การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตคือการศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบไทม์แลปส์นักวิทยาศาสตร์ใช้เพื่อทำความเข้าใจการทำงานทางชีวภาพได้ดียิ่งขึ้นผ่านการศึกษาพลวัตของเซลล์^{[ 1 ]}การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตได้รับการบุกเบิกในช่วงทศวรรษแรกของศตวรรษที่ 21 หนึ่งในภาพยนตร์ไมโครซีนีมาโตกราฟีแบบไทม์แลปส์เรื่องแรกๆ ที่สร้างขึ้นเกี่ยวกับเซลล์นั้นสร้างโดยจูเลียส รีส์ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการปฏิสนธิและการพัฒนาของไข่เม่นทะเล^{[ 2 ]}ตั้งแต่นั้นมา วิธีการทางกล้องจุลทรรศน์หลายวิธีได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตในรายละเอียดมากขึ้นโดยใช้ความพยายามน้อยลง มีการใช้การถ่ายภาพแบบใหม่โดยใช้ควอนตัมดอทเนื่องจากแสดงให้เห็นว่ามีความเสถียรมากกว่า^{[ 3 ]}การพัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบโฮโลโทโมกราฟิกได้ขจัดความเป็นพิษจากแสงและข้อเสียอื่นๆ ที่เกิดจากการย้อมสีโดยการใช้การย้อมสีดิจิทัลตามดัชนีการหักเหของแสงของเซลล์^{[ 4 ] [ 5 ]}

ระบบชีวภาพดำรงอยู่เป็นปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนของส่วนประกอบเซลล์ จำนวนนับไม่ถ้วน ที่โต้ตอบกันในสี่มิติเพื่อสร้างปรากฏการณ์ที่เรียกว่าชีวิต ในขณะที่เป็นเรื่องปกติที่จะลดสิ่งมีชีวิตให้เป็นตัวอย่างที่ไม่มีชีวิตเพื่อรองรับเครื่องมือถ่ายภาพแบบคงที่แบบดั้งเดิม ยิ่งตัวอย่างเบี่ยงเบนจากสภาวะดั้งเดิมมากเท่าใด กระบวนการที่ละเอียดอ่อนที่เกี่ยวข้องก็ยิ่งมีแนวโน้มที่จะแสดงการรบกวนมากขึ้นเท่านั้น^{[ 6 ]} ดังนั้น งานที่ยากลำบากในการจับภาพ เอกลักษณ์ ทางสรีรวิทยา ที่แท้จริง ของเนื้อเยื่อที่มีชีวิตจึงต้องการการแสดงภาพที่มีความละเอียดสูงทั้งในเชิงพื้นที่และเวลาภายในสิ่งมีชีวิตต้นกำเนิด^{[ 7 ]}ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีของการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิต ซึ่งออกแบบมาเพื่อให้ภาพเชิงพื้นที่และ เวลาของเหตุการณ์ ระดับเซลล์ย่อยแบบเรียลไทม์ มีบทบาทสำคัญในการยืนยันความเกี่ยวข้องทางชีวภาพของการเปลี่ยนแปลงทางสรีรวิทยาที่สังเกตได้ระหว่างการทดลอง เนื่องจากความสัมพันธ์ที่ต่อเนื่องกับสภาวะทางสรีรวิทยา การทดสอบเซลล์ที่มีชีวิตจึงถือเป็นมาตรฐานสำหรับการตรวจสอบเหตุการณ์ของเซลล์ที่ซับซ้อนและไดนามิก^{[ 8 ]}เนื่องจากกระบวนการไดนามิก เช่นการอพยพการพัฒนาเซลล์และการขนส่งภายในเซลล์กลายเป็นจุดสนใจของการวิจัยทางชีววิทยามากขึ้นเรื่อยๆ เทคนิคที่สามารถบันทึกข้อมูล 3 มิติแบบเรียลไทม์สำหรับเครือข่ายเซลล์ ( in situ ) และสิ่งมีชีวิตทั้งหมด ( in vivo ) จะกลายเป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้ในการทำความเข้าใจระบบชีววิทยา การยอมรับโดยทั่วไปของการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตได้นำไปสู่การขยายตัวอย่างรวดเร็วของจำนวนผู้ปฏิบัติงานและสร้างความต้องการความละเอียดเชิงพื้นที่และเวลาที่เพิ่มขึ้นโดยไม่กระทบต่อสุขภาพของเซลล์^{[ 9 ]}

ก่อนการนำกล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์มาใช้ การสังเกตเซลล์ที่มีชีวิตนั้นทำได้ยาก เนื่องจากเซลล์ที่มีชีวิตนั้นโปร่งแสง จึงต้องย้อมสีเพื่อให้มองเห็นได้ในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ทั่วไป น่าเสียดายที่กระบวนการย้อมสีเซลล์มักจะทำให้เซลล์ตาย ด้วยการประดิษฐ์กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ ทำให้สามารถสังเกตเซลล์ที่มีชีวิตที่ไม่ต้องย้อมสีได้อย่างละเอียด หลังจากมีการนำกล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์มาใช้ในช่วงทศวรรษ 1940 การถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตก็ได้รับความนิยมอย่างรวดเร็ว^{[ 11 ]}กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ได้รับความนิยมผ่านภาพยนตร์ไทม์แลปส์หลายเรื่อง (ดูวิดีโอ) ที่บันทึกโดยใช้กล้องถ่ายภาพฟิล์ม^{[ 12 ]}ผู้ประดิษฐ์คือFrits Zernikeได้รับรางวัลโนเบลในปี 1953 ^{[ 13 ]}เทคนิคเฟสคอนทราสต์อื่นๆ ที่ใช้ในภายหลังเพื่อสังเกตเซลล์ที่ไม่ต้องย้อมสี ได้แก่การปรับแบบฮอฟฟ์แมนและกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์การรบกวน เชิงอนุพันธ์

กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ไม่มีความสามารถในการสังเกตโปรตีนเฉพาะหรือสารประกอบเคมีอินทรีย์อื่นๆ ที่ประกอบเป็นกลไกที่ซับซ้อนของเซลล์ดังนั้นจึงมีการพัฒนาสีย้อมเรืองแสง สังเคราะห์และอินทรีย์เพื่อติดฉลากสารประกอบดังกล่าว ทำให้สามารถสังเกตได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (ดูวิดีโอ) ^{[ 15 ]}อย่างไรก็ตาม สีย้อมเรืองแสงเป็นพิษต่อแสงรุกราน และซีดจางเมื่อสังเกต ซึ่งจำกัดการใช้งานเมื่อสังเกตเซลล์ที่มีชีวิตเป็นเวลานาน ดังนั้นเทคนิคเฟสคอนทราสต์แบบไม่รุกรานจึงมักถูกใช้เป็นส่วนเสริมที่สำคัญสำหรับกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงในการใช้งานการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิต^{[ 16 ] [ 17 ]}อย่างไรก็ตาม วิธีการกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่ใช้การเรียนรู้เชิงลึกช่วยลดภาระแสงและความเป็นพิษต่อแสง และช่วยให้สามารถถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตที่มีความละเอียดสูงซ้ำๆ ได้^{[ 18 ]}

เนื่องจากการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของความหนาแน่นพิกเซลของเซนเซอร์ภาพ ดิจิทัล กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสเชิงปริมาณจึงกลายเป็นวิธีการกล้องจุลทรรศน์ทางเลือกสำหรับการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิต^{[ 20 ] [ 21 ]}กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสเชิงปริมาณมีข้อได้เปรียบเหนือกล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนต์และแบบคอนทราสต์เฟสตรงที่มันไม่รุกรานและมีลักษณะเชิงปริมาณ

เนื่องจากความลึกโฟกัสที่แคบของกล้องจุลทรรศน์แบบดั้งเดิม การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตจึงถูกจำกัดไว้มากในปัจจุบันโดยการสังเกตเซลล์บนระนาบเดียว การใช้งานกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสเชิงปริมาณส่วนใหญ่ช่วยให้สามารถสร้างและโฟกัสภาพที่ระนาบโฟกัสต่างๆ ได้จากการเปิดรับแสงเพียงครั้งเดียว ซึ่งเปิดโอกาสในอนาคตสำหรับการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตแบบ 3 มิติโดยใช้เทคนิคฟลูออเรสเซนซ์^{[ 22 ]}กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสเชิงปริมาณที่มีการสแกนแบบหมุนช่วยให้สามารถบันทึกภาพไทม์แลปส์แบบ 3 มิติของเซลล์มีชีวิตได้ที่ความละเอียดสูง^{[ 23 ] [ 24 ] [ 4 ]}

โฮโลโทโมกราฟี (HT) เป็นเทคนิคเลเซอร์ที่ใช้ในการวัด ค่าดัชนีหักเห (RI) แบบสามมิติของตัวอย่างขนาดเล็ก เช่น เซลล์และเนื้อเยื่อทางชีวภาพ เนื่องจากค่า RI สามารถใช้เป็นคอนทราสต์ในการสร้างภาพสำหรับวัตถุโปร่งใสหรือวัตถุเฟส การวัดค่า RI จึงสามารถให้ภาพเชิงปริมาณแบบไม่ต้องใช้สารเรืองแสงสำหรับวัตถุเฟสขนาดเล็กได้ ในการวัดค่า RI แบบสามมิติของตัวอย่าง HT ใช้หลักการของการสร้างภาพโฮโลแกรมและการกระเจิงแบบผกผันโดยทั่วไป จะมีการวัดภาพโฮโลแกรมสองมิติหลายภาพของตัวอย่างที่มุมการส่องสว่างต่างๆ โดยใช้หลักการของการสร้างภาพแบบอินเตอร์เฟอโรเมตริก จากนั้นจะสร้างภาพ RI แบบสามมิติของตัวอย่างขึ้นใหม่จากภาพโฮโลแกรมสองมิติหลายภาพเหล่านี้โดยการแก้ปัญหาการกระเจิงของแสงในตัวอย่างแบบผกผัน

หลักการของ HT คล้ายคลึงกับเอกซเรย์คอมพิวเตอร์โทโมกราฟี (CT) หรือCT สแกน CT สแกนจะวัดภาพเอกซเรย์ 2 มิติหลายภาพของร่างกายมนุษย์ที่มุมการส่องสว่างต่างๆ กัน จากนั้นจึงสร้างโทโมแกรม 3 มิติ (การดูดซับเอกซเรย์) โดยใช้ทฤษฎีการกระเจิงผกผัน ทั้งเอกซเรย์ CT และเลเซอร์ HT ใช้สมการควบคุมเดียวกัน คือ สมการเฮล์มโฮลทซ์ ซึ่งเป็นสมการคลื่นสำหรับความยาวคลื่นเอกรงค์ HT ยังเป็นที่รู้จักในชื่อโทโมกราฟีการเลี้ยวเบนทางแสงอีกด้วย

การผสมผสานระหว่างโฮโลแกรมและการสแกนแบบหมุนช่วยให้สามารถบันทึกเซลล์ที่มีชีวิตได้ในระยะยาวโดยไม่ต้องใช้สารเรืองแสง

นาโนสโคปีแบบออปติคอลที่ไม่รุกรานสามารถบรรลุความละเอียดด้านข้างดังกล่าวได้โดยใช้แผนการตรวจจับแบบโฮโลแกรมกึ่ง2πและการดีคอนโวลูชันที่ซับซ้อน ความถี่เชิงพื้นที่ของเซลล์ที่ถ่ายภาพนั้นไม่มีความหมายใดๆ ต่อสายตาของมนุษย์ แต่ความถี่ที่กระจัดกระจายเหล่านี้จะถูกแปลงเป็นโฮโลแกรมและสังเคราะห์แบนด์พาส ซึ่งมีความละเอียดเป็นสองเท่าของความละเอียดที่มีอยู่โดยทั่วไป โฮโลแกรมจะถูกบันทึกจากทิศทางการส่องสว่างที่แตกต่างกันบนระนาบตัวอย่างและสังเกตการเปลี่ยนแปลงโทโมกราฟิกย่อยความยาวคลื่นของตัวอย่าง รูรับแสงระดับนาโนใช้เพื่อสอบเทียบการสร้างโทโมกราฟิกและเพื่อกำหนดลักษณะของระบบการถ่ายภาพโดยใช้ฟังก์ชันการถ่ายโอนที่สอดคล้องกัน ซึ่งก่อให้เกิดการกรองผกผันที่สมจริงและรับประกันการสร้างสนามที่ซับซ้อนที่แท้จริง^{[ 24 ]}

โดยสรุปแล้ว คำศัพท์ 2 คำ ได้แก่ (i) ความละเอียดเชิงแสง (ความละเอียดจริง) และ (ii) ความละเอียดการสุ่มตัวอย่าง (ความละเอียดบนหน้าจอ) จะถูกแยกออกจากกันสำหรับกล้องจุลทรรศน์โฮโลโทโมกราฟิก 3 มิติ

การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตเป็นการประนีประนอมอย่างระมัดระวังระหว่างการได้ภาพที่มีความละเอียดสูงสุดและการรักษาเซลล์ให้มีชีวิตอยู่ได้นานที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้^{[ 25 ]}ด้วยเหตุนี้ นักจุลทัศน์เซลล์มีชีวิตจึงต้องเผชิญกับความท้าทายเฉพาะที่มักถูกมองข้ามเมื่อทำงานกับตัวอย่างที่ตรึงไว้ ยิ่งไปกว่านั้น การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตมักใช้ระบบออปติคอลและข้อกำหนดของตัวตรวจจับพิเศษ ตัวอย่างเช่น ในอุดมคติแล้ว กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ในการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตควรมีอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน สูง อัตราการได้ภาพที่รวดเร็วเพื่อบันทึกวิดีโอแบบไทม์แลปส์ของเหตุการณ์ภายนอกเซลล์ และรักษาความมีชีวิตของเซลล์ในระยะยาว^{[ 26 ]}อย่างไรก็ตาม การเพิ่มประสิทธิภาพแม้เพียงด้านเดียวของการได้ภาพก็อาจต้องใช้ทรัพยากรจำนวนมากและควรพิจารณาเป็นกรณีๆ ไป

ในกรณีที่จำเป็นต้องมีพื้นที่เพิ่มเติมระหว่างเลนส์วัตถุและตัวอย่างเพื่อทำงานกับตัวอย่าง สามารถใช้เลนส์แห้งได้ ซึ่งอาจต้องมีการปรับวงแหวนแก้ไขเพิ่มเติม ซึ่งจะเปลี่ยนตำแหน่งของเลนส์ในเลนส์วัตถุ เพื่อชดเชยความแตกต่างในห้องถ่ายภาพ เลนส์วัตถุพิเศษได้รับการออกแบบมาพร้อมกับวงแหวนแก้ไขที่แก้ไขความคลาดเคลื่อนทรงกลมในขณะที่คำนึงถึงความหนาของแผ่นปิด ในเลนส์วัตถุแห้งที่มีค่ารูรับแสงเชิงตัวเลข (NA) สูง วงแหวนปรับวงแหวนแก้ไขจะเปลี่ยนตำแหน่งของกลุ่มเลนส์ที่เคลื่อนที่ได้ เพื่อชดเชยความแตกต่างในวิธีที่ด้านนอกของเลนส์โฟกัสแสงเมื่อเทียบกับศูนย์กลาง แม้ว่าความคลาดเคลื่อนของเลนส์จะเป็นสิ่งที่เกิดขึ้นโดยธรรมชาติในการออกแบบเลนส์ทั้งหมด แต่ความคลาดเคลื่อนเหล่านี้จะกลายเป็นปัญหามากขึ้นในเลนส์แห้ง ซึ่งการรักษาความละเอียดเป็นสิ่งสำคัญ^{[ 27 ]}

การแช่ในน้ำมันเป็นเทคนิคที่สามารถเพิ่มความละเอียดของภาพได้โดยการแช่เลนส์และตัวอย่างในน้ำมันที่มีดัชนีหักเห สูง เนื่องจากแสงจะหักเหเมื่อผ่านระหว่างตัวกลางที่มีดัชนีหักเหต่างกัน การวางน้ำมันที่มีดัชนีหักเหเท่ากับกระจกระหว่างเลนส์และสไลด์จะช่วยหลีกเลี่ยงการเปลี่ยนดัชนีหักเหสองครั้งได้^{[ 28 ]}อย่างไรก็ตาม สำหรับการใช้งานส่วนใหญ่ แนะนำให้ใช้การแช่ในน้ำมันกับตัวอย่างที่ตรึงไว้ (ตายแล้ว) เนื่องจากเซลล์ที่มีชีวิตต้องการสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำ และการผสมน้ำมันกับน้ำอาจทำให้เกิดความคลาดเคลื่อนทรงกลมอย่างรุนแรง สำหรับการใช้งานบางอย่าง สามารถใช้ น้ำมันซิลิโคนเพื่อสร้างภาพที่แม่นยำยิ่งขึ้น น้ำมันซิลิโคนเป็นตัวกลางที่น่าสนใจเพราะมีดัชนีหักเหใกล้เคียงกับเซลล์ที่มีชีวิต ทำให้สามารถสร้างภาพที่มีความละเอียดสูงในขณะที่ลดความคลาดเคลื่อนทรงกลมให้น้อยที่สุด^{[ 27 ]}

การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตต้องใช้ตัวอย่างในสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำ ซึ่งมักจะอยู่ห่างจากกระจกปิดประมาณ 50 ถึง 200 ไมโครเมตร ดังนั้น เลนส์แช่น้ำจึงช่วยให้ได้กำลังการแยกภาพที่สูงขึ้น เนื่องจากทั้งสภาพแวดล้อมและเซลล์เองจะมีดัชนีหักเหใกล้เคียงกับน้ำ เลนส์แช่น้ำได้รับการออกแบบให้เข้ากันได้กับดัชนีหักเหของน้ำ และมักจะมีวงแหวนปรับแก้ที่ช่วยให้สามารถปรับเลนส์ได้ นอกจากนี้ เนื่องจากดัชนีหักเหของน้ำสูงกว่า เลนส์แช่น้ำจึงมีค่ารูรับแสงเชิงตัวเลข สูง และสามารถสร้างภาพที่เหนือกว่าเลนส์แช่น้ำมันเมื่อแยกภาพในระนาบที่ลึกกว่า 0 ไมโครเมตร^{[ 27 ]}

อีกหนึ่งวิธีแก้ปัญหาสำหรับการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตคือเลนส์จุ่ม เลนส์เหล่านี้เป็นเลนส์ประเภทหนึ่งที่แช่ในน้ำ ซึ่งไม่จำเป็นต้องใช้แผ่นปิดและสามารถจุ่มลงในสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำของตัวอย่างได้โดยตรง ข้อดีหลักประการหนึ่งของเลนส์จุ่มคือมีระยะการทำงานที่มีประสิทธิภาพยาว^{[ 29 ]}เนื่องจากไม่จำเป็นต้องใช้แผ่นปิด เลนส์ประเภทนี้จึงสามารถเข้าใกล้พื้นผิวของตัวอย่างได้ และส่งผลให้ความละเอียดถูกจำกัดด้วยข้อจำกัดที่เกิดจากความคลาดเคลื่อนทรงกลมมากกว่าข้อจำกัดทางกายภาพของแผ่นปิด แม้ว่าเลนส์จุ่มจะมีประโยชน์มาก แต่ก็ไม่เหมาะสำหรับการทดลองทั้งหมด เนื่องจากกระบวนการ "จุ่ม" เลนส์อาจรบกวนเซลล์ในตัวอย่างได้ นอกจากนี้ เนื่องจากห้องบ่มต้องเปิดออกสู่เลนส์ การเปลี่ยนแปลงในสภาพแวดล้อมของตัวอย่างเนื่องจากการระเหยจึงต้องได้รับการตรวจสอบอย่างใกล้ชิด^{[ 27 ]}

ปัจจุบัน เทคนิคการถ่ายภาพสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่ใช้ระบบแสงสว่างสูงหรือการติดฉลากด้วยสารเรืองแสง ซึ่งทั้งสองวิธีนี้ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์จากแสง และลดความสามารถในการรักษาสภาพเซลล์ให้คงอยู่ได้นาน เนื่องจากความรู้ทางชีววิทยาของเรามาจากการสังเกต จึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องลดการรบกวนที่เกิดจากเทคนิคการถ่ายภาพให้น้อยที่สุด

การพัฒนาของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการเข้าถึงเลเซอร์กำลังสูง ซึ่งสามารถสร้างความเข้มแสงกระตุ้นได้สูง อย่างไรก็ตาม กำลังเอาต์พุตสูงอาจทำให้ฟลูออโรฟอร์ ที่ไวต่อแสงเสียหายได้ ดังนั้นเลเซอร์จึงมักทำงานที่กำลังเอาต์พุตต่ำกว่ากำลังเต็มที่^{[ 30 ]}การได้รับแสงมากเกินไปอาจทำให้เกิดความเสียหายจากแสงเนื่องจากการฟอกสีด้วยแสงหรือความเป็นพิษจากแสงผลกระทบของการฟอกสีด้วยแสงสามารถลดคุณภาพของภาพเรืองแสงได้อย่างมาก และในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีความต้องการฟลูออโรฟอร์เชิงพาณิชย์ที่มีอายุการใช้งานยาวนานขึ้นอย่างมาก หนึ่งในวิธีแก้ปัญหาคือ ชุด Alexa Fluorซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีการซีดจางน้อยมากหรือไม่มีเลยแม้ที่ความเข้มของเลเซอร์สูง^{[ 31 ]}

ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา เซลล์และเนื้อเยื่อหลายชนิดจะสัมผัสกับแสงในระดับต่ำเท่านั้น^{[ 32 ]}ด้วยเหตุนี้ จึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องลดการสัมผัสของเซลล์ที่มีชีวิตกับรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) อินฟราเรด (IR) หรือความยาวคลื่นกระตุ้นการเรืองแสงในปริมาณสูง ซึ่งสามารถทำลาย DNAเพิ่มอุณหภูมิของเซลล์ และทำให้เกิดการฟอกสีด้วยแสงตามลำดับ^{[ 33 ]}โฟตอนพลังงานสูงที่ถูกดูดซับโดยฟลูออโรฟอร์และตัวอย่างจะถูกปล่อยออกมาที่ความยาวคลื่นที่ยาวขึ้นตามสัดส่วนของการเลื่อนของสโตกส์ [ ^{34 ] อย่างไรก็ตาม}ออร์แกเนลล์ของเซลล์อาจได้รับความเสียหายเมื่อพลังงานโฟตอนทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางเคมีและโมเลกุลแทนที่จะถูกปล่อยออกมาใหม่^{[ 35 ]}เชื่อกันว่าสาเหตุหลักของความเป็นพิษที่เกิดจากแสงในเซลล์ที่มีชีวิตคืออนุมูลอิสระที่เกิดจากการกระตุ้นโมเลกุลเรืองแสง^{[ 32 ]}อนุมูลอิสระเหล่านี้มีปฏิกิริยาสูงและทำให้เกิดการทำลายส่วนประกอบของเซลล์ ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดพฤติกรรมที่ไม่เป็นไปตามสรีรวิทยา

วิธีหนึ่งในการลดความเสียหายจากแสงคือการลดความเข้มข้นของออกซิเจนในตัวอย่างเพื่อหลีกเลี่ยงการก่อตัวของอนุมูลออกซิเจน [ ^{36 ] อย่างไรก็ตาม}วิธีนี้ไม่สามารถทำได้เสมอไปในการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตและอาจต้องมีการแทรกแซงเพิ่มเติม อีกวิธีหนึ่งในการลดผลกระทบของอนุมูลอิสระในตัวอย่างคือการใช้สารป้องกันการซีดจาง น่าเสียดายที่สารป้องกันการซีดจางเชิงพาณิชย์ส่วนใหญ่ไม่สามารถใช้ในการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตได้เนื่องจากความเป็นพิษ^{[ 37 ]} ในทางกลับกัน สามารถใช้สารกำจัดอนุมูลอิสระตามธรรมชาติ เช่นวิตามินซีหรือวิตามินอี ได้โดยไม่เปลี่ยนแปลงพฤติกรรมทางสรีรวิทยาอย่างมีนัยสำคัญในช่วงเวลาสั้นๆ ^{[ 38 ]} การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตที่ปราศจากความเป็นพิษจากแสงได้รับการพัฒนาและจำหน่ายในเชิงพาณิชย์เมื่อเร็วๆ นี้ กล้องจุลทรรศน์โฮโลโทโมกราฟิกหลีกเลี่ยงความเป็นพิษจากแสงได้ด้วยเลเซอร์กำลังต่ำ (เลเซอร์คลาส 1: 0.2 mW/ ^mm² ) ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 39 ]}

• ไซโตเมทรี
• การถ่ายภาพเฟสเชิงปริมาณ
• การถ่ายภาพจุลทรรศน์แบบไทม์แลปส์
• การถ่ายภาพเซลล์เดี่ยวแบบเรียลไทม์

• มหาวิทยาลัยรัฐฟลอริดา — ความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับเทคนิคการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิต