่แข็งแรงอย่างแน่นหนา[ 1 ]ซึ่งอาจจำกัดพฤติกรรมตามธรรมชาติของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมขนาดเล็ก เช่น หนู
การบูรณาการกับวิธีการอื่นๆ
ออปโตเจเนติกส์และ DREADDs
การวัดแสงด้วยไฟเบอร์โฟโตเมตรีสามารถบูรณาการกับการจัดการเซลล์เพื่อสร้างความเชื่อมโยงเชิงสาเหตุระหว่างกิจกรรมของระบบประสาทและพฤติกรรม การปรับเปลี่ยนเป้าหมายของเซลล์และส่วนยื่นที่กำหนดไว้ในสมองสามารถทำได้โดยใช้ออปโตเจเนติกส์หรือตัวรับที่ออกแบบมาโดยเฉพาะซึ่งถูกกระตุ้นโดยยาที่ออกแบบมาโดยเฉพาะ (DREADDs) [ 14 ] วิธีการนี้ถูกเลือกโดยพิจารณาจากความแม่นยำเชิงเวลาที่จำเป็นสำหรับการออกแบบการทดลอง รวมถึงปัจจัยอื่นๆ ออปโตเจเนติกส์ช่วยให้สามารถจัดการเซลล์ประเภทเฉพาะด้วยความแม่นยำเชิงเวลาสูง DREADDs มีความแม่นยำเชิงเวลาต่ำกว่ามากเนื่องจากเภสัชจลนศาสตร์ของลิแกนด์ เช่นโคลซาพีน-เอ็น-ออกไซด์ (CNO) [ 34 ]หรือเดสคลอโรคโลซาพีน (DCZ) [ 35 ]สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือ การอ่านค่าทางแสงพร้อมกันและการจัดการออปโตเจเนติกส์มาพร้อมกับปัญหาที่อาจเกิดขึ้นหลายประการซึ่งจะกล่าวถึงต่อไป[ 32 ]
สรีรวิทยาไฟฟ้าในร่างกาย
นอกจากนี้ การวัดแสงด้วยไฟเบอร์ยังสามารถเชื่อมโยงกับสรีรวิทยาไฟฟ้า ใน ร่างกาย ภายในสัตว์ตัวเดียวกันได้[ 33 ]เมื่อรวมกันแล้ว การบันทึกสรีรวิทยาไฟฟ้าและการถ่ายภาพแคลเซียมแบบผสมผสานนี้สามารถใช้เพื่อสังเกตกิจกรรมเฉพาะประเภทเซลล์ด้วยการอ่านค่าศักยภาพการกระทำของเซลล์ประสาทที่มีความแม่นยำเชิงเวลาสูงขึ้นในแบบจำลองสัตว์ที่มีพฤติกรรมอิสระ
ปัญหาและแนวทางแก้ไขที่เป็นไปได้
การส่งและการแสดงออกของโพรบออปโตเจเนติกส์และตัวบ่งชี้แคลเซียมไปยังเซลล์ประสาทเดียวกันอาจก่อให้เกิดปัญหาได้ ตัวบ่งชี้แคลเซียมและช่องทางการควบคุมอาจมีสเปกตรัมการกระตุ้นที่ทับซ้อนกัน เช่นGCaMPและแชนเนลโรดอปซิน (ChR2)ซึ่งทั้งคู่มีช่วงความยาวคลื่นสูงสุดของการกระตุ้นอยู่ที่ประมาณ 470 นาโนเมตร การกระตุ้นตัวบ่งชี้แคลเซียมอาจกระตุ้นช่องไอออนที่ไวต่อแสงของออปโตเจเนติกส์ได้ การเปลี่ยนแปลงของสัญญาณแคลเซียมที่วัดได้จึงไม่สามารถระบุได้ง่ายๆ ว่าเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมจริงหรือสัญญาณที่เกิดจากออปโตเจเนติกส์ วิธีแก้ปัญหานี้คือการใช้ตัวบ่งชี้ที่มีสเปกตรัมการกระตุ้นที่ไม่ทับซ้อนกับโพรบออปโตเจเนติกส์หรือตัวบ่งชี้แคลเซียม ตัวบ่งชี้แคลเซียม (GCaMP, RCaMP) และโพรบออปโตเจเนติกส์สำหรับการกระตุ้น (ChR2, Crimson) และการยับยั้ง ( eNpHR , Arch , Jaws) เป็นตัวเลือกสำหรับเรื่องนี้
วิธีการถ่ายภาพแคลเซียมแบบอื่นๆ
กล้องจุลทรรศณ์ขนาดเล็กและการถ่ายภาพด้วยโฟตอนเดี่ยว
มินิสโคป[ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ]เป็นกล้องจุลทรรศน์ขนาดเล็กที่ติดตั้งบนหัว ซึ่งช่วยให้สามารถถ่ายภาพกิจกรรมของเซลล์ประสาทจำนวนมากในหนูและหนูแรตที่เคลื่อนไหวได้อย่างอิสระ เป็นไปได้เนื่องจากขนาดที่เล็กและน้ำหนักเบาพอที่หนูหรือหนูแรตจะพกพาได้ง่ายโดยไม่รบกวนพฤติกรรมมากนัก นักวิจัยใช้มินิสโคปควบคู่กับเลนส์ดัชนีหักเหแบบไล่ระดับ (GRIN) ที่ฝังไว้ หรือหน้าต่างคอร์เท็กซ์ที่ช่วยให้สามารถถ่ายภาพสมองส่วนลึกและส่วนตื้นได้[ 38 ] [ 5 ] [ 40 ]วิธีนี้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจสอบกิจกรรมของเซลล์หลายร้อยเซลล์ที่กำหนดทางพันธุกรรมและตำแหน่งภายในสัตว์ตัวเดียว[ 37 ]เมื่อเปรียบเทียบกับการวัดแสงด้วยใยแก้วนำแสง มินิสโคปช่วยให้สามารถถ่ายภาพด้วยความละเอียดของเซลล์สูง ตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมภายในเซลล์ประสาทแต่ละเซลล์และเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ประสาท[ 36 ]นอกจากนี้ วิธีนี้ยังช่วยให้สามารถถ่ายภาพซ้ำๆ ได้ตลอดเวลาเพื่อวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงจากสภาวะ 'สุขภาพดี' ไปสู่สภาวะทางพยาธิวิทยาหรือการเปลี่ยนแปลงต่างๆ ตลอดช่วงพฤติกรรม[ 37 ]อย่างไรก็ตาม วิธีการถ่ายภาพนี้มีความไวต่ำและมีสัญญาณรบกวนสูง ทำให้ได้ภาพที่มีความละเอียดต่ำกว่าเมื่อเทียบกับวิธีการมัลติโฟตอนอื่นๆ เช่น ทูโฟตอน[ 7 ]กล้องจุลทรรศน์ขนาดเล็กเหล่านี้มีข้อจำกัดในความสามารถในการตรวจจับตัวบ่งชี้ที่มีการเลื่อนไปทางสีแดงไกล ซึ่งจำเป็นสำหรับการรวมกันของออปโตเจเนติกส์และการถ่ายภาพแคลเซียม ดังที่ได้กล่าวไว้ข้างต้น
การถ่ายภาพด้วยโฟตอนสองตัว
การถ่ายภาพด้วยโฟตอนสองตัว[ 41 ] [ 5 ]เป็นอีกวิธีหนึ่งในการถ่ายภาพแคลเซียมที่บันทึกความผันผวนของไดนามิก GECI ในเซลล์ วิธีนี้ช่วยให้สามารถทะลุผ่านเนื้อเยื่อสมองที่มีการกระเจิงแสงสูงได้ถึง 600-700 ไมครอนใต้พื้นผิวของสมอง[ 36 ] [ 42 ]เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิคอื่นๆ การถ่ายภาพด้วยโฟตอนสองตัวให้ความละเอียดเชิงพื้นที่ของเซลล์และระดับย่อยของเซลล์ที่สูงกว่า เช่น ภายในเดนไดรต์และปุ่มแอกซอน ภายในระนาบโฟกัสที่กำหนดไว้อย่างดี[ 36 ] [ 41 ]อย่างไรก็ตาม หากไม่มีความช่วยเหลือของท่อแสงหรือไมโครเอนโดสโคป วิธีนี้จะจำกัดอยู่เฉพาะบริเวณสมองส่วนตื้นๆ เท่านั้น[ 36 ] [ 43 ] [ 44 ]การถ่ายภาพประเภทนี้ยังต้องการให้สัตว์อยู่ในท่าที่ศีรษะคงที่ ซึ่งจำกัดพฤติกรรมตามธรรมชาติที่จำเป็นสำหรับงานพฤติกรรมที่ซับซ้อนบางอย่าง[ 41 ] [ 36 ]