การถ่ายภาพแคลเซียมเป็น เทคนิค กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ในการวัด สถานะ แคลเซียม (Ca ²⁺ ) ของเซลล์เนื้อเยื่อ หรือตัวกลางที่แยกออกมาด้วยวิธีทางแสง การถ่ายภาพแคลเซียมใช้ประโยชน์จากตัวบ่งชี้แคลเซียม ซึ่งเป็นโมเลกุลเรืองแสงที่ตอบสนองต่อการจับตัวของไอออน Ca ²⁺ด้วยคุณสมบัติการเรืองแสง ตัวบ่งชี้แคลเซียมมีสองประเภทหลัก ได้แก่ ตัวบ่งชี้ทางเคมีและตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (GECI) ^{[ 1 ]}เทคนิคนี้ทำให้สามารถศึกษาการส่งสัญญาณแคลเซียมในเซลล์หลายประเภท และสามารถใช้ในการวัดกิจกรรมทางไฟฟ้าในเซลล์ประสาทหลายร้อยเซลล์ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ หรือในสัตว์ที่มีชีวิตในระหว่างพฤติกรรมที่กำลังดำเนินอยู่^{[ 2 ]}

ตัวบ่งชี้ทางเคมีเป็นโมเลกุลขนาดเล็กที่สามารถจับกับไอออนแคลเซียมได้ โมเลกุลเหล่านี้ทั้งหมดมีพื้นฐานมาจาก สารประกอบในกลุ่ม EGTAที่เรียกว่าBAPTAซึ่งมีความเลือกจำเพาะสูงต่อไอออนแคลเซียม (Ca ²⁺ ) มากกว่า ไอออน แมกนีเซียม (Mg ²⁺ )

กลุ่มตัวบ่งชี้เหล่านี้ประกอบด้วยfura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4และ Calcium Green-1

สีย้อมเหล่านี้มักใช้ร่วมกับหมู่คาร์บอกซิ ลของสารคีเลต ที่ถูกปิดบังไว้ในรูปของอะซีทอกซีเมทิลเอสเทอร์ เพื่อทำให้โมเลกุลมีคุณสมบัติชอบไขมันและสามารถเข้าสู่เซลล์ได้ง่าย เมื่อสารบ่งชี้ในรูปแบบนี้เข้าไปในเซลล์แล้วเอนไซม์เอสเตอเรส ในเซลล์ จะปลดปล่อยหมู่คาร์บอกซิล และสารบ่งชี้จะสามารถจับกับแคลเซียมได้ นอกจากนี้ สีย้อมในรูปกรดอิสระ (เช่น สีย้อมที่ไม่มีการดัดแปลงด้วยอะซีทอกซีเมทิลเอสเทอร์) ยังสามารถฉีดเข้าไปในเซลล์โดยตรงผ่านไมโครอิเล็กโทรดหรือไมโครปิเปตซึ่งช่วยลดความไม่แน่นอนเกี่ยวกับส่วนประกอบของเซลล์ที่เก็บสีย้อมไว้ (อะซีทอกซีเมทิลเอสเทอร์ยังสามารถเข้าสู่เอนโดพลาสมิกเรติคูลัมและไมโทคอนเดรียได้ ) การจับกันของไอออน Ca²⁺ ^กับโมเลกุลของสารบ่งชี้เรืองแสงจะนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของผลผลิตควอนตัมของการเรืองแสงหรือ การเปลี่ยนแปลง ความยาวคลื่นการปล่อย/การ กระตุ้น สารบ่งชี้เรืองแสง ^Ca²⁺ทางเคมีแต่ละชนิดถูกนำมาใช้สำหรับการวัดแคลเซียมในไซโตพลาสซึมในเซลล์หลายชนิด การถ่ายภาพ Ca ²⁺แบบเรียลไทม์ (อัตราวิดีโอ) ครั้งแรกดำเนินการในปี 1986 ในเซลล์หัวใจโดยใช้กล้องวิดีโอแบบเพิ่มความเข้มแสง^{[ 3 ]}การพัฒนาเทคนิคในภายหลังโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์เผยให้เห็นสัญญาณ Ca ²⁺ ในระดับเซลล์ย่อย ในรูปแบบของประกายไฟCa ²⁺และสัญญาณ Ca ²⁺กระพริบ การตอบสนองสัมพัทธ์จากการรวมกันของตัวบ่งชี้เรืองแสง Ca ²⁺ ทางเคมี ยังถูกนำมาใช้เพื่อหาปริมาณการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมในออร์แกเนลล์ ภายในเซลล์ เช่นไมโตคอนเดรีย^{[ 4 ​​]}

การถ่ายภาพแคลเซียม หรือเรียกอีกอย่างว่าการทำแผนที่แคลเซียม ยังใช้เพื่อทำการวิจัยเกี่ยวกับเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจ^{[ 5 ]}การทำแผนที่แคลเซียมเป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในหัวใจที่แยกออกมาทั้งหมด เช่น หนู หนูแรต และกระต่าย

ตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (GECIs) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพซึ่งมีประโยชน์สำหรับ การถ่ายภาพ ในร่างกายของกระบวนการทางเซลล์ การพัฒนา และสรีรวิทยา^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} GECIs ไม่จำเป็นต้องถูกโหลดเข้าไปในเซลล์ทันที แต่สามารถนำยีนที่เข้ารหัสโปรตีนเหล่านี้เข้าไปในเซลล์แต่ละเซลล์หรือสายเซลล์ได้โดย วิธี การถ่ายทอดทางพันธุกรรม ต่างๆ นอกจากนี้ยังสามารถสร้างสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมที่แสดงตัวบ่งชี้ในเซลล์ทั้งหมดหรือเลือกเฉพาะในเซลล์ย่อยบางชนิดได้ GECIs ถูกนำมาใช้ในการศึกษาเซลล์ประสาท^{[ 10 ] [ 11 ] เซลล์ T [ 12 ] เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ [ 13 ] และเซลล์ประเภทอื่น}ๆ^{GECIsบาง} ชนิดรายงานแคลเซียม^{โดยการปล่อย}โฟตอนโดยตรง (การเรืองแสง ) แต่ส่วนใหญ่อาศัยโปรตีนเรืองแสงเป็นตัวรายงาน รวมถึงโปรตีนเรืองแสงสีเขียวGFPและตัวแปรต่างๆ (eGFP, YFP, CFP)

ในบรรดารีพอร์เตอร์เรืองแสง ระบบตัวบ่งชี้แคลเซียมสามารถจำแนกได้เป็นระบบโปรตีนเรืองแสงเดี่ยว (FP) และระบบโปรตีนเรืองแสงคู่ Camgaroos เป็นหนึ่งในตัวแปรแรกๆ ที่พัฒนาขึ้นโดยใช้ระบบโปรตีนเดี่ยว Camgaroos ใช้ประโยชน์จากcalmodulin (CaM) ซึ่งเป็นโปรตีนที่จับกับแคลเซียม ในโครงสร้างเหล่านี้ CaM จะถูกแทรกเข้าไปตรงกลางของโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (YFP) ที่ Y145 การศึกษาการกลายพันธุ์ก่อนหน้านี้เผยให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งนี้ทำให้ค่า pH มีเสถียรภาพในขณะที่ยังคงคุณสมบัติการเรืองแสงไว้ ทำให้ Y145 เป็นจุดแทรกที่น่าสนใจ นอกจากนี้ ปลาย N และ C ของ YFP ยังเชื่อมต่อกันด้วยตัวเชื่อมเปปไทด์ (GGTGGS) เมื่อ CaM จับกับ Ca2+ ค่า pKa ที่มีประสิทธิภาพจะลดลง ทำให้เกิดการดีโปรโตเนชันของโครโมฟ อร์ ^{[ 14 ]}ส่งผลให้การเรืองแสงเพิ่มขึ้นเมื่อแคลเซียมจับในลักษณะอินเทนซิโอเมตริก การตรวจจับดังกล่าวแตกต่างจากระบบราติเมตริก ซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงในสเปกตรัมการดูดกลืน/การปล่อยแสงอันเป็นผลมาจากการจับกับ Ca2+ ^{[ 15 ]}ระบบ FP เดี่ยวที่พัฒนาขึ้นในภายหลัง เรียกว่าG-CaMPก็ใช้ GFP ที่เรียงลำดับแบบวงกลมเช่นกัน ปลายด้านหนึ่งถูกเชื่อมกับ CaM และปลายอีกด้านหนึ่งถูกเชื่อมกับ M13 (โดเมนการจับแคลโมดูลินของไมโอซินไลท์ไคเนส) ^{[ 16 ]}โปรตีนนี้ได้รับการออกแบบให้ปลายทั้งสองอยู่ใกล้กัน ทำให้การจับกับ Ca2+ ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและการปรับเปลี่ยนโครโมฟอร์ ส่งผลให้ความเรืองแสงเพิ่มขึ้น G-CaMP และรูปแบบที่ได้รับการปรับปรุงแล้วมีค่าความสัมพันธ์ในการจับในระดับนาโนโมลาร์^{[ 17 ]}โปรตีนเดี่ยวรูปแบบสุดท้ายคือ CatchER ซึ่งโดยทั่วไปถือว่าเป็นตัวบ่งชี้ที่มีความสัมพันธ์ต่ำกว่า ช่องจับแคลเซียมของมันมีประจุลบค่อนข้างมาก การจับกับแคตไอออนช่วยป้องกันความเข้มข้นของประจุลบจำนวนมากและทำให้เกิดความเรืองแสงกลับคืนมา^{[ 18 ]}

ตรงกันข้ามกับระบบเหล่านี้คือระบบโปรตีนเรืองแสงแบบจับคู่ ซึ่งรวมถึงCameleon ต้นแบบ Cameleon ประกอบด้วยโปรตีนเรืองแสงสองชนิดที่แตกต่างกัน ได้แก่ CaM, M13 และตัวเชื่อมไกลซิลไกลซีน^{[ 15 ]}ในกรณีที่ไม่มี Ca2+ เฉพาะโปรตีนเรืองแสงที่เลื่อนไปทางสีน้ำเงินเท่านั้นที่จะเรืองแสง อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกิดจากการจับกับแคลเซียมจะเปลี่ยนตำแหน่งของโปรตีนเรืองแสงที่เลื่อนไปทางสีแดง ทำให้ เกิด FRET (การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ของฟอร์สเตอร์) ขึ้นได้ ตัวบ่งชี้ Cameleon สร้างสัญญาณแบบอัตราส่วน (กล่าวคือ ประสิทธิภาพ FRET ที่วัดได้ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของแคลเซียม) Cameleon รุ่นดั้งเดิมมีความไวต่อ Ca2+ มากกว่าและถูกดับด้วยกรด^{[ 19 ]}ข้อบกพร่องดังกล่าวถูกยกเลิกโดยการกลายพันธุ์ Q69K และ V68L เรซิเดนซ์ทั้งสองนี้อยู่ใกล้กับโครโมฟอร์แอนไอออนิกที่ฝังอยู่ และการกลายพันธุ์เหล่านี้อาจขัดขวางการโปรตอน ทำให้มีความต้านทานต่อ pH มากขึ้น

GECI ในย่านอินฟราเรดใกล้ (NIR) มีความสำคัญเพิ่มมากขึ้นในการตรวจจับแคลเซียม ซึ่งอาจเปิดช่องทางสำหรับการใช้ระบบตัวบ่งชี้ที่แตกต่างกันหลายระบบพร้อมกัน และช่วยให้สามารถแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้ลึกขึ้น NIR GECI อาศัยโปรตีนเรืองแสงที่จับกับบิลิเวอร์ดิน ซึ่งส่วนใหญ่ได้มาจากไฟโตโครม ของแบคทีเรีย ระบบ NIR คล้ายกับเพริแคมแบบผกผันตรงที่ทั้งสองระบบมีการลดลงของความเรืองแสงเมื่อมีการจับกับ Ca2+ RCaMP และ RGECO ทำงานได้ที่ 700+ นาโนเมตร แต่ค่อนข้างมืด^{[ 32 ]}อะนาล็อกของคาเมลีออนที่เกี่ยวข้องกับ NIR FRET ได้รับการสร้างขึ้นสำเร็จแล้วเช่นกัน^{[ 33 ]}

GECI ประเภทพิเศษได้รับการออกแบบมาเพื่อสร้างแท็กเรืองแสงถาวรในเซลล์ประสาทที่ทำงานอยู่ โดยอิงจากโปรตีนEos ที่สามารถเปลี่ยนสถานะด้วยแสง ซึ่งจะเปลี่ยนจากสีเขียวเป็นสีแดงผ่านการแตกตัวของโครงสร้างหลักด้วยแสง (แสงสีม่วง) ^{[ 34 ]}เมื่อรวมกับ CaM แสงสีม่วงจะเปลี่ยนสถานะด้วยแสงเฉพาะเซลล์ประสาทที่มีระดับแคลเซียมสูงเท่านั้น SynTagMA เป็น CaMPARI2 เวอร์ชันที่กำหนดเป้าหมายไปยังไซแนปส์^{[ 35 ]}

แม้ว่าระบบเรืองแสงจะถูกใช้กันอย่างแพร่หลาย แต่ตัวรายงาน Ca2+ ที่เรืองแสงทางชีวภาพก็อาจมีศักยภาพเช่นกัน เนื่องจากความสามารถในการกำจัดออโตฟลูออเรสเซนซ์ การฟอกสีด้วยแสง [ไม่จำเป็นต้องใช้ความยาวคลื่นกระตุ้น] การย่อยสลายทางชีวภาพ และความเป็นพิษ รวมถึงอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่สูงขึ้น^{[ 39 ]}ระบบดังกล่าวอาจอาศัยเอควอรินและลูซิเฟอรินโคเอเลนเทอราซีน การจับกับ Ca2+ ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ช่วยให้เกิดการออกซิเดชันของโคเอเลนเทอราซีน ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาแสงจะปล่อยแสงสีน้ำเงินเมื่อกลับสู่สถานะพื้นฐาน การรวมตัวกันของเอควอรินกับ GFP ช่วยให้เกิด BRET/CRET (การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ของการเรืองแสงทางชีวภาพหรือการเรืองแสงทางเคมี) ^{[ 18 ]}ส่งผลให้ความสว่างเพิ่มขึ้น 19 - 65 เท่า^{[ 39 ]}โครงสร้างดังกล่าวสามารถใช้เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของแคลเซียมในระดับมิลลิโมลาร์ถึงนาโนโมลาร์ได้ ระบบที่คล้ายกันนี้ใช้ obelin และ luciferin coelenteramide ซึ่งอาจมีเวลาตอบสนองต่อแคลเซียมที่เร็วกว่าและไม่ไวต่อ Mg2+ มากกว่า aqueorin ที่เป็นคู่กัน^{[ 40 ]}ระบบดังกล่าวยังสามารถใช้ประโยชน์จากการประกอบตัวเองของส่วนประกอบ luciferase ได้อีกด้วย ในระบบที่เรียกว่า "nano-lantern" luciferase RLuc8 จะถูกแยกออกและวางไว้ที่ปลายที่แตกต่างกันของ CaM การจับแคลเซียมทำให้ส่วนประกอบ RLuc8 อยู่ใกล้กันมากขึ้น ก่อตัวเป็น luciferase ขึ้นใหม่ และทำให้สามารถถ่ายโอนไปยังโปรตีนเรืองแสงตัวรับได้

เพื่อลดความเสียหายต่อเซลล์ที่มองเห็นได้ มักใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนในการตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์จากรีพอร์เตอร์^{[ 41 ]}การใช้ความยาวคลื่นใกล้อินฟราเรดและการลดการกระจายตัวตามแนวแกนของฟังก์ชันจุด^{[ 42 ]}ช่วยให้ได้ความละเอียดระดับนาโนเมตรและการเจาะลึกเข้าไปในเนื้อเยื่อ ช่วงไดนามิกมักถูกกำหนดจากการวัดดังกล่าว สำหรับตัวบ่งชี้ที่ไม่ใช่แบบอัตราส่วน (โดยทั่วไปคือตัวบ่งชี้โปรตีนเดี่ยว) จะเป็นอัตราส่วนของความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ที่ได้ภายใต้สภาวะที่อิ่มตัวและขาด Ca2+ ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม สำหรับตัวบ่งชี้แบบอัตราส่วน ช่วงไดนามิกคืออัตราส่วนของอัตราส่วนประสิทธิภาพ FRET สูงสุด (แคลเซียมอิ่มตัว) ต่ออัตราส่วนประสิทธิภาพ FRET ต่ำสุด (แคลเซียมขาด) ปริมาณทั่วไปอีกอย่างหนึ่งที่ใช้ในการวัดสัญญาณที่เกิดจากการไหลของความเข้มข้นของแคลเซียมคืออัตราส่วนสัญญาณต่อเส้นฐาน (SBR) ซึ่งเป็นเพียงอัตราส่วนของการเปลี่ยนแปลงในฟลูออเรสเซนซ์ (F - F0) ต่อฟลูออเรสเซนซ์พื้นฐาน สิ่งนี้สามารถเชื่อมโยงกับ SNR (อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน) ได้โดยการคูณ SBR ด้วยรากที่สองของจำนวนโฟตอนที่นับได้^{[ 18 ]}

ไม่ว่าจะเป็นตัวบ่งชี้ประเภทใด ขั้นตอนการถ่ายภาพโดยทั่วไปจะคล้ายคลึงกันมาก เซลล์ที่บรรจุตัวบ่งชี้ หรือแสดงออกในกรณีของ GECI ^{[ 43 ]}สามารถมองเห็นได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์และบันทึกภาพโดยกล้อง Scientific CMOS (sCMOS) ^{[ 44 ]}หรือกล้อง CCD กล้องจุลทรรศน์ คอนโฟคอลและกล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนให้ความสามารถในการตัดภาพด้วยแสง ทำให้สามารถแยกสัญญาณแคลเซียมในไมโครโดเมน เช่นหนามเดนไดรต์หรือปุ่มประสาทแม้ในตัวอย่างที่มีความหนา เช่น สมองของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ภาพจะถูกวิเคราะห์โดยการวัดการเปลี่ยนแปลงความเข้มของฟลูออเรสเซนต์สำหรับความยาวคลื่นเดียวหรือสองความยาวคลื่นที่แสดงเป็นอัตราส่วน (ตัวบ่งชี้แบบอัตราส่วน) หากจำเป็น ความเข้มของฟลูออเรสเซนต์และอัตราส่วนที่ได้มาอาจถูกพล็อตเทียบกับค่าที่ปรับเทียบแล้วสำหรับระดับ Ca ²⁺ ที่ทราบ เพื่อวัดความเข้มข้นของ Ca ²⁺ สัมบูรณ์ วิธีการกล้องจุลทรรศน์สนามแสง^{[ 45 ]}ขยายความสามารถในการอ่านค่าการทำงานของกิจกรรมประสาทในปริมาตร 3 มิติ

วิธีการต่างๆ เช่นการวัดแสงด้วยไฟเบอร์โฟโตเม ตรี ^{[ 46 ] [ 47 ]}กล้องจุลทรรศน์ขนาดเล็ก^{[ 48 ]}และกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน^{[ 49 ] [ 50 ]}ช่วยให้สามารถถ่ายภาพแคลเซียมในแบบจำลองสัตว์ที่มีพฤติกรรมอิสระและแบบตรึงหัวได้