ในปี 2546 จิลเลียน คลาร์ก นักเรียนมัธยมปลายที่กำลังฝึกงาน ได้ทำการตรวจสอบกฎดังกล่าว เธอพบว่าผู้ชาย 56% และผู้หญิง 70% ที่ทำการสำรวจคุ้นเคยกับกฎห้าวินาที นอกจากนี้ เธอยังพบว่าอาหารหลากหลายชนิดมีการปนเปื้อนอย่างมีนัยสำคัญแม้จะสัมผัสกับกระเบื้องที่ปนเปื้อนเชื้อE. coli เพียงช่วงเวลาสั้นๆ ในทางกลับกัน คลาร์กไม่พบหลักฐานการปนเปื้อนที่สำคัญบนพื้นสาธารณะ^{[ 6 ]}จากผลงานนี้ คลาร์กได้รับรางวัล Ig Nobel Prizeสาขาสาธารณสุข ประจำปี 2547 ^{[ 7 ]}

การศึกษาที่ละเอียดกว่าในปี 2550 โดยใช้เชื้อซัลโมเนลลาบนไม้ กระเบื้อง และพรมไนลอน พบว่าแบคทีเรียสามารถเจริญเติบโตได้ในสภาพแห้งแม้หลังจาก 28 วัน^{[ 8 ]}เมื่อทดสอบบนพื้นผิวที่ปนเปื้อนเชื้อซัลโมเนลลาเมื่อ 8 ชั่วโมงก่อนหน้านี้ แบคทีเรียยังคงสามารถปนเปื้อนขนมปังและ เนื้อ โบโลนได้ภายในเวลาไม่ถึง 5 วินาที แต่การสัมผัสนานหนึ่งนาทีจะเพิ่มการปนเปื้อนขึ้นประมาณ 10 เท่า (โดยเฉพาะบนพื้นผิวกระเบื้องและพรม) ^{[ 9 ]}

นักวิจัยจากมหาวิทยาลัยรัตเกอร์สได้หักล้างทฤษฎีนี้ในปี 2016 โดยการทดลองปล่อยชิ้นแตงโม ลูกอมเยลลี่ ขนมปังขาวธรรมดา และขนมปังทาเนย จากความสูง5 นิ้ว (13 เซนติเมตร)ลงบนพื้นผิวที่เคลือบด้วยแบคทีเรีย Enterobacter aerogenesพื้นผิวที่ใช้ ได้แก่ พรม กระเบื้องเซรามิก สแตนเลส และไม้ อาหารถูกทิ้งไว้บนพื้นผิวเป็นช่วงเวลา 5, 30 และ 300 วินาที นักวิทยาศาสตร์ประเมินปริมาณE. aerogenesที่ถ่ายโอนระหว่างพื้นผิวและอาหาร เนื่องจากแบคทีเรียมักถูกดึงดูดด้วยความชื้น อาหารเปียกจึงมีความเสี่ยงที่จะมีการถ่ายโอนแบคทีเรียมากกว่าอาหารแห้ง ที่น่าประหลาดใจสำหรับนักวิจัยคือ พรมถ่ายโอนแบคทีเรียน้อยกว่าเหล็กหรือกระเบื้อง ส่วนไม้เป็นเรื่องยากที่จะระบุได้แน่ชัด เนื่องจากมีความผันแปรสูง “กฎห้าวินาทีเป็นการทำให้ง่ายเกินไป อย่างมาก ของสิ่งที่เกิดขึ้นจริงเมื่อแบคทีเรียถ่ายโอนจากพื้นผิวไปยังอาหาร” โดนัลด์ ชาฟฟ์เนอร์ นักชีววิทยาจากมหาวิทยาลัยรัตเกอร์สและผู้เขียนงานวิจัยกล่าวในวอชิงตันโพสต์ “แบคทีเรียสามารถปนเปื้อนได้ทันที” ^{[ 10 ]} 

กุมารแพทย์วิจารณ์การศึกษาดังกล่าวว่ามองข้ามอันตรายจากการบริโภคอาหารหลังจากสัมผัสพื้นผิวอื่นๆ เช่น ที่จับตู้เย็น สวิตช์ไฟ และกระเป๋าสตางค์ ซึ่งพบว่ามีการปนเปื้อนของแบคทีเรียในลักษณะเดียวกัน^{[ 11 ]}

การศึกษาในปี 2014 โดยนักศึกษาชีววิทยาที่มหาวิทยาลัยแอสตันในประเทศอังกฤษชี้ให้เห็นว่าอาจมีพื้นฐานสำหรับกฎห้าวินาที^{[ 12 ]}แอนโทนี ฮิลตัน หัวหน้าภาควิชาจุลชีววิทยาที่มหาวิทยาลัยแอสตัน ระบุในปี 2017 ว่าอาหารที่ตกบนพื้นสะอาดเพียงไม่กี่วินาทีสามารถรับประทานได้โดยมีความเสี่ยงน้อยที่สุด^{[ 13 ]}ตามที่ฮิลตันกล่าว อาหารชื้นที่ถูกทิ้งไว้บนพื้นนานกว่า 30 วินาทีจะปนเปื้อนด้วยแบคทีเรียมากกว่าอาหารที่ถูกทิ้งไว้บนพื้นเพียง 3 วินาทีถึง 10 เท่า^{[ 14 ]}

The five-second rule was featured in an episode of the Discovery Channel series MythBusters, which discovered that there was no significant difference in the number of bacteria collected. The aspects that affect the contamination process is the moisture, surface geometry and the location.^[15] An episode of Food Detectives found that bacteria will cling to food immediately.^[16]