โครงสร้างหลักของโปรตีน ซึ่งก็คือลำดับกรดอะมิโนเชิงเส้น จะกำหนดโครงสร้างดั้งเดิมของ โปรตีน ^{[ 11 ]}กรดอะมิโนเฉพาะและตำแหน่งของกรดอะมิโนเหล่านั้นในสายโพลีเปปไทด์เป็นปัจจัยกำหนดว่าส่วนใดของโปรตีนจะพับเข้าหากันอย่างใกล้ชิดและสร้างโครงสร้างสามมิติ องค์ประกอบของกรดอะมิโนไม่สำคัญเท่ากับลำดับ^{[ 12 ]}อย่างไรก็ตาม ข้อเท็จจริงที่สำคัญของการพับตัวยังคงอยู่ที่ว่าลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนแต่ละชนิดมีข้อมูลที่ระบุทั้งโครงสร้างดั้งเดิมและเส้นทางที่จะบรรลุสถานะนั้น นี่ไม่ได้หมายความว่าลำดับกรดอะมิโนที่เกือบจะเหมือนกันจะพับตัวในลักษณะเดียวกันเสมอไป^{[ 13 ]}โครงสร้างจะแตกต่างกันไปตามปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมด้วย โปรตีนที่คล้ายกันจะพับตัวแตกต่างกันไปตามตำแหน่งที่พบ

การก่อตัวของโครงสร้างทุติยภูมิเป็นขั้นตอนแรกในกระบวนการพับตัวของโปรตีนเพื่อให้ได้โครงสร้างดั้งเดิม ลักษณะเฉพาะของโครงสร้างทุติยภูมิคือโครงสร้างที่เรียกว่าอัลฟาเฮลิกซ์และเบตาชีทซึ่งพับตัวอย่างรวดเร็วเนื่องจากมีความเสถียรโดยพันธะไฮโดรเจนภายใน โมเลกุล ดังที่Linus Pauling ได้อธิบายลักษณะเป็นครั้งแรก การก่อตัวของพันธะไฮโดรเจนภายในโมเลกุลมีส่วนสำคัญอีกประการหนึ่งต่อความเสถียรของโปรตีน^{[ 14 ]}อัลฟาเฮลิกซ์เกิดขึ้นจากพันธะไฮโดรเจนของกระดูกสันหลังเพื่อสร้างรูปร่างเกลียว (ดูรูปทางด้านขวา) ^{[ 12 ]}เบตาชีทแบบพับเป็นโครงสร้างที่เกิดขึ้นโดยกระดูกสันหลังโค้งงอเข้าหากันเพื่อสร้างพันธะไฮโดรเจน (ดังแสดงในรูปทางด้านซ้าย) พันธะไฮโดรเจนอยู่ระหว่างไฮโดรเจนอะไมด์และออกซิเจนคาร์บอนิลของ พันธะเปป ไทด์มีแผ่นพับ β แบบขนานตรงข้ามและแผ่นพับ β แบบขนาน โดยที่ความเสถียรของพันธะไฮโดรเจนจะแข็งแกร่งกว่าในแผ่น β แบบขนานตรงข้าม เนื่องจากพันธะไฮโดรเจนมีมุม 180 องศาที่เหมาะสมเมื่อเทียบกับพันธะไฮโดรเจนเอียงที่เกิดจากแผ่นแบบขนาน^{[ 12 ]}

α-เฮลิกซ์และ β-ชีทมักเป็นแอมฟิพาติก ซึ่งหมายความว่ามีส่วนที่ชอบน้ำและส่วนที่ไม่ชอบน้ำ ความสามารถนี้ช่วยในการสร้างโครงสร้างตติยภูมิของโปรตีนซึ่งการพับเกิดขึ้นเพื่อให้ด้านที่ชอบน้ำหันเข้าหาสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำที่ล้อมรอบโปรตีน และด้านที่ไม่ชอบน้ำหันเข้าหาแกนกลางที่ไม่ชอบน้ำของโปรตีน^{[ 15 ]}โครงสร้างทุติยภูมิจะค่อยๆ พัฒนาไปสู่โครงสร้างตติยภูมิ เมื่อโครงสร้างตติยภูมิของโปรตีนถูกสร้างขึ้นและมีเสถียรภาพโดยปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำแล้ว อาจมีพันธะโควาเลนต์ในรูปแบบของสะพานไดซัลไฟด์ที่เกิดขึ้นระหว่าง หมู่ซิส เทอีน สองหมู่ การสัมผัสแบบ ไม่ใช้พันธะโควาเลนต์และแบบใช้พันธะโควาเลนต์เหล่านี้มี การจัดเรียง ทางโทโพโลยี เฉพาะ ในโครงสร้างดั้งเดิมของโปรตีน โครงสร้างตติยภูมิของโปรตีนเกี่ยวข้องกับสายโพลีเปปไทด์เดี่ยว อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาเพิ่มเติมของสายโพลีเปปไทด์ที่พับแล้วทำให้เกิดโครงสร้างจตุรภูมิ^{[ 16 ]}

โครงสร้างระดับตติยภูมิอาจนำไปสู่การก่อตัวของโครงสร้างระดับจตุรภูมิในโปรตีนบางชนิด ซึ่งโดยปกติจะเกี่ยวข้องกับการ "ประกอบ" หรือ "การประกอบร่วม" ของหน่วยย่อยที่พับตัวแล้ว กล่าวอีกนัยหนึ่งคือ โซ่โพลีเปปไทด์หลายสายสามารถโต้ตอบกันเพื่อสร้างโปรตีนระดับจตุรภูมิที่มีฟังก์ชันการทำงานอย่างสมบูรณ์^{[ 12 ]}

การพับเป็นกระบวนการที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติซึ่งส่วนใหญ่ถูกชี้นำโดยปฏิกิริยาไฮโดรโฟบิก การสร้างพันธะไฮโดรเจน ภายใน โมเลกุลแรงแวนเดอร์วาลส์และถูกต่อต้านโดยเอนโทรปีของโครงสร้าง^{[ 17 ]}ช่วงเวลาการพับของโปรตีนที่แยกออกมาขึ้นอยู่กับขนาดลำดับการสัมผัสและโทโพโลยีของวงจรภายในเซลล์ กระบวนการพับมักจะเริ่มต้นพร้อมกับการแปลรหัสดังนั้นปลาย Nของโปรตีนจึงเริ่มพับในขณะที่ ส่วน ปลาย Cของโปรตีนยังคงถูกสังเคราะห์โดยไรโบโซมอย่างไรก็ตาม โมเลกุลโปรตีนอาจพับเองตามธรรมชาติในระหว่างหรือหลังการสังเคราะห์ทางชีวภาพ [ ^{18 ]}แม้ว่าโมเลกุลขนาด ใหญ่เหล่านี้ อาจถือได้ว่า " พับตัวเอง " กระบวนการนี้ยังขึ้นอยู่กับตัวทำละลาย ( น้ำหรือเยื่อไขมัน ) ^{[ 19 ]}ความเข้มข้นของเกลือค่าpHอุณหภูมิการมีอยู่ของโคแฟคเตอร์และโมเลกุลชาเปอโรนที่เป็นไป^ได้

โปรตีนจะมีข้อจำกัดในความสามารถในการพับตัวเนื่องจากมุมการโค้งงอหรือโครงสร้างที่เป็นไปได้ที่จำกัด มุมการพับตัวของโปรตีนที่อนุญาตเหล่านี้อธิบายได้ด้วยแผนภาพสองมิติที่เรียกว่าแผนภาพ Ramachandranซึ่งแสดงด้วยมุม psi และ phi ของการหมุนที่อนุญาต^{[ 20 ]}

คุณสมบัติกันน้ำ

การพับโปรตีนต้องมีความเหมาะสมทางอุณหพลศาสตร์ภายในเซลล์จึงจะเป็นปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเองได้ เนื่องจากเป็นที่ทราบกันว่าการพับโปรตีนเป็นปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเองได้ ดังนั้นจึงต้องมี ค่า พลังงานอิสระของกิบส์เป็นลบ พลังงานอิสระของกิบส์ในการพับโปรตีนมีความสัมพันธ์โดยตรงกับเอนทาลปีและเอนโทรปี^{[ 12 ]}เพื่อให้เกิดค่าเดลต้า G ที่เป็นลบและเพื่อให้การพับโปรตีนมีความเหมาะสมทางอุณหพลศาสตร์ เอนทาลปี เอนโทรปี หรือทั้งสองอย่างจะต้องมีความเหมาะสม

การลดจำนวนโซ่ข้างที่ไม่ชอบน้ำที่สัมผัสกับน้ำให้น้อยที่สุดถือเป็นแรงผลักดันสำคัญเบื้องหลังกระบวนการพับตัว^{[ 21 ]}ผลกระทบที่ไม่ชอบน้ำคือปรากฏการณ์ที่โซ่ที่ไม่ชอบน้ำของโปรตีนยุบตัวเข้าไปในแกนกลางของโปรตีน (ห่างจากสภาพแวดล้อมที่ชอบน้ำ) ^{[ 12 ]}ในสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำ โมเลกุลของน้ำมีแนวโน้มที่จะรวมตัวกันรอบๆ บริเวณที่ไม่ชอบน้ำหรือโซ่ข้างของโปรตีน ทำให้เกิดเปลือกน้ำของโมเลกุลน้ำที่เรียงตัวอย่างเป็นระเบียบ^{[ 22 ]}การเรียงตัวของโมเลกุลน้ำรอบๆ บริเวณที่ไม่ชอบน้ำจะเพิ่มความเป็นระเบียบในระบบ และด้วยเหตุนี้จึงทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีในเชิงลบ (เอนโทรปีในระบบน้อยลง) โมเลกุลของน้ำถูกตรึงอยู่ในกรงน้ำเหล่านี้ ซึ่งเป็นแรงผลักดันให้เกิดการยุบตัวที่ไม่ชอบน้ำหรือการพับตัวเข้าด้านในของกลุ่มที่ไม่ชอบน้ำ การยุบตัวที่ไม่ชอบน้ำจะนำเอนโทรปีกลับคืนสู่ระบบผ่านการแตกของกรงน้ำ ซึ่งจะปลดปล่อยโมเลกุลน้ำที่เรียงตัวอย่างเป็นระเบียบ^{[ 12 ]}กลุ่มไฮโดรโฟบิกจำนวนมากที่ทำปฏิกิริยากันภายในแกนกลางของโปรตีนที่พับเป็นทรงกลมมีส่วนสำคัญต่อความเสถียรของโปรตีนหลังจากการพับ เนื่องจากแรงแวนเดอร์วาลส์ที่สะสมไว้จำนวนมาก (โดยเฉพาะแรงลอนดอนดิสเพอร์ชัน ) ^{[ 12 ]}ผล ของ ไฮโดรโฟบิกมีอยู่เป็นแรงขับเคลื่อนในทางอุณหพลศาสตร์ก็ต่อเมื่อมีตัวกลางที่เป็นน้ำที่มี โมเลกุล แอมฟิฟิลิกที่มีบริเวณไฮโดรโฟบิกขนาดใหญ่^{[ 23 ]}ความแข็งแรงของพันธะไฮโดรเจนขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อม ดังนั้นพันธะไฮโดรเจนที่อยู่ภายในแกนกลางไฮโดรโฟบิกจึงมีส่วนช่วยมากกว่าพันธะไฮโดรเจนที่สัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำต่อความเสถียรของสถานะดั้งเดิม^{[ 24 ]}

ในโปรตีนที่มีโครงสร้างแบบทรงกลม กรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำมักจะกระจายตัวอยู่ตามลำดับกรดอะมิโนหลัก แทนที่จะกระจายตัวแบบสุ่มหรือรวมกลุ่มกัน^{[ 25 ] [ 26 ]}อย่างไรก็ตาม โปรตีนที่เพิ่งเกิดขึ้นใหม่ซึ่งมักจะมีโครงสร้างที่ไม่เป็นระเบียบโดยเนื้อแท้ [ ^{27 ] [ 28 ] จะ}แสดงรูปแบบการรวมกลุ่มของกรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำที่ตรงกันข้ามกับลำดับกรดอะมิโนหลัก^{[ 29 ]}

ผู้ดูแล

โมเลกุลชาเปอโรนเป็นโปรตีนประเภทหนึ่งที่ช่วยในการพับตัวของโปรตีนอื่น ๆในร่างกาย อย่างถูกต้อง ชาเปอโรนมีอยู่ในทุกส่วนของเซลล์และมีปฏิสัมพันธ์กับสายโพลีเปปไทด์เพื่อให้โปรตีนสามารถก่อตัวเป็นโครงสร้างสามมิติแบบดั้งเดิมได้ อย่างไรก็ตาม ชาเปอโรนเองไม่ได้รวมอยู่ในโครงสร้างสุดท้ายของโปรตีนที่พวกมันช่วย^{[ 30 ]}ชาเปอโรนอาจช่วยในการพับตัวได้แม้ในขณะที่โพลีเปปไทด์ที่เกิดขึ้นใหม่กำลังถูกสังเคราะห์โดยไรโบโซม^{[ 31 ]}โมเลกุลชาเปอโรนทำงานโดยการจับเพื่อทำให้โครงสร้างของโปรตีนที่ไม่เสถียรในเส้นทางการพับตัวมีเสถียรภาพ แต่ชาเปอโรนไม่มีข้อมูลที่จำเป็นในการทราบโครงสร้างแบบดั้งเดิมที่ถูกต้องของโปรตีนที่พวกมันช่วย แต่ชาเปอโรนทำงานโดยการป้องกันโครงสร้างการพับตัวที่ไม่ถูกต้อง^{[ 31 ]}ด้วยวิธีนี้ ชาเปอโรนจึงไม่ได้เพิ่มอัตราของแต่ละขั้นตอนที่เกี่ยวข้องในเส้นทางการพับตัวไปสู่โครงสร้างแบบดั้งเดิม แต่พวกมันทำงานโดยการลดการรวมตัวที่ไม่พึงประสงค์ของสายโซ่โพลีเปปไทด์ที่อาจทำให้การค้นหาตัวกลางที่เหมาะสมช้าลง และพวกมันยังให้เส้นทางที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นสำหรับสายโซ่โพลีเปปไทด์ในการรับโครงสร้างที่ถูกต้อง^{[ 30 ]}ไม่ควรสับสนระหว่างชาเปอโรนกับโปรตีนตัวเร่งปฏิกิริยาการพับซึ่งเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาทางเคมีที่รับผิดชอบต่อขั้นตอนที่ช้าในเส้นทางการพับ ตัวอย่างของตัวเร่งปฏิกิริยาการพับ ได้แก่ โปรตีนไดซัลไฟด์ไอโซเมอเรสและเปปทิดิล-โพรลิลไอโซเมอเรสซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการสร้างพันธะไดซัลไฟด์หรือการเปลี่ยนระหว่างสเตอริโอไอโซเมอร์ซิสและทรานส์ของกลุ่มเปปไทด์^{[ 31 ]}พบว่าชาเปอโรนมีความสำคัญในกระบวนการพับโปรตีนในร่างกายเนื่องจากพวกมันให้ความช่วยเหลือที่จำเป็นแก่โปรตีนในการรับการจัดเรียงและโครงสร้างที่เหมาะสมได้อย่างมีประสิทธิภาพเพียงพอที่จะกลายเป็น "มีความเกี่ยวข้องทางชีววิทยา" ^{[ 32 ]}ซึ่งหมายความว่าในทางทฤษฎีแล้วสายโซ่โพลีเปปไทด์สามารถพับเป็นโครงสร้างดั้งเดิมได้โดยไม่ต้องอาศัยความช่วยเหลือของชาเปอโรน ดังที่แสดงให้เห็นโดยการทดลองการพับโปรตีนที่ดำเนินการในหลอดทดลอง^{[ 32 ]}อย่างไรก็ตาม กระบวนการนี้พิสูจน์แล้วว่าไม่มีประสิทธิภาพหรือช้าเกินไปที่จะมีอยู่ในระบบชีวภาพ ดังนั้น ชาเปอโรนจึงจำเป็นสำหรับการพับโปรตีนในร่างกายนอกเหนือจากบทบาทในการช่วยสร้างโครงสร้างดั้งเดิมแล้ว ชาเปอโรนยังแสดงให้เห็นว่ามีส่วนเกี่ยวข้องในบทบาทต่างๆ เช่น การขนส่งโปรตีน การย่อยสลาย และแม้กระทั่งช่วยให้โปรตีนที่เสียสภาพกลับมาทำงาน ได้เมื่อสัมผัสกับปัจจัยที่ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างภายนอกบางอย่าง จะมีโอกาสพับกลับเข้าสู่โครงสร้างดั้งเดิมที่ถูกต้อง^{[ 33 ]}

โปรตีนที่เสียสภาพอย่างสมบูรณ์จะขาดทั้งโครงสร้างตติยภูมิและทุติยภูมิ และมีอยู่เป็นโครงสร้างแบบขดสุ่ม (random coil ) ภายใต้เงื่อนไขบางประการ โปรตีนบางชนิดสามารถพับตัวใหม่ได้ อย่างไรก็ตาม ในหลายกรณี การเสียสภาพนั้นไม่สามารถย้อนกลับได้^{[ 34 ]}บางครั้งเซลล์จะปกป้องโปรตีนของตนจากอิทธิพลที่ทำให้เสียสภาพของความร้อนด้วยเอนไซม์ที่เรียกว่าโปรตีนช็อกความร้อน (heat shock proteins ) (ซึ่งเป็น chaperone ชนิดหนึ่ง) ซึ่งช่วยโปรตีนอื่นๆ ทั้งในการพับตัวและคงสภาพการพับตัวไว้ โปรตีนช็อกความร้อนพบได้ในทุกสายพันธุ์ที่ตรวจสอบ ตั้งแต่แบคทีเรียไปจนถึงมนุษย์ ซึ่งบ่งชี้ว่าพวกมันวิวัฒนาการมาตั้งแต่ยุคแรกๆ และมีหน้าที่สำคัญ โปรตีนบางชนิดไม่เคยพับตัวในเซลล์เลย ยกเว้นด้วยความช่วยเหลือของ chaperone ซึ่งจะแยกโปรตีนแต่ละตัวออกจากกัน เพื่อไม่ให้การพับตัวของพวกมันถูกขัดจังหวะโดยปฏิกิริยากับโปรตีนอื่นๆ หรือช่วยคลี่โปรตีนที่พับตัวผิด ทำให้พวกมันสามารถพับตัวใหม่เป็นโครงสร้างดั้งเดิมที่ถูกต้องได้^{[ 35 ]}หน้าที่นี้มีความสำคัญอย่างยิ่งในการป้องกันความเสี่ยงของการตกตะกอนกลายเป็นสารรวมตัวอสัณฐานที่ไม่ละลายน้ำปัจจัยภายนอกที่เกี่ยวข้องกับการเสียสภาพของโปรตีนหรือการรบกวนสถานะดั้งเดิม ได้แก่ อุณหภูมิ สนามภายนอก (ไฟฟ้า แม่เหล็ก) ^{[ 36 ]}ความหนาแน่นของโมเลกุล^{[ 37 ]}และแม้แต่ข้อจำกัดของพื้นที่ (เช่น การกักขัง) ซึ่งอาจมีอิทธิพลอย่างมากต่อการพับตัวของโปรตีน^{[ 38 ]}ความเข้มข้นสูงของสารละลายค่า pHที่สุดขั้ว แรงทางกล และการมีอยู่ของสารเคมีที่ทำให้โปรตีนเสียสภาพ ก็สามารถมีส่วนทำให้โปรตีนเสียสภาพได้เช่นกัน ปัจจัยแต่ละอย่างเหล่านี้ถูกจัดกลุ่มรวมกันเป็นความเครียด พบว่าชาเปอโรนมีอยู่ในความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นในช่วงเวลาที่เซลล์เกิดความเครียด และช่วยในการพับตัวที่เหมาะสมของโปรตีนที่เกิดขึ้นใหม่ รวมถึงโปรตีนที่เสียสภาพหรือพับตัวผิดรูป^{[ 30 ]}

ภายใต้เงื่อนไขบางประการ โปรตีนจะไม่พับตัวเป็นรูปแบบการทำงานทางชีวเคมี อุณหภูมิที่สูงหรือต่ำกว่าช่วงที่เซลล์มักจะอาศัยอยู่จะทำให้ โปรตีน ที่ไม่เสถียรต่อความร้อนคลายตัวหรือเสียสภาพ (นี่คือเหตุผลที่การต้มทำให้ไข่ขาวขุ่น) อย่างไรก็ตาม ความเสถียรต่อความร้อนของโปรตีนนั้นไม่คงที่ ตัวอย่างเช่นพบ ว่า อาร์เคียที่ทน  ความร้อนสูงสามารถเจริญเติบโตได้ที่อุณหภูมิสูงถึง 122 °C ^{[ 39 ]}ซึ่งแน่นอนว่าต้องอาศัยโปรตีนและกลุ่มโปรตีนที่สำคัญทั้งหมดมีความเสถียรที่อุณหภูมินั้นหรือสูงกว่า

แบคทีเรียE. coliเป็นโฮสต์ของแบคทีริโอเฟจ T4และโปรตีน gp31 ที่เข้ารหัสโดยฟาจ ( P17313 ) ดูเหมือนจะมีโครงสร้างและหน้าที่คล้ายคลึงกับโปรตีนชาเปอโรนGroES ของ E. coliและสามารถใช้แทนกันได้ในการประกอบ อนุภาค ไวรัส แบคทีริโอเฟจ T4 ระหว่างการติดเชื้อ^{[ 40 ]}เช่นเดียวกับ GroES โปรตีน gp31 จะสร้างคอมเพล็กซ์ที่เสถียรกับ ชาเปอโรนิน GroELซึ่งจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับการพับและการประกอบในร่างกายของโปรตีนแคปซิดหลัก gp23 ของแบคทีริโอเฟจ T4 ^{[ 40 ]}

โปรตีนบางชนิดมีโครงสร้างดั้งเดิมหลายแบบ และเปลี่ยนการพับตามปัจจัยภายนอกบางอย่าง ตัวอย่างเช่น โปรตีน KaiB เปลี่ยนการพับตลอดทั้งวันทำหน้าที่เป็นนาฬิกาสำหรับไซยาโนแบคทีเรีย มีการประมาณการว่า โปรตีนใน PDB ( Protein Data Bank ) ประมาณ 0.5 – 4% เปลี่ยนการพับ^{[ 41 ]}

การตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์เป็นหนึ่งในวิธีการที่มีประสิทธิภาพและสำคัญที่สุดในการพยายามถอดรหัสโครงสร้างสามมิติของโปรตีนที่พับตัว^{[ 47 ]}เพื่อให้สามารถทำการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ได้ โปรตีนที่กำลังศึกษาจะต้องอยู่ในโครงผลึก การวางโปรตีนไว้ในโครงผลึกนั้น จำเป็นต้องมีตัวทำละลายที่เหมาะสมสำหรับการตกผลึก ได้โปรตีนบริสุทธิ์ที่ระดับความอิ่มตัวยิ่งยวดในสารละลาย และตกผลึกในสารละลาย^{[ 48 ]}เมื่อโปรตีนตกผลึกแล้ว ลำแสงรังสีเอกซ์สามารถถูกรวมผ่านโครงผลึก ซึ่งจะทำให้ลำแสงเลี้ยวเบนหรือพุ่งออกไปในทิศทางต่างๆ ลำแสงที่ออกมาเหล่านี้มีความสัมพันธ์กับโครงสร้างสามมิติเฉพาะของโปรตีนที่อยู่ภายใน รังสีเอกซ์จะทำปฏิกิริยากับกลุ่มอิเล็กตรอนที่ล้อมรอบอะตอมแต่ละตัวภายในโครงผลึกของโปรตีนโดยเฉพาะ และสร้างรูปแบบการเลี้ยวเบนที่สามารถมองเห็นได้^{[ 15 ]}เฉพาะการเชื่อมโยงกลุ่มเมฆความหนาแน่นของอิเล็กตรอนกับแอมพลิจูดของรังสีเอกซ์เท่านั้นที่สามารถอ่านรูปแบบนี้ได้ และนำไปสู่สมมติฐานของเฟสหรือมุมเฟสที่เกี่ยวข้องซึ่งทำให้วิธีการนี้ซับซ้อนขึ้น^{[ 49 ]}หากไม่มีความสัมพันธ์ที่สร้างขึ้นผ่านพื้นฐานทางคณิตศาสตร์ที่เรียกว่าการแปลงฟูริเยร์ " ปัญหาเฟส " จะทำให้การทำนายรูปแบบการเลี้ยวเบนทำได้ยากมาก^{[ 15 ]}วิธีการที่เกิดขึ้นใหม่ เช่นการแทนที่ไอโซมอร์ฟัสหลายครั้งใช้การมีอยู่ของไอออนโลหะหนักเพื่อเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ในลักษณะที่คาดการณ์ได้มากขึ้น ลดจำนวนตัวแปรที่เกี่ยวข้อง และแก้ปัญหาเฟส^{[ 47 ]}

สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์เป็นวิธีการที่มีความไวสูงสำหรับการศึกษาภาวะการพับตัวของโปรตีน กรดอะมิโนสามชนิด ได้แก่ ฟีนิลอะลานีน (Phe) ไทโรซีน (Tyr) และทริปโตแฟน (Trp) มีคุณสมบัติเรืองแสงโดยธรรมชาติ แต่มีเพียง Tyr และ Trp เท่านั้นที่ใช้ในการทดลอง เนื่องจากมีค่าผลผลิตควอนตัมสูงพอที่จะให้สัญญาณเรืองแสงที่ดี ทั้ง Trp และ Tyr ถูกกระตุ้นด้วยความยาวคลื่น 280  นาโนเมตร ในขณะที่ Trp เพียงอย่างเดียวถูกกระตุ้นด้วยความยาวคลื่น 295  นาโนเมตร เนื่องจากลักษณะที่เป็นอะโรมาติก หมู่ Trp และ Tyr มักพบฝังอยู่ทั้งหมดหรือบางส่วนในแกนไฮโดรโฟบิกของโปรตีน ที่ส่วนต่อประสานระหว่างโดเมนโปรตีนสองโดเมน หรือที่ส่วนต่อประสานระหว่างหน่วยย่อยของโปรตีนโอลิโกเมอร์ ในสภาพแวดล้อมที่ไม่มีขั้วนี้ พวกมันมีค่าผลผลิตควอนตัมสูงและดังนั้นจึงมีความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์สูง เมื่อโครงสร้างตติยภูมิหรือจตุรภูมิของโปรตีนถูกทำลาย หมู่ข้างเคียงเหล่านี้จะสัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่ชอบน้ำของตัวทำละลายมากขึ้น และผลผลิตควอนตัมจะลดลง ส่งผลให้ความเข้มของการเรืองแสงต่ำลง สำหรับหมู่ Trp ความยาวคลื่นของการปล่อยแสงเรืองแสงสูงสุดก็ขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมด้วยเช่นกัน

สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์สามารถใช้เพื่อระบุลักษณะการคลายตัวของโปรตีนที่สมดุลได้โดยการวัดการเปลี่ยนแปลงในความเข้มของการปล่อยฟลูออเรสเซนซ์หรือในความยาวคลื่นของการปล่อยสูงสุดเป็นฟังก์ชันของค่าตัวทำให้เสียสภาพ^{[ 50 ] [ 51 ]}ตัวทำให้เสียสภาพอาจเป็นโมเลกุลทางเคมี (ยูเรีย, กัวนิดิเนียมไฮโดรคลอไรด์) อุณหภูมิ pH ความดัน ฯลฯ สมดุลระหว่างสถานะโปรตีนที่แตกต่างกันแต่แยกจากกัน เช่น สถานะดั้งเดิม สถานะกลาง สถานะคลายตัว ขึ้นอยู่กับค่าตัวทำให้เสียสภาพ ดังนั้นสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์โดยรวมของส่วนผสมที่สมดุลจึงขึ้นอยู่กับค่านี้ด้วย จึงได้โปรไฟล์ที่เชื่อมโยงสัญญาณโปรตีนโดยรวมกับค่าตัวทำให้เสียสภาพ โปรไฟล์ของการคลายตัวที่สมดุลอาจช่วยให้สามารถตรวจจับและระบุตัวกลางของการคลายตัวได้^{[ 52 ] [ 53 ]} Hugues Bedouelle ได้พัฒนาสมการทั่วไปเพื่อหาพารามิเตอร์ทางเทอร์โมไดนามิกที่บ่งบอกถึงสมดุลการคลายตัวของโปรตีนโฮโมเมอริกหรือเฮเทอโรเมอริก ไปจนถึงไตรเมอร์และอาจถึงเตตระเมอร์ จากโปรไฟล์ดังกล่าว^{[ 50 ]}สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์สามารถใช้ร่วมกับอุปกรณ์ผสมเร็ว เช่นstopped flowเพื่อวัดจลนศาสตร์การพับโปรตีน^{[ 54 ]}สร้าง พล็ อตเชฟรอนและวิเคราะห์ค่า Phi

การดูดกลืนแสง แบบวงกลม (Circular dichroism)เป็นหนึ่งในเครื่องมือพื้นฐานและทั่วไปที่สุดในการศึกษาการพับตัวของโปรตีน สเปกโทรสโกปีแบบดูด กลืนแสงแบบ วงกลมจะวัดการดูดกลืนแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมในโปรตีน โครงสร้างต่างๆ เช่นอัลฟาเฮลิกซ์และเบตาชีทเป็นแบบไครัล ดังนั้นจึงดูดกลืนแสงดังกล่าว การดูดกลืนแสงนี้ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ระดับการพับตัวของกลุ่มโปรตีน เทคนิคนี้ถูกนำมาใช้ในการวัดการคลายตัวของโปรตีนที่สมดุลโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงของการดูดกลืนแสงนี้เป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นของสารทำให้เสียสภาพหรืออุณหภูมิการหลอมละลายของสารทำให้เสียสภาพจะวัดพลังงานอิสระของการคลายตัวรวมถึงค่า m ของโปรตีน หรือการพึ่งพาสารทำให้เสียสภาพ การหลอมละลายของอุณหภูมิจะวัดอุณหภูมิการเสียสภาพ (Tm) ของโปรตีน^{[ 50 ]}เช่นเดียวกับสเปกโทรสโกปีแบบฟลูออเรสเซนซ์ สเปกโทรสโกปีแบบดูดกลืนแสงแบบวงกลมสามารถรวมเข้ากับอุปกรณ์ผสมอย่างรวดเร็ว เช่นstopped flowเพื่อวัดจลนศาสตร์ การพับตัวของโปรตีน และสร้างพล็อตเชฟรอนได้

การพัฒนาล่าสุดของ เทคนิค การดูดกลืนแสงแบบวงกลมจากการสั่นสะเทือน (VCD) สำหรับโปรตีน ซึ่งปัจจุบันเกี่ยวข้องกับเครื่องมือแปลงฟูริเยร์ (FT) ได้มอบวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการกำหนดโครงสร้างของโปรตีนในสารละลาย แม้กระทั่งโมเลกุลโปรตีนขนาดใหญ่มาก การศึกษา VCD ของโปรตีนดังกล่าว สามารถนำมาใช้ร่วมกับข้อมูล การเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์สำหรับผลึกโปรตีนข้อมูลFT-IR สำหรับสารละลายโปรตีนในน้ำหนักเบา ( ) หรือการคำนวณควอนตัมได้

การเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์ ของโปรตีน(NMR) สามารถรวบรวมข้อมูลโครงสร้างโปรตีนได้โดยการเหนี่ยวนำสนามแม่เหล็กผ่านตัวอย่างโปรตีนที่มีความเข้มข้น ใน NMR ขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมทางเคมี นิวเคลียสบางชนิดจะดูดซับคลื่นความถี่วิทยุเฉพาะ^{[ 55 ] [ 56 ]}เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนเกิดขึ้นในช่วงเวลาตั้งแต่ ns ถึง ms NMR จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาโครงสร้างระดับกลางในช่วงเวลาตั้งแต่ ps ถึง s ^{[ 57 ]}เทคนิคหลักบางอย่างสำหรับการศึกษาโครงสร้างโปรตีนและการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนที่ไม่พับตัว ได้แก่COSY , TOCSY ,  HSQC , การผ่อนคลายเวลา (T1 และ T2) และNOE ^{[ 55 ]} NOE มีประโยชน์อย่างยิ่งเนื่องจากสามารถสังเกตการถ่ายโอนสนามแม่เหล็กระหว่างไฮโดรเจนที่อยู่ใกล้กันได้^{[ 55 ]}การทดลอง NMR ที่แตกต่างกันมีความไวต่อช่วงเวลาที่แตกต่างกัน ซึ่งเหมาะสมกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนที่แตกต่างกัน NOE สามารถตรวจจับการสั่นของพันธะหรือการหมุนของโซ่ข้างได้ อย่างไรก็ตาม NOE มีความไวเกินไปที่จะตรวจจับการพับของโปรตีนเนื่องจากเกิดขึ้นในระยะเวลาที่นานกว่า^{[ 57 ]}

เนื่องจากการพับตัวของโปรตีนเกิดขึ้นในเวลาประมาณ 50 ถึง 3000 วินาที⁻¹การกระจายการผ่อนคลาย CPMG และการถ่ายโอนความอิ่มตัวของการแลกเปลี่ยนทางเคมี จึง กลายเป็นเทคนิคหลักบางส่วนสำหรับการวิเคราะห์การพับตัวด้วย NMR ^{[ 56 ]}นอกจากนี้ เทคนิคทั้งสองยังใช้เพื่อค้นหาสถานะตัวกลางที่ถูกกระตุ้นในภูมิทัศน์การพับตัวของโปรตีน^{[ 58 ]}ในการทำเช่นนี้ การกระจายการผ่อนคลาย CPMG ใช้ประโยชน์จาก ปรากฏการณ์ สปินเอคโคเทคนิคนี้จะทำให้นิวเคลียสเป้าหมายสัมผัสกับพัลส์ 90 ตามด้วยพัลส์ 180 หนึ่งพัลส์หรือมากกว่า^{[ 59 ]}เมื่อนิวเคลียสโฟกัสใหม่ การกระจายตัวที่กว้างจะบ่งชี้ว่านิวเคลียสเป้าหมายเกี่ยวข้องกับสถานะกระตุ้นระดับกลาง การดูพล็อตการกระจายการผ่อนคลายจะรวบรวมข้อมูลเกี่ยวกับอุณหพลศาสตร์และจลนศาสตร์ระหว่างสถานะกระตุ้นและสถานะพื้นฐาน^{[ 59 ] [ 58 ]}การถ่ายโอนความอิ่มตัวจะวัดการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณจากสถานะพื้นฐานเมื่อสถานะกระตุ้นถูกรบกวน ใช้การฉายรังสีคลื่นความถี่วิทยุอ่อนเพื่อทำให้สถานะกระตุ้นของนิวเคลียสเฉพาะอิ่มตัว ซึ่งจะถ่ายโอนความอิ่มตัวไปยังสถานะพื้นฐาน^{[ 56 ]}สัญญาณนี้จะถูกขยายโดยการลดสนามแม่เหล็ก (และสัญญาณ) ของสถานะพื้นฐาน^{[ 56 ] [ 58 ]}

ข้อจำกัดหลักใน NMR คือความละเอียดจะลดลงเมื่อโปรตีนมีขนาดใหญ่กว่า 25 kDa และไม่ละเอียดเท่ากับการวิเคราะห์ด้วยรังสีเอกซ์ [ ^{56 ] นอกจาก}นี้ การวิเคราะห์โปรตีนด้วย NMR ยังค่อนข้างยากและอาจเสนอวิธีแก้ปัญหาได้หลายวิธีจากสเปกตรัม NMR เดียวกัน^{[ 55 ]}

ในการศึกษาที่มุ่งเน้นการพับตัวของโปรตีนSOD1 ที่เกี่ยวข้องกับโรค กล้ามเนื้ออ่อนแรงชนิดอะไมโอโทรฟิก แลเทอรัล ส เคลอโร ซิส ได้มีการศึกษาตัวกลางที่ถูกกระตุ้นด้วยการกระจายการผ่อนคลายและการถ่ายโอนความอิ่มตัว^{[ 60 ]}ก่อนหน้านี้ SOD1 ถูกเชื่อมโยงกับกลายพันธุ์ที่ก่อให้เกิดโรคหลายชนิด ซึ่งสันนิษฐานว่าเกี่ยวข้องกับการรวมตัวของโปรตีน อย่างไรก็ตามกลไกยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด การใช้การทดลองการกระจายการผ่อนคลายและการถ่ายโอนความอิ่มตัวทำให้ค้นพบสถานะตัวกลางที่ถูกกระตุ้นจำนวนมากที่พับตัวผิดปกติใน SOD1 กลายพันธุ์^{[ 60 ]}

การแทรกสอดแบบโพลาไรเซชันคู่เป็นเทคนิคที่ใช้พื้นผิวในการวัดคุณสมบัติทางแสงของชั้นโมเลกุล เมื่อใช้ในการจำแนกลักษณะการพับของโปรตีน จะวัดโครงสร้างโดยการกำหนดขนาดโดยรวมของโมโนเลเยอร์ของโปรตีนและความหนาแน่นแบบเรียลไทม์ที่ความละเอียดระดับซับอังสตรอม^{[ 61 ]}แม้ว่าการวัดจลนศาสตร์ของการพับโปรตีนแบบเรียลไทม์จะจำกัดเฉพาะกระบวนการที่เกิดขึ้นช้ากว่า ~10  Hz ก็ตาม คล้ายกับไดโครอิซึมแบบวงกลม ตัวกระตุ้นสำหรับการพับอาจเป็นสารที่ทำให้เสีย สภาพหรืออุณหภูมิ

การศึกษาการพับตัวของโปรตีนมีความก้าวหน้าอย่างมากในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ด้วยการพัฒนาเทคนิคที่รวดเร็วและสามารถวัดผลได้แบบเรียลไทม์ นักวิจัยสามารถกระตุ้นการพับตัวของโปรตีนที่ยังไม่พับตัวได้อย่างรวดเร็ว และสังเกตพลวัต ที่เกิดขึ้น เทคนิคที่รวดเร็วที่ใช้กันอยู่ ได้แก่ การผสมสารละลายอย่างรวดเร็วมาก วิธีทางเคมีแสง และสเปกโทรสโกปีแบบกระโดดอุณหภูมิด้วยเลเซอร์ นักวิทยาศาสตร์หลายท่านที่ได้มีส่วนร่วมในการพัฒนาเทคนิคเหล่านี้ ได้แก่ Heinrich Roder, Terry Oas, Harry Gray , Martin Gruebele , Brian Dyer, William Eaton, Sheena Radford , Chris Dobson , Alan Fersht , Bengt Nöltingและ Lars Konermann

การสลายโปรตีนมักใช้เพื่อตรวจสอบเศษส่วนที่คลายตัวภายใต้สภาวะสารละลายที่หลากหลาย (เช่นการสลายโปรตีนแบบขนานอย่างรวดเร็ว (FASTpp ) ^{[ 62 ] [ 63 ]}

เทคนิคระดับโมเลกุลเดี่ยว เช่น คีมจับแสงและ AFM ถูกนำมาใช้เพื่อทำความเข้าใจกลไกการพับโปรตีนของโปรตีนที่แยกออกมา รวมถึงโปรตีนที่มีชาเปอโรน^{[ 64 ]}คีมจับแสงถูกใช้เพื่อยืดโมเลกุลโปรตีนเดี่ยวจากปลาย C- และ N- และคลี่ออกเพื่อให้สามารถศึกษาการพับกลับในภายหลังได้^{[ 65 ]}เทคนิคนี้ช่วยให้สามารถวัดอัตราการพับที่ระดับโมเลกุลเดี่ยวได้ ตัวอย่างเช่น คีมจับแสงเพิ่งถูกนำมาใช้เพื่อศึกษาการพับและการคลี่ออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการแข็งตัวของเลือดปัจจัย von Willebrand (vWF) เป็นโปรตีนที่มีบทบาทสำคัญในกระบวนการสร้างลิ่มเลือด มีการค้นพบโดยใช้การวัดคีมจับแสงระดับโมเลกุลเดี่ยวว่า vWF ที่จับกับแคลเซียมทำหน้าที่เป็นเซนเซอร์แรงเฉือนในเลือด แรงเฉือนนำไปสู่การคลี่ออกของโดเมน A2 ของ vWF ซึ่งอัตราการพับกลับจะเพิ่มขึ้นอย่างมากเมื่อมีแคลเซียมอยู่^{[ 66 ]}นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าโดเมน src SH3 ที่เรียบง่าย สามารถเข้าถึงเส้นทางการคลายตัวหลายเส้นทางภายใต้แรง^{[ 67 ]}

การระบายสีไบโอตินช่วยให้สามารถบันทึกภาพเซลล์เฉพาะสภาวะของโปรตีนที่พับ (หรือไม่พับ) ได้ การ 'ระบายสี' ไบโอตินแสดงให้เห็นถึงความเอนเอียงไปทางโปรตีนที่มีโครงสร้างผิดปกติโดยธรรมชาติที่ คาดการณ์ไว้ ^{[ 68 ]}

ในปี พ.ศ. 2512 ไซรัส เลวินธัล สังเกตว่า เนื่องจากจำนวนองศาอิสระจำนวนมากในสายโซ่โพลีเปปไทด์ที่คลี่ออก โมเลกุลจึงมีจำนวนโครงสร้างที่เป็นไปได้มหาศาล มีการประมาณค่าไว้ที่ 3,300 ^หรือ 10,143 ^ในเอกสารฉบับหนึ่งของเขา^{[ 70 ]}ปรากฏการณ์ขัดแย้งของเลวินธัลเป็นการทดลองทางความคิดที่อิงจากการสังเกตว่า หากโปรตีนพับตัวโดยการสุ่มตัวอย่างโครงสร้างที่เป็นไปได้ทั้งหมดตามลำดับ จะต้องใช้เวลานานมหาศาล แม้ว่าจะสุ่มตัวอย่างโครงสร้างในอัตราที่รวดเร็ว (ใน ระดับ นาโนวินาทีหรือพิโควินาที ) ก็ตาม^{[ 71 ]}จากการสังเกตว่าโปรตีนพับตัวได้เร็วกว่านี้มาก เลวินธัลจึงเสนอว่าการค้นหาโครงสร้างแบบสุ่มจะไม่เกิดขึ้น และโปรตีนจึงต้องพับตัวผ่านสถานะกลางที่ มีเสถียรภาพหลาย สถานะ

พื้นที่การกำหนดค่าของโปรตีนระหว่างการพับสามารถมองเห็นได้เป็นภูมิทัศน์พลังงานตามที่ Joseph Bryngelson และPeter Wolynes กล่าวไว้ โปรตีนปฏิบัติตามหลักการของความขัดแย้งน้อยที่สุดซึ่งหมายความว่าโปรตีนที่วิวัฒนาการตามธรรมชาติได้ปรับภูมิทัศน์พลังงานการพับให้เหมาะสมที่สุด^{[ 72 ]}และธรรมชาติได้เลือกลำดับกรดอะมิโนเพื่อให้สถานะการพับของโปรตีนมีความเสถียรเพียงพอ นอกจากนี้ การได้มาซึ่งสถานะการพับจะต้องเป็นกระบวนการที่รวดเร็วเพียงพอ แม้ว่าธรรมชาติจะลดระดับความขัดแย้งในโปรตีนลงแล้ว แต่ก็ยังคงมีอยู่บ้างจนถึงปัจจุบัน ดังที่สามารถสังเกตได้จากการมีจุดต่ำสุดเฉพาะที่ในภูมิทัศน์พลังงานของโปรตีน

ผลที่ตามมาของลำดับที่ได้รับการคัดเลือกทางวิวัฒนาการเหล่านี้คือ โปรตีนโดยทั่วไปมักถูกมองว่ามี "ภูมิทัศน์พลังงานแบบกรวย" ทั่วโลก (คำที่คิดค้นโดยJosé Onuchic ) ^{​​[ 73 ]}ซึ่งส่วนใหญ่มุ่งไปสู่สถานะดั้งเดิม ภูมิทัศน์ " กรวยการพับ " นี้ช่วยให้โปรตีนพับตัวไปสู่สถานะดั้งเดิมได้ผ่านเส้นทางและตัวกลางจำนวนมาก แทนที่จะถูกจำกัดด้วยกลไกเดียว ทฤษฎีนี้ได้รับการสนับสนุนจากการจำลองทางคอมพิวเตอร์ของโปรตีนแบบจำลองและการศึกษาเชิงทดลอง^{[ 72 ]}และได้ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงวิธี การทำนาย และออกแบบโครงสร้างโปรตีน [ ^{72 ] คำ}อธิบายการพับโปรตีนโดยภูมิทัศน์พลังงานอิสระที่ปรับระดับยังสอดคล้องกับกฎข้อที่ 2 ของอุณหพลศาสตร์^{[ 74 ]}ในทางกายภาพ การคิดถึงภูมิทัศน์ในแง่ของพื้นผิวพลังงานศักยภาพหรือพลังงานรวมที่มองเห็นได้โดยมีจุดสูงสุด จุดอานม้า จุดต่ำสุด และกรวย คล้ายกับภูมิทัศน์ทางภูมิศาสตร์ อาจทำให้เข้าใจผิดเล็กน้อย คำอธิบายที่เกี่ยวข้องคือปริภูมิเฟสที่มีมิติสูงซึ่งแมนิโฟลด์อาจมีรูปแบบทางโทโพโลยีที่ซับซ้อนมากขึ้นหลากหลายรูปแบบ^{[ 75 ]}

สายโซ่โพลีเปปไทด์ที่คลี่ออกจะเริ่มต้นที่ด้านบนของกรวย ซึ่งอาจมีรูปแบบการคลี่ออกได้มากที่สุดและอยู่ในสถานะพลังงานสูงสุด ภูมิทัศน์พลังงานเช่นนี้บ่งชี้ว่ามีความเป็นไปได้เริ่มต้นจำนวนมาก แต่มีเพียงสถานะดั้งเดิมเพียงสถานะเดียวเท่านั้นที่เป็นไปได้ อย่างไรก็ตาม มันไม่ได้เปิดเผยเส้นทางการพับที่เป็นไปได้มากมาย โมเลกุลที่แตกต่างกันของโปรตีนชนิดเดียวกันอาจสามารถดำเนินตามเส้นทางการพับที่แตกต่างกันเล็กน้อย โดยแสวงหาตัวกลางพลังงานที่ต่ำกว่าที่แตกต่างกัน ตราบใดที่โครงสร้างดั้งเดิมเดียวกันนั้นบรรลุผล^{[ 76 ]}เส้นทางที่แตกต่างกันอาจมีความถี่ในการใช้งานที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับความเหมาะสมทางอุณหพลศาสตร์ของแต่ละเส้นทาง ซึ่งหมายความว่าหากพบว่าเส้นทางหนึ่งมีความเหมาะสมทางอุณหพลศาสตร์มากกว่าอีกเส้นทางหนึ่ง ก็มีแนวโน้มที่จะถูกใช้บ่อยขึ้นในการแสวงหาโครงสร้างดั้งเดิม^{[ 76 ]}เมื่อโปรตีนเริ่มพับและรับโครงสร้างต่างๆ มันจะแสวงหาโครงสร้างที่มีความเหมาะสมทางอุณหพลศาสตร์มากกว่าเดิมเสมอ และจึงดำเนินต่อไปผ่านกรวยพลังงาน การก่อตัวของโครงสร้างทุติยภูมิเป็นตัวบ่งชี้ที่ชัดเจนถึงความเสถียรที่เพิ่มขึ้นภายในโปรตีน และมีเพียงการรวมกันของโครงสร้างทุติยภูมิเพียงชุดเดียวที่โครงสร้างหลักของพอลิเปปไทด์จะมีพลังงานต่ำที่สุดและจึงมีอยู่ในสถานะดั้งเดิมของโปรตีน^{[ 76 ]}ในบรรดาโครงสร้างแรกๆ ที่ก่อตัวขึ้นเมื่อพอลิเปปไทด์เริ่มพับตัว ได้แก่ อัลฟาเฮลิกซ์และเบตาเทิร์น โดยอัลฟาเฮลิกซ์สามารถก่อตัวได้ในเวลาเพียง 100 นาโนวินาที และเบตาเทิร์นในเวลา 1 ไมโครวินาที^{[ 30 ]}

มีจุดอานม้าในภูมิทัศน์ของกรวยพลังงานซึ่งพบสถานะการเปลี่ยนผ่าน สำหรับโปรตีนเฉพาะ ^{[ 30 ]}สถานะการเปลี่ยนผ่านในแผนภาพกรวยพลังงานคือโครงสร้างที่โมเลกุลทุกโมเลกุลของโปรตีนนั้นต้องมี หากโปรตีนต้องการมีโครงสร้างดั้งเดิมในที่สุด ไม่มีโปรตีนใดสามารถมีโครงสร้างดั้งเดิมได้หากไม่ผ่านสถานะการเปลี่ยนผ่านก่อน^{[ 30 ]}สถานะการเปลี่ยนผ่านอาจถูกเรียกว่าเป็นรูปแบบที่แตกต่างกันหรือรูปแบบก่อนกำหนดของสถานะดั้งเดิมมากกว่าที่จะเป็นเพียงขั้นตอนกลางอีกขั้นตอนหนึ่ง^{[ 77 ]}การพับของสถานะการเปลี่ยนผ่านแสดงให้เห็นว่าเป็นตัวกำหนดอัตรา และถึงแม้ว่ามันจะอยู่ในสถานะพลังงานที่สูงกว่าการพับแบบดั้งเดิม แต่มันก็คล้ายคลึงกับโครงสร้างดั้งเดิมอย่างมาก ภายในสถานะการเปลี่ยนผ่าน มีนิวเคลียสที่โปรตีนสามารถพับตัวได้ ซึ่งเกิดขึ้นจากกระบวนการที่เรียกว่า "การควบแน่นของนิวเคลียส" ซึ่งโครงสร้างเริ่มยุบตัวลงบนนิวเคลียส^{[ 77 ]}

เทคนิค de novoหรือ ab initioสำหรับการทำนายโครงสร้างโปรตีน ด้วยคอมพิวเตอร์ สามารถใช้สำหรับการจำลองแง่มุมต่างๆ ของการพับโปรตีน การจำลองการพับโปรตีนด้วยคอมพิวเตอร์ครั้งแรกสุดเกิดขึ้นในปี 1975 โดย Levitt และ Warshel (Nature 1975) ซึ่งสร้างเส้นทางการพับ ^{[ 78 ]}ที่ยุบตัวลงเป็นโครงสร้างที่ใกล้เคียงกับโครงสร้างที่พับแล้ว และโดยพื้นฐานแล้วเป็นการ "แก้ปัญหา" ของความขัดแย้งของ Leventhal การจำลองยังเกี่ยวข้องกับการจัดการโหมดปกติที่สำรวจแง่มุมพลวัตบางอย่างของกระบวนการพับพลวัตโมเลกุล (MD) ถูกนำมาใช้ในการจำลองการพับและพลวัตของโปรตีนในคอมพิวเตอร์ [ ^{79 ] การ}จำลองการพับสมดุลครั้งแรกทำโดยใช้แบบจำลองตัวทำละลายโดยปริยายและสุ่มตัวอย่างแบบร่ม^{[ 80 ]}เนื่องจากต้นทุนการคำนวณ การจำลองการพับ MD แบบ ab initio ที่มีน้ำอย่างชัดเจนจึงจำกัดเฉพาะเปปไทด์และโปรตีนขนาดเล็ก ^{[ 81 ] [ 82 ]}การจำลอง MD ของโปรตีนขนาดใหญ่ยังคงจำกัดอยู่เฉพาะพลวัตของโครงสร้างเชิงทดลองหรือการคลี่ออกที่อุณหภูมิสูง กระบวนการพับตัวในระยะยาว (เกินกว่าประมาณ 1 มิลลิวินาที) เช่น การพับตัวของโปรตีนขนาดใหญ่ (>150 หน่วยย่อย) สามารถเข้าถึงได้โดยใช้แบบหยาบ^{[ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]}

^{โครงการคำนวณขนาดใหญ่หลาย โครงการ}เช่น Rosetta @ home ^{[ 86 ]} Folding@home ^{[ 87 ]}และFoldit [ ^{88 ]}มุ่งเป้าไปที่การพับโปรตีน

การจำลองวิถีการเคลื่อนที่ต่อเนื่องเป็นเวลานานได้ดำเนินการบนAntonซึ่งเป็นซูเปอร์คอมพิวเตอร์แบบขนานขนาดใหญ่ที่ออกแบบและสร้างขึ้นโดยใช้ASICและการเชื่อมต่อแบบกำหนดเองโดยDE Shaw Researchผลลัพธ์ที่เผยแพร่ที่ยาวที่สุดของการจำลองที่ดำเนินการโดยใช้ Anton ในปี 2011 คือการจำลอง NTL9 ที่อุณหภูมิ 355 K เป็นเวลา 2.936 มิลลิวินาที^{[ 89 ]}ปัจจุบันการจำลองดังกล่าวสามารถคลี่และพับโปรตีนขนาดเล็ก (<150 กรดอะมิโน) ในสภาวะสมดุลและทำนายว่าการกลายพันธุ์ส่งผลต่อจลนศาสตร์การพับและความเสถียรอย่างไร^{[ 90 ]}

ในปี 2020 ทีมวิจัยที่ใช้AlphaFoldซึ่งเป็นโปรแกรมทำนายโครงสร้างโปรตีนด้วยปัญญาประดิษฐ์ (AI) ที่พัฒนาโดย DeepMindได้รับรางวัลชนะเลิศใน การแข่งขันทำนายโครงสร้าง CASPซึ่งเป็นการแข่งขันที่มีมาอย่างยาวนาน^{[ 91 ]}ทีมดังกล่าวบรรลุระดับความแม่นยำที่สูงกว่ากลุ่มอื่น ๆ มาก^{[ 92 ]}โดยทำคะแนนได้สูงกว่า 90% สำหรับโปรตีนประมาณสองในสามในการทดสอบระยะทางทั่วโลก (GDT) ของ CASP ซึ่งเป็นการทดสอบที่วัดระดับความคล้ายคลึงกันระหว่างโครงสร้างที่ทำนายโดยโปรแกรมคอมพิวเตอร์และโครงสร้างเชิงประจักษ์ที่กำหนดจากการทดลองในห้องปฏิบัติการ คะแนน 100 ถือว่าเป็นการจับคู่ที่สมบูรณ์ภายในระยะทางที่ใช้ในการคำนวณ GDT ^{[ 93 ]}

ผลการทำนายโครงสร้างโปรตีนของ AlphaFold ที่ CASP ได้รับการอธิบายว่า "เป็นการเปลี่ยนแปลงครั้งสำคัญ" และ "น่าทึ่ง" ^{[ 94 ] [ 95 ]}นักวิจัยบางคนตั้งข้อสังเกตว่าความแม่นยำไม่สูงพอสำหรับการทำนายหนึ่งในสาม และไม่ได้เปิดเผยกลไกทางกายภาพของการพับโปรตีนเพื่อให้ถือว่าปัญหาการพับโปรตีน ได้รับการแก้ไข ^{[ 96 ]}อย่างไรก็ตาม ถือเป็นความสำเร็จที่สำคัญในชีววิทยาเชิงคำนวณ^{[ 93 ]}และเป็นความก้าวหน้าอย่างมากต่อความท้าทายอันยิ่งใหญ่ของชีววิทยาที่มีมานานหลายทศวรรษ นั่นคือการทำนายโครงสร้างของโปรตีน^{[ 94 ]}