ในการโคลนนิ่งระดับโมเลกุลและชีววิทยาการน็อคอินยีน (ย่อว่าKI ) หมายถึง วิธี การทางวิศวกรรมพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับการแทนที่ข้อมูลลำดับดีเอ็นเอแบบหนึ่งต่อหนึ่งในตำแหน่งทางพันธุกรรมหรือการแทรกข้อมูลลำดับที่ไม่พบในตำแหน่งนั้น^{[ 1 ]}โดยทั่วไปแล้ว วิธีนี้จะทำในหนู เนื่องจากเทคโนโลยีสำหรับกระบวนการนี้มีความละเอียดกว่า และมีความซับซ้อนของลำดับร่วมกันสูงระหว่างหนูและมนุษย์^{[ 2 ]}ความแตกต่างระหว่างเทคโนโลยีการน็อคอินและ เทคนิค การดัดแปลง พันธุกรรมแบบดั้งเดิม คือ การน็อคอินเกี่ยวข้องกับ การแทรก ยีนเข้าไปในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจง ดังนั้นจึงเป็นการแทรกแบบ "กำหนดเป้าหมาย" ซึ่งตรงกันข้ามกับ การ กำจัดยีน

การใช้เทคโนโลยี Knock-in ที่พบได้ทั่วไปคือการสร้างแบบจำลองโรค เป็นเทคนิคที่นักวิจัยทางวิทยาศาสตร์สามารถศึกษาการทำงานของกลไกควบคุม (เช่นโปรโมเตอร์ ) ที่ควบคุมการแสดงออกของยีนธรรมชาติที่ถูกแทนที่ โดยการสังเกต ฟีโนไทป์ ใหม่ ของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษา ในกรณีนี้จะใช้ BACและYACเพื่อให้สามารถถ่ายโอนชิ้นส่วนขนาดใหญ่ได้

เทคนิค การแทรกยีน (Gene knock-in) มีต้นกำเนิดมาจากการดัดแปลงเล็กน้อยของเทคนิคการแทรกยีน (knockout) ดั้งเดิมที่พัฒนาโดยMartin Evans , Oliver SmithiesและMario Capecchiโดยทั่วไป เทคนิคการแทรก ยีนอาศัยการรวมตัวกันของยีนที่เหมือนกัน (homologous recombination)เพื่อขับเคลื่อนการแทนที่ยีนเป้าหมาย แม้ว่าจะมีการพัฒนาวิธีการอื่น ๆ โดยใช้ ระบบที่อาศัย ทรานสโพซอน (transposon -mediated system) เพื่อแทรกยีนเป้าหมาย^{[ 3 ]}การใช้ ไซต์ข้างเคียง loxPที่จะถูกตัดออกเมื่อมีการแสดงออกของCre recombinaseร่วมกับเวกเตอร์ยีนเป็นตัวอย่างหนึ่งของเรื่องนี้ จากนั้น เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่มีการดัดแปลงตามที่ต้องการจะถูกปลูกถ่ายเข้าไปในบลาสโตซิสต์ ที่มีชีวิต ซึ่งจะเติบโตเป็น หนู ไคเมอริกที่ โตเต็มวัย โดยบางเซลล์จะมีข้อมูลทางพันธุกรรมของเซลล์บลาสโตซิสต์ดั้งเดิม และบางเซลล์จะมีข้อมูลทางพันธุกรรมที่นำเข้าสู่เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน ลูกหลานรุ่นต่อ ๆ ไปของหนูไคเมอริกนี้จะมีเทคนิคการแทรกยีน^{[ 4 ]}

การแทรกยีน (Gene knock-in) ทำให้สามารถทำการศึกษาตามสมมติฐานเกี่ยวกับการดัดแปลงยีนและฟีโนไทป์ที่เกิดขึ้นได้เป็นครั้งแรก ตัวอย่างเช่น การกลายพันธุ์ใน ยีน p53 ของมนุษย์ สามารถเกิดขึ้นได้จากการสัมผัสกับเบนโซ(a)ไพรีน (BaP) และสำเนาของยีน p53 ที่กลายพันธุ์สามารถแทรกเข้าไปในจีโนมของหนูได้เนื้องอกในปอดที่พบในหนูที่ได้รับการแทรกยีนนั้นสนับสนุนสมมติฐานเกี่ยวกับความเป็นสารก่อมะเร็ง ของ BaP ^{[ 5 ]}การพัฒนาล่าสุดในเทคนิคการแทรกยีนทำให้สามารถแทรกยีนโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ในหมู ได้ด้วย ระบบ CRISPR/Cas9ซึ่งช่วยให้การแทรกยีนมีความแม่นยำและประสบความสำเร็จมากขึ้น^{[ 6 ]}ความเร็วของการแทรกยีนโดยใช้ CRISPR/Cas9 ยังช่วยให้สามารถ สร้างการดัดแปลง แบบไบอั ลลีลิก ในบางยีนและสังเกตฟีโนไทป์ในหนูได้ภายในรุ่นเดียว ซึ่งเป็นกรอบเวลาที่ไม่เคยมีมาก่อน^{[ 7 ]}

เทคโนโลยี Knock-in แตกต่างจาก เทคโนโลยี Knockoutตรงที่เทคโนโลยี Knockout มีเป้าหมายเพื่อลบส่วนหนึ่งของลำดับ DNA หรือแทรกข้อมูลลำดับ DNA ที่ไม่เกี่ยวข้องเพื่อขัดขวางการแสดงออกของตำแหน่งทางพันธุกรรมที่เฉพาะเจาะจง ในทางกลับกัน เทคโนโลยี Gene knock-in จะเปลี่ยนแปลงตำแหน่งทางพันธุกรรมที่สนใจโดยการแทนที่ข้อมูลลำดับ DNA แบบหนึ่งต่อหนึ่ง หรือโดยการเพิ่มข้อมูลลำดับที่ไม่พบในตำแหน่งทางพันธุกรรมดังกล่าว ดังนั้น Gene knock-in จึงสามารถมองได้ว่าเป็นการกลายพันธุ์แบบเพิ่มฟังก์ชันและ Gene knockout เป็นการกลายพันธุ์แบบลดฟังก์ชันแต่ Gene knock-in อาจเกี่ยวข้องกับการแทนที่ตำแหน่งยีนที่มีฟังก์ชันด้วยฟีโนไทป์กลายพันธุ์ที่ส่งผลให้เกิดการสูญเสียฟังก์ชันบางส่วน^{[ 8 ]}

เนื่องจากความสำเร็จของวิธีการแทรกยีนจนถึงปัจจุบัน ทำให้สามารถมองเห็นการประยุกต์ใช้ทางคลินิกได้มากมาย การแทรกส่วนของยีนอิมมูโนโกลบูลิน ของมนุษย์ เข้าไปในหนูได้แสดงให้เห็นแล้วว่าช่วยให้หนูสามารถผลิตแอนติบอดีของมนุษย์ที่มีประโยชน์ในการรักษาได้^{[ 9 ]}น่าจะเป็นไปได้ที่จะปรับเปลี่ยนเซลล์ต้นกำเนิดในมนุษย์เพื่อฟื้นฟูการทำงานของยีนเป้าหมายในเนื้อเยื่อบางชนิด ตัวอย่างเช่น อาจแก้ไขยีนแกมมาเชนกลายพันธุ์ของตัวรับ IL-2ในเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดเพื่อฟื้นฟู การพัฒนา ของลิมโฟไซต์ ในผู้ที่มี ภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องอย่างรุนแรงที่เชื่อมโยงกับโครโมโซม X ^{[ 4 ]}

แม้ว่าเทคโนโลยีการแทรกยีน (gene knock-in) จะพิสูจน์แล้วว่าเป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพสำหรับการสร้างแบบจำลองโรคในมนุษย์และการทำความเข้าใจโปรตีนในร่างกายแต่ก็ยังมีข้อจำกัดอยู่มากมาย ข้อจำกัดเหล่านี้หลายอย่างคล้ายคลึงกับข้อจำกัดของเทคโนโลยีการกำจัดยีน (knockout) ประการแรก การรวมกันของยีนที่แทรกเข้าไปนำไปสู่ความซับซ้อนที่เพิ่มขึ้นในการปฏิสัมพันธ์ระหว่างยีนที่แทรกเข้าไปและผลิตภัณฑ์ของยีนเหล่านั้นกับส่วนอื่นๆ ของจีโนม และอาจนำไปสู่ผลข้างเคียงมากขึ้นและลักษณะทางฟีโนไทป์ ที่อธิบายได้ยาก นอกจากนี้ มีเพียงไม่กี่ตำแหน่ง เช่น ตำแหน่ง ROSA26 เท่านั้น ที่ได้รับการศึกษาอย่างละเอียดเพียงพอที่จะใช้สำหรับการแทรกยีนแบบมีเงื่อนไข ทำให้การรวมกันของยีนรายงาน และยีนที่ถูกถ่ายทอดในตำแหน่งเดียวกันเป็นปัญหา ข้อเสียที่ใหญ่ที่สุดของการใช้เทคโนโลยีการแทรกยีนสำหรับการสร้างแบบจำลองโรคในมนุษย์คือ สรีรวิทยาของหนูไม่เหมือนกับของมนุษย์ และโปรตีนที่แสดงออกในหนูมักจะไม่สะท้อนบทบาทของยีนในพยาธิวิทยาของมนุษย์อย่างสมบูรณ์^{[ 10 ]}สิ่งนี้สามารถพบได้ในหนูที่เกิดมาโดยมีการกลายพันธุ์ของยีน CFTR ที่ทำให้เกิดพังผืด ΔF508ซึ่งคิดเป็นมากกว่า 70% ของการกลายพันธุ์ในยีนนี้ในประชากรมนุษย์และนำไปสู่โรคซิสติกไฟโบรซิสแม้ว่าหนู CF ΔF508 จะแสดงข้อบกพร่องในการประมวลผลที่เป็นลักษณะเฉพาะของการกลายพันธุ์ในมนุษย์ แต่พวกมันไม่ได้แสดงการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสรีรวิทยาของปอดที่พบในมนุษย์และแทบไม่มีฟีโนไทป์ของปอดเลย^{[ 11 ]}ปัญหาดังกล่าวอาจบรรเทาลงได้โดยการใช้แบบจำลองสัตว์หลายชนิด และแบบจำลองหมู (ปอดของหมูมีความคล้ายคลึงกันทางชีวเคมีและสรีรวิทยาหลายอย่างกับปอดของมนุษย์) ได้ถูกสร้างขึ้นเพื่อพยายามอธิบายกิจกรรมของการกลายพันธุ์ ΔF508 ให้ดียิ่งขึ้น^{[ 12 ]}

• ยีนน็อคเอาท์
• วิศวกรรมพันธุกรรม
• การรวมตัวทางพันธุกรรม
• การโคลนนิ่งระดับโมเลกุล
• พลาสมิด
• เวกเตอร์ (ชีววิทยาโมเลกุล)

• วิธีการทางพันธุศาสตร์ เทคนิค และระเบียบวิธี
• สถาบันวิจัยมะเร็งแบบบูรณาการ Koch แห่ง MIT: การเพิ่มยีนและการกำจัดยีน
• ซอฟต์แวร์เครือข่ายงานวิจัย UMass Profiles: เทคนิคการแทรกยีน – เครื่องมือซอฟต์แวร์สำหรับการสร้างเครือข่ายงานวิจัยและการค้นหาความเชี่ยวชาญ
• http://www.transgenic.co.jp/en/products/mice-service/modified_mouse/knockin.php (เก็บถาวรเมื่อ 2020-04-27 ที่Wayback Machine) – อธิบายกระบวนการสร้างเวกเตอร์แทรกและวิธีการเพาะพันธุ์หนู