อ่าน 6 นาที
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบ ใช้ แสงที่ใช้ ฟลูออเรสเซน ซ์แทนหรือควบคู่ไปกับการกระเจิงการสะท้อน การลดทอนหรือการดูดกลืนเพื่อศึกษาคุณสมบัติของสาร อินทรีย์หรือ...
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบ ใช้ แสงที่ใช้ ฟลูออเรสเซน ซ์แทนหรือควบคู่ไปกับการกระเจิงการสะท้อน การลดทอนหรือการดูดกลืนเพื่อศึกษาคุณสมบัติของสาร อินทรีย์หรือ อนินทรีย์[ 1 ] [ 2 ] กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์คือกล้องจุลทรรศน์ใดๆ ที่ใช้ฟลูออเรสเซนซ์ในการสร้างภาพ ไม่ว่าจะเป็นการตั้งค่าอย่างง่าย เช่น กล้องจุลทรรศน์เอพิฟลูออเรสเซนซ์ หรือการออกแบบที่ซับซ้อนกว่า เช่น กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลซึ่งใช้การตัดภาพด้วยแสงเพื่อให้ได้ความละเอียดของภาพฟลูออเรสเซนซ์ที่ดีขึ้น[ 3 ]
หลักการ
ตัวอย่างจะถูกส่องสว่างด้วยแสงที่มีความยาวคลื่น เฉพาะ (หรือหลายความยาวคลื่น) ซึ่งถูกดูดซับโดยฟลูออโรฟอร์ทำให้ฟลูออโรฟอร์ปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกว่า (เช่น มีสีต่างจากแสงที่ถูกดูดซับ) แสงส่องสว่างจะถูกแยกออกจากแสงฟลูออเรสเซนซ์ที่ปล่อยออกมาซึ่งอ่อนกว่ามากโดยใช้ตัวกรองการปล่อยสเปกตรัม ส่วนประกอบทั่วไปของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ได้แก่ แหล่งกำเนิดแสง ( หลอดไฟซีนอนหรือหลอดไอปรอท เป็นที่นิยมใช้กัน รูปแบบที่ทันสมัยกว่าคือ LEDกำลังสูงและเลเซอร์ ) ตัวกรองการกระตุ้นกระจกไดโครอิก (หรือตัวแยกแสงไดโครอิก ) และตัวกรองการปล่อย (ดูรูปด้านล่าง) ตัวกรองและตัวแยกแสงไดโครอิกถูกเลือกให้ตรงกับลักษณะการกระตุ้นและการปล่อยสเปกตรัมของฟลูออโรฟอร์ที่ใช้ในการติดฉลากตัวอย่าง[ 1 ]ด้วยวิธีนี้ การกระจายของฟลูออโรฟอร์เดี่ยว (สี) จะถูกสร้างภาพในแต่ละครั้ง ภาพหลายสีของฟลูออโรฟอร์หลายประเภทจะต้องประกอบขึ้นโดยการรวมภาพสีเดียวหลายภาพเข้าด้วยกัน[ 1 ]
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่ที่ใช้งานอยู่เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบเอพิฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งการกระตุ้นฟลูออโรฟอร์และการตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์เกิดขึ้นผ่านทางเดินแสงเดียวกัน (เช่น ผ่านเลนส์วัตถุ) กล้องจุลทรรศน์เหล่านี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในทางชีววิทยาและเป็นพื้นฐานสำหรับการออกแบบกล้องจุลทรรศน์ขั้นสูงกว่า เช่นกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลและกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสะท้อนภายในทั้งหมด (TIRF)
กล้องจุลทรรศน์เอพิฟลูออเรสเซนซ์

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ใช้ในวิทยาศาสตร์ชีวภาพเป็นแบบเอพิฟลูออเรสเซนซ์ดังแสดงในแผนภาพ แสงที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นจะส่องสว่างตัวอย่างผ่านเลนส์วัตถุ แสงฟลูออเรสเซนซ์ที่ปล่อยออกมาจากตัวอย่างจะถูกโฟกัสไปยังตัวตรวจจับโดยเลนส์วัตถุเดียวกันกับที่ใช้ในการกระตุ้น ซึ่งหากต้องการความละเอียดสูงขึ้นจะต้องใช้เลนส์วัตถุที่มี ค่ารูรับ แสงเชิงตัวเลข สูงขึ้น เนื่องจากแสงกระตุ้นส่วนใหญ่ทะลุผ่านตัวอย่าง มีเพียงแสงกระตุ้นที่สะท้อนกลับเท่านั้นที่ไปถึงเลนส์วัตถุพร้อมกับแสงที่ปล่อยออกมา ดังนั้นวิธีการเอพิฟลูออเรสเซนซ์จึงให้ค่าอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง ตัวแยกแสงแบบไดโครอิกทำหน้าที่เป็นตัวกรองเฉพาะความยาวคลื่น โดยส่งผ่านแสงฟลูออเรสเซนซ์ไปยังช่องมองภาพหรือตัวตรวจจับ แต่สะท้อนแสงกระตุ้นที่เหลือกลับไปยังแหล่งกำเนิด
แหล่งกำเนิดแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ต้องการแสงสว่างที่เข้มข้นและเกือบจะเป็นสีเดียว ซึ่งแหล่งกำเนิดแสงทั่วไปบางชนิด เช่นหลอดฮาโลเจนไม่สามารถให้ได้[ 4 ]แหล่งกำเนิดแสงหลักสี่ประเภทที่ใช้ ได้แก่หลอดซีนอนหรือหลอดไอปรอทที่มีตัวกรองการกระตุ้นเลเซอร์ แหล่งกำเนิดแสง ซู เปอร์คอน ทินิวอัมและLED กำลังสูง เลเซอร์ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดสำหรับเทคนิคกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ที่ซับซ้อนกว่า เช่นกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสะท้อนภายในทั้งหมดในขณะที่หลอดซีนอน หลอดปรอท และ LED ที่มี ตัวกรองการกระตุ้น แบบได โครอิก มักใช้สำหรับกล้องจุลทรรศน์เอพิฟลูออเรสเซนซ์แบบไวด์ฟิลด์ การวางอาร์เรย์ ไมโครเลนส์สองชุดลงในเส้นทางการส่องสว่างของกล้องจุลทรรศน์เอพิฟลูออเรสเซนซ์แบบไวด์ฟิลด์[ 5 ]สามารถทำให้ได้ แสงสว่างที่สม่ำเสมอสูงด้วยค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวน 1-2%
การเตรียมตัวอย่าง

เพื่อให้ตัวอย่างเหมาะสมสำหรับการใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ ตัวอย่างนั้นต้องเรืองแสงได้ มีหลายวิธีในการสร้างตัวอย่างเรืองแสง เทคนิคหลักคือการติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสง หรือในกรณีของตัวอย่างทางชีวภาพการแสดงออกของโปรตีนเรืองแสง หรือ อาจใช้การเรืองแสงโดยธรรมชาติของตัวอย่าง (เช่นการเรืองแสงอัตโนมัติ ) ก็ได้ [ 1 ]ในวิทยาศาสตร์ชีวภาพ กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งช่วยให้สามารถย้อมสีตัวอย่างได้อย่างเฉพาะเจาะจงและไว เพื่อตรวจจับการกระจายตัวของโปรตีนหรือโมเลกุลอื่นๆ ที่น่าสนใจ ส่งผลให้มีเทคนิคการย้อมสีเรืองแสงของตัวอย่างทางชีวภาพที่หลากหลาย
สีย้อมเรืองแสงทางชีวภาพ
มีการออกแบบสีย้อมเรืองแสงจำนวนมากสำหรับโมเลกุลทางชีวภาพหลากหลายชนิด บางชนิดเป็นโมเลกุลขนาดเล็กที่มีคุณสมบัติเรืองแสงในตัวและจับกับโมเลกุลทางชีวภาพที่สนใจ ตัวอย่างที่สำคัญ ได้แก่ สีย้อม กรดนิวคลีอิกเช่นDAPIและHoechst (กระตุ้นด้วยแสง UV) และ DRAQ5 และ DRAQ7 (กระตุ้นได้ดีที่สุดด้วยแสงสีแดง) ซึ่งทั้งหมดจับกับร่องเล็กของDNAจึงติดฉลากนิวเคลียสของเซลล์ ส่วนชนิดอื่นๆ เป็นยา สารพิษ หรือเปปไทด์ที่จับกับโครงสร้างเซลล์เฉพาะและได้รับการดัดแปลงด้วยตัวรายงานเรืองแสง ตัวอย่างที่สำคัญของสีย้อมเรืองแสงประเภทนี้คือฟัลลอยดินซึ่งใช้ในการย้อม เส้นใย แอคตินใน เซลล์ สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแอคตินยังสามารถย้อมได้โดยใช้ เปปไทด์ LifeActที่เชื่อมต่อกับ GFP โดยเฉพาะในเซลล์ที่ไม่สามารถถ่ายทอดได้[ 7 ]เปปไทด์ใหม่ที่รู้จักกันในชื่อCollagen Hybridizing Peptideยังสามารถเชื่อมต่อกับฟลูออโรฟอร์และใช้ในการย้อมเส้นใยคอลลาเจนที่เสียสภาพได้ การย้อมสี ผนังเซลล์พืชทำได้โดยใช้สีย้อมที่จับกับเซลลูโลสหรือเพคตินการค้นหาโพรบเรืองแสงที่มีความจำเพาะสูงซึ่งช่วยให้สามารถถ่ายภาพเซลล์พืชแบบสดได้ยังคงดำเนินต่อไป[ 8 ]
มีโมเลกุลเรืองแสงหลายชนิดที่เรียกว่าฟลูออโรฟอร์หรือฟลูออโรโครมเช่นฟลูออเรสซีน , อเล็กซาฟลูออร์หรือไดไลท์ 488ซึ่งสามารถเชื่อมต่อทางเคมีกับโมเลกุลอื่นที่จับกับเป้าหมายที่สนใจภายในตัวอย่างได้
อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์
อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์เป็นเทคนิคที่ใช้การจับจำเพาะสูงของแอนติบอดีกับแอนติเจนเพื่อติดฉลากโปรตีนหรือโมเลกุลอื่นๆ ภายในเซลล์ โดยจะนำตัวอย่างมาทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีหลักที่จำเพาะต่อโมเลกุลที่สนใจ อาจใช้สารเรืองแสงเชื่อมต่อกับแอนติบอดีหลักโดยตรง หรืออาจใช้แอนติบอดีรอง ที่เชื่อมต่อกับสารเรืองแสงซึ่งจับกับแอนติบอดีแรกอย่างจำเพาะก็ได้ ตัวอย่างเช่น แอนติบอดีหลักที่สร้างขึ้นในหนูซึ่งรู้จัก ทูบูลินเมื่อรวมกับแอนติบอดีรองต่อต้านหนูที่ดัดแปลงด้วยสารเรืองแสง สามารถใช้ติดฉลากไมโครทูบูลในเซลล์ได้
โปรตีนเรืองแสง
ความเข้าใจสมัยใหม่เกี่ยวกับพันธุศาสตร์และเทคนิคการดัดแปลงดีเอ็นเอที่มีอยู่ ช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถดัดแปลงโปรตีนทางพันธุกรรมเพื่อให้โปรตีนนั้นมีโปรตีนเรืองแสงเป็นตัวบ่งชี้ได้ ในตัวอย่างทางชีวภาพ นักวิทยาศาสตร์สามารถทำให้โปรตีนที่สนใจเรืองแสงได้โดยตรง จากนั้นจึงสามารถติดตามตำแหน่งของโปรตีนได้โดยตรง รวมถึงในเซลล์ที่มีชีวิตด้วย
ข้อจำกัด
สารเรืองแสงจะสูญเสียความสามารถในการเรืองแสงเมื่อถูกแสงส่องกระทบในกระบวนการที่เรียกว่าการฟอกสีด้วยแสง (photobleaching) การฟอกสีด้วยแสงเกิดขึ้นเมื่อโมเลกุลเรืองแสงสะสมความเสียหายทางเคมีจากอิเล็กตรอนที่ถูกกระตุ้นในระหว่างการเรืองแสง การฟอกสีด้วยแสงสามารถจำกัดระยะเวลาในการสังเกตตัวอย่างด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้อย่างมาก มีหลายเทคนิคที่ใช้ในการลดการฟอกสีด้วยแสง เช่น การใช้สารเรืองแสงที่มีความทนทานมากขึ้น การลดปริมาณแสงส่องกระทบ หรือการใช้สารเคมี กำจัด ความเสียหายจากแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้โปรตีนเรืองแสงเป็นตัวบ่งชี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์เซลล์ที่มีชีวิตได้ อย่างไรก็ตาม เซลล์มีความไวต่อความเป็นพิษจากแสง โดยเฉพาะอย่างยิ่งแสงที่มีความยาวคลื่นสั้น นอกจากนี้ โมเลกุลเรืองแสงยังมีแนวโน้มที่จะสร้างสารเคมีที่มีปฏิกิริยาเมื่ออยู่ภายใต้แสง ซึ่งจะยิ่งเพิ่มผลกระทบจากความเป็นพิษจากแสง
แตกต่างจากเทคนิคกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงส่องผ่านและแสงสะท้อน กล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนซ์อนุญาตให้สังเกตเฉพาะโครงสร้างที่ถูกติดฉลากด้วยสารเรืองแสงเท่านั้น ตัวอย่างเช่น การสังเกตตัวอย่างเนื้อเยื่อที่เตรียมด้วยสีย้อมดีเอ็นเอเรืองแสงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนซ์ จะเผยให้เห็นเฉพาะการจัดเรียงตัวของดีเอ็นเอภายในเซลล์เท่านั้น และไม่เผยให้เห็นสิ่งอื่นใดเกี่ยวกับรูปร่างของเซลล์
เทคนิคการคำนวณที่เสนอให้ประมาณสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จากภาพที่ไม่เรืองแสง (เช่น ภาพสว่าง) อาจช่วยลดความกังวลเหล่านี้ได้[ 9 ]โดยทั่วไป วิธีการเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการฝึกเครือข่ายประสาทเทียมแบบ convolutional เชิง ลึก บนเซลล์ที่ย้อมสีแล้วจึงประมาณค่าฟลูออเรสเซนต์บนตัวอย่างที่ไม่ย้อมสี ดังนั้น การแยกเซลล์ที่กำลังตรวจสอบออกจากเซลล์ที่ใช้ในการฝึกเครือข่าย จะทำให้การถ่ายภาพทำได้เร็วขึ้นและลดความเป็นพิษต่อแสงลงได้
เทคนิคย่อยการเลี้ยวเบน
ลักษณะคลื่นของแสงจำกัดขนาดของจุดที่สามารถโฟกัสแสงได้เนื่องจากข้อจำกัดของการเลี้ยวเบน ข้อจำกัดนี้ได้รับการอธิบายโดย Ernst Abbeในศตวรรษที่ 19 และ "จำกัดความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงไว้ที่ประมาณครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นของแสงที่ใช้" กล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนซ์เป็นหัวใจสำคัญของเทคนิคหลายอย่างที่มุ่งหวังที่จะก้าวข้ามข้อจำกัดนี้ด้วยการจัดเรียงแสงแบบพิเศษ
ในศตวรรษที่ 20 มีการคิดค้นการปรับปรุงเทคนิคกล้องจุลทรรศน์หลายอย่าง ซึ่งส่งผลให้ความละเอียดและความคมชัดเพิ่มขึ้นในระดับหนึ่ง อย่างไรก็ตาม การปรับปรุงเหล่านั้นไม่ได้เอาชนะข้อจำกัดของการเลี้ยวเบน ในปี 1978 แนวคิดเชิงทฤษฎีแรกๆ ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อทำลายข้อจำกัดนี้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ 4Pi เป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล โดยที่แสงจะถูกโฟกัสอย่างเหมาะสมจากทุกด้านไปยังจุดโฟกัสร่วม ซึ่งใช้ในการสแกนวัตถุโดยการกระตุ้นแบบ 'จุดต่อจุด' ร่วมกับการตรวจจับแบบ 'จุดต่อจุด' [ 10 ] อย่างไรก็ตาม การสาธิตเชิงทดลองครั้งแรกของกล้องจุลทรรศน์ 4Pi เกิดขึ้นในปี 1994 [ 11 ]กล้องจุลทรรศน์ 4Piเพิ่มจำนวนทิศทางการโฟกัสที่มีอยู่ให้สูงสุดโดยใช้เลนส์วัตถุสองตัวที่อยู่ตรงข้ามกัน หรือกล้องจุลทรรศน์แบบกระตุ้นด้วยโฟตอนสองตัวโดยใช้แสงที่เลื่อนไปทางแดงและการกระตุ้นด้วยโฟตอนหลายตัว
กล้องจุลทรรศน์แบบบูรณาการเชิงสัมพันธ์เป็นการรวมกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เข้ากับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ซึ่งช่วยให้สามารถมองเห็นโครงสร้างระดับจุลภาคและข้อมูลบริบทด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ในขณะที่ใช้ข้อมูลจากกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เป็นเครื่องมือในการติดฉลาก[ 12 ]
เทคนิคแรกที่สามารถสร้างความละเอียดต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบนของแสงได้อย่างแท้จริงคือกล้องจุลทรรศน์ STEDซึ่งเสนอขึ้นในปี 1994 วิธีนี้และเทคนิคทั้งหมดที่พัฒนาตาม แนวคิด RESOLFTอาศัยปฏิกิริยาแบบไม่เชิงเส้นที่รุนแรงระหว่างแสงและโมเลกุลเรืองแสง โมเลกุลจะถูกผลักดันอย่างรุนแรงระหว่างสถานะโมเลกุลที่แตกต่างกันในแต่ละตำแหน่งเฉพาะ ทำให้ในที่สุดแสงสามารถถูกปล่อยออกมาได้ในพื้นที่เพียงเศษเสี้ยวเล็กๆ เท่านั้น ส่งผลให้ความละเอียดสูงขึ้น
นอกจากนี้ ในช่วงทศวรรษ 1990 ได้มีการพัฒนาวิธีการกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษอีกวิธีหนึ่งโดยอาศัยกล้องจุลทรรศน์แบบสนามกว้าง ความละเอียดของขนาดโครงสร้างนาโน ของเซลล์ ที่ย้อมด้วยสารเรืองแสงได้รับการปรับปรุงอย่างมากโดยการพัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบระบุตำแหน่ง SPDM และการส่องสว่างด้วยเลเซอร์แบบมีโครงสร้าง (การส่องสว่างแบบปรับเปลี่ยนเชิงพื้นที่, SMI) [ 13 ]การรวมหลักการของ SPDM กับ SMI ส่งผลให้เกิดการพัฒนากล้องจุลทรรศน์Vertico SMI [ 14 ] [ 15 ]การตรวจจับโมเลกุลเดี่ยวของ สีย้อมเรืองแสง กะพริบ ปกติ เช่นโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) สามารถทำได้โดยใช้การพัฒนาเพิ่มเติมของ SPDM ที่เรียกว่าเทคโนโลยี SPDMphymod ซึ่งทำให้สามารถตรวจจับและนับโมเลกุลเรืองแสงสองชนิดที่แตกต่างกันในระดับโมเลกุลได้ (เทคโนโลยีนี้เรียกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบระบุตำแหน่งสองสีหรือ 2CLM) [ 16 ]
อีกทางเลือกหนึ่ง การพัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบระบุตำแหน่งด้วยการ กระตุ้นด้วยแสง อาจให้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันโดยอาศัยการกะพริบหรือการสลับของโมเลกุลเดี่ยว ซึ่งสัดส่วนของโมเลกุลที่เรืองแสงนั้นน้อยมากในแต่ละครั้ง การตอบสนองแบบสุ่มของโมเลกุลต่อแสงที่ส่องมานั้น สอดคล้องกับการปฏิสัมพันธ์แบบไม่เชิงเส้นสูง ซึ่งนำไปสู่ความละเอียดที่ต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบนของแสง
แกลเลอรีภาพจุลทรรศน์เรืองแสง
- ภาพฉายตามแนวแกน z ของเซลล์มะเร็งกระดูก (osteosarcoma) ที่ย้อมด้วยฟัลลอยดินเพื่อแสดงเส้นใยแอคติน ภาพนี้ถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล และการประมวลผลภาพภายหลังทำโดยใช้ฟังก์ชันการกระจายจุดที่ได้จากการทดลอง
- การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบเอพิฟลูออเรสเซนต์ของส่วนประกอบทั้งสามในเซลล์มะเร็งของมนุษย์ที่กำลังแบ่งตัวดีเอ็นเอถูกย้อมสีน้ำเงินโปรตีนที่เรียกว่าINCENPถูกย้อมสีเขียว และไมโครทิวบูล ถูกย้อมสีแดง ฟลูออโรฟอร์แต่ละตัวจะถูกถ่ายภาพแยกกันโดยใช้ชุดฟิลเตอร์การกระตุ้นและการปล่อยแสงที่แตกต่างกัน และภาพจะถูกบันทึกตามลำดับโดยใช้กล้อง CCD ดิจิทัล จากนั้นจึงนำมาซ้อนทับกันเพื่อให้ได้ภาพที่สมบูรณ์
- เซลล์บุผนังหลอดเลือดภายใต้กล้องจุลทรรศน์ นิวเคลียสถูกย้อมสีน้ำเงินด้วย DAPI ไมโครทิวบูลถูกทำเครื่องหมายสีเขียวด้วยแอนติบอดีที่จับกับ FITC และเส้นใยแอคตินถูกทำเครื่องหมายสีแดงด้วยฟัลลอยดินที่จับกับ TRITC เซลล์บุผนังหลอดเลือดแดงปอดของวัว (BPAE)
- กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงแบบ 3 มิติ สองสี สำหรับตรวจหา Her2 และ Her3 ในเซลล์เต้านม โดยใช้สีย้อมมาตรฐาน: Alexa 488, Alexa 568 กล้องจุลทรรศน์ LIMON
- นิวเคลียสของลิมโฟไซต์มนุษย์ที่ย้อมด้วย DAPI โดยใช้โพรบเซนโทรเมียร์ของโครโมโซม 13 (สีเขียว) และ 21 (สีแดง) ในการทำไฮบริดไดเซชัน ( การไฮบริดไดเซชันในแหล่งกำเนิดด้วยฟลูออเรสเซนต์ (FISH))
- เยื่อหุ้มเซลล์ยีสต์ที่มองเห็นได้ด้วยโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์บางชนิดที่เชื่อมต่อกับตัวบ่งชี้เรืองแสง RFP และ GFP การฉายแสงจากตัวบ่งชี้ทั้งสองทำให้เกิดสีเหลือง
- กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษ: การตรวจจับโมเลกุล YFP เดี่ยวในเซลล์มะเร็งของมนุษย์ การวัดระยะทางทั่วไปในช่วง 15 นาโนเมตรวัดด้วยกล้องจุลทรรศน์ Vertico-SMI/SPDMphymod
- กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษ: กล้องจุลทรรศน์แบบระบุตำแหน่งร่วม (2CLM) ด้วยโปรตีนฟิวชั่น GFP และ RFP (นิวเคลียสของเซลล์มะเร็งกระดูก) ตรวจพบโมเลกุลที่ระบุตำแหน่งได้ 120,000 โมเลกุลในพื้นที่กว้าง (470 μm² )วัดด้วยกล้องจุลทรรศน์ Vertico-SMI/SPDMphymod
- การศึกษาการแสดงออกของ DNA ใน Palladinชนิดปกติและชนิดกลายพันธุ์ P239S ของมนุษย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์
- ภาพจากกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แสดงพยาธิสภาพของเซลล์เม็ดเลือดที่เกิดจากแสงอาทิตย์ โดยแสดงบริเวณที่ได้รับผลกระทบเป็นสีแดง
ดูเพิ่มเติม
- กล้องจุลทรรศน์แสง-อิเล็กตรอนแบบสัมพันธ์กัน
- เอลิซาเบธ แฮร์รีผู้บุกเบิกเทคนิคกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์สำหรับการมองเห็นโปรตีนระดับเซลล์ย่อยของแบคทีเรีย
- การถ่ายภาพด้วยฟลูออเรสเซนซ์
- การเรืองแสงในวิทยาศาสตร์ชีวภาพ
- โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP)
- หลอดไฟไอปรอท
- กล้องจุลทรรศน์
- กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน § การเรืองแสงแคโทด
- การเปลี่ยนแปลงสโตกส์
- หลอดไฟซีนอนอาร์ค
ลิงก์ภายนอก
- Fluorophores.orgฐานข้อมูลของสีย้อมเรืองแสง
- ศูนย์ทรัพยากรด้านกล้องจุลทรรศน์เก็บถาวรเมื่อวันที่ 22 ตุลาคม 2557 ที่Wayback Machine
- ภาพเคลื่อนไหวและคำอธิบายเกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ประเภทต่างๆ รวมถึงกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์และกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (มหาวิทยาลัยปารีสใต้)
สรุปเนื้อหา
ข้อมูลสำคัญจากบทความ
ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับ กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบ ใช้ แสงที่ใช้ ฟลูออเรสเซน ซ์แทนหรือควบคู่ไปกับการกระเจิงการสะท้อน การลดทอนหรือการดูดกลืนเพื่อศึกษาคุณสมบัติของสาร อินทรีย์หรือ...
หลักการ
ตัวอย่างจะถูกส่องสว่างด้วยแสงที่มี ความยาวคลื่น เฉพาะ (หรือหลายความยาวคลื่น) ซึ่งถูกดูดซับโดย ฟลูออโรฟอร์ ทำให้ฟลูออโรฟอร์ปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกว่า (เช่น มีสีต่างจากแสงที่ถูกดูดซับ)...
กล้องจุลทรรศน์เอพิฟลูออเรสเซนซ์
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ใช้ใน วิทยาศาสตร์ชีวภาพ เป็นแบบเอพิฟลูออเรสเซนซ์ดังแสดงในแผนภาพ แสงที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นจะส่องสว่างตัวอย่างผ่านเลนส์ วัตถุ แสงฟลูออเรส เซนซ์...
แหล่งกำเนิดแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ต้องการแสงสว่างที่เข้มข้นและเกือบจะเป็นสีเดียว ซึ่งแหล่งกำเนิดแสงทั่วไปบางชนิด เช่น หลอดฮาโลเจน ไม่สามารถให้ได้ [ 4 ] แหล่งกำเนิดแสงหลักสี่ประเภทที่ใช้ ได้แก่ หลอดซีนอน หรือ หลอดไอปรอท ที่มี ตัวกรองการกระตุ้น เลเซอร์ แหล่งกำเนิดแสง...