ในชีววิทยาเชิงระบบการถ่ายภาพเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตเป็น เทคนิค การถ่ายภาพเซลล์แบบมีชีวิตที่ผสมผสานเทคนิคการถ่ายภาพเซลล์แบบมีชีวิตแบบดั้งเดิมและเทคนิคกล้องจุลทรรศน์แบบไทม์แลปส์ เข้ากับการติดตามเซลล์อัตโนมัติและการสกัดคุณลักษณะ โดยดึงเอาเทคนิคหลายอย่างมาจาก การคัดกรองเนื้อหาสูงใช้เพื่อศึกษาพลวัตการส่งสัญญาณและพฤติกรรมในประชากรของเซลล์ที่มีชีวิตแต่ละเซลล์^{[ 1 ] [ 2 ]}การศึกษาเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตสามารถเปิดเผยพฤติกรรมสำคัญที่อาจถูกบดบังในการทดลองเฉลี่ยประชากร เช่นเวสเทิร์นบลอต^{[ 3 ]}

ในการทดลองถ่ายภาพเซลล์เดี่ยวแบบสด จะมีการนำสารเรืองแสงเข้าไปในเซลล์เพื่อวัดระดับ ตำแหน่ง หรือกิจกรรมของโมเลกุลส่งสัญญาณ จากนั้นจะทำการถ่ายภาพกลุ่มเซลล์ในช่วงเวลาต่างๆ โดยควบคุมบรรยากาศอย่างระมัดระวังเพื่อรักษาความมีชีวิตและลดความเครียดของเซลล์ หลังจากนั้นจะทำการติดตามเซลล์โดยอัตโนมัติจากภาพชุดเวลาเหล่านี้ แล้วจึงทำการกรองและตรวจสอบคุณภาพ การวิเคราะห์คุณลักษณะที่อธิบายถึงสารเรืองแสงในช่วงเวลาต่างๆ จะนำไปสู่การสร้างแบบจำลองและข้อสรุปทางชีววิทยา ซึ่งสามารถใช้เป็นแนวทางในการทดลองเพิ่มเติมได้

สาขาการถ่ายภาพเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตเริ่มต้นด้วยงานที่แสดงให้เห็นว่าโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) ที่พบในแมงกะพรุนAequorea victoriaสามารถแสดงออกในสิ่งมีชีวิตได้^{[ 4 ]}การค้นพบนี้ทำให้นักวิจัยสามารถศึกษาตำแหน่งและระดับของโปรตีนในเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิตได้ เช่น กิจกรรมของไคเนส [ ^{5 ] และ}ระดับแคลเซียมโดยใช้ตัวรายงานFRET ^{[ 6 ]}รวมถึงฟีโนไทป์อื่นๆ อีกมากมาย^{[ 7 ]}

โดยทั่วไป การศึกษาในช่วงแรกเหล่านี้มุ่งเน้นไปที่การระบุตำแหน่งและพฤติกรรมของโปรตีนที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์เหล่านี้ในระดับเซลล์ย่อยในช่วงเวลาสั้นๆ อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้เปลี่ยนไปเมื่อมีการศึกษาบุกเบิกเกี่ยวกับโปรตีนยับยั้งเนื้องอกp53 ^{[ 8 ]} และโปรตีน NF-κBที่เกี่ยวข้องกับความเครียดและการอักเสบ^{[ 9 ]} ซึ่งเผยให้เห็นว่าระดับและตำแหน่งของโปรตีนเหล่านี้มีการแกว่งตัวในช่วงเวลาหลายชั่วโมง นอกจากนี้ยัง มีการใช้แนวทางเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิตในช่วงเวลานี้เพื่อทำความเข้าใจการส่งสัญญาณในสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว รวมถึงแบคทีเรีย ซึ่งการศึกษาที่มีชีวิตทำให้สามารถสร้างแบบจำลองพลวัตของความสามารถได้^{[ 10 ]}และยีสต์ที่เผยให้เห็นกลไกที่อยู่เบื้องหลังการเข้าสู่รอบเซลล์ ที่สอดคล้องกัน ^{[ 11 ]}

ในการศึกษาเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิต ขั้นตอนแรกคือการแนะนำตัวรายงานสำหรับโปรตีน/โมเลกุลที่เราสนใจลงในสายเซลล์ที่เหมาะสม การเติบโตส่วนใหญ่ในสาขานี้มาจากการปรับปรุงเครื่องมือแก้ไขยีน เช่นCRISPRซึ่งนำไปสู่การพัฒนาตัวรายงานเรืองแสงที่หลากหลาย^{[ 12 ]}

การติดแท็กด้วยสารเรืองแสงใช้ยีนที่เข้ารหัสโปรตีนเรืองแสงซึ่งถูกแทรกเข้าไปในกรอบการเข้ารหัสของโปรตีนที่จะถูกติดแท็ก คุณลักษณะด้านพื้นผิวและความเข้มสามารถสกัดได้จากภาพของโปรตีนที่ถูกติดแท็ก

โมเลกุลยังสามารถติดแท็กในหลอดทดลองและนำเข้าสู่เซลล์ด้วยอิเล็กโทรโฟเรซิสซึ่งช่วยให้สามารถใช้ฟลูออโรฟอร์ที่ มีขนาดเล็กกว่าและเสถียรต่อแสงได้มากกว่า แต่ต้องมีขั้นตอนการล้างเพิ่มเติม^{[ 13 ]}

โดยการออกแบบการแสดงออกของตัวรายงาน FRET โดยที่ฟลูออโรฟอร์ผู้ให้และตัวปล่อยจะอยู่ใกล้กันเฉพาะเมื่อโมเลกุลส่งสัญญาณต้นน้ำทำงานหรือไม่ทำงานเท่านั้น อัตราส่วนความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ของผู้ให้ต่อตัวปล่อยสามารถใช้เป็นตัววัดกิจกรรมการส่งสัญญาณได้ ตัวอย่างเช่น ในงานสำคัญในช่วงแรกที่ใช้ตัวรายงาน FRET สำหรับการศึกษาแบบเดี่ยวที่มีชีวิต ตัวรายงาน FRET ของกิจกรรมRho GTPase ได้รับการออกแบบ ^{[ 14 ]}

ตัวรายงานการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ใช้ สัญญาณ นำเข้านิวเคลียร์และส่งออกนิวเคลียร์ที่ได้รับการดัดแปลง ซึ่งสามารถยับยั้งได้ด้วยโมเลกุลส่งสัญญาณ เพื่อบันทึกกิจกรรมการส่งสัญญาณผ่านอัตราส่วนของตัวรายงานนิวเคลียร์ต่อตัวรายงานไซโตพลาสซึม^{[ 15 ]}

จากนั้นจึงต้องทำการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิต ซึ่งติดฉลากด้วยสารเรืองแสง ขั้นตอนนี้ต้องอาศัยการบ่มเซลล์ในสภาวะที่ปราศจากความเครียดไปพร้อมๆ กับการถ่ายภาพ มีหลายปัจจัยที่ต้องพิจารณาเมื่อเลือกสภาวะการถ่ายภาพ เช่น ความเป็นพิษต่อเซลล์จากแสง การซีดจางของสีจากแสง ความง่ายในการติดตาม อัตราการเปลี่ยนแปลงของกิจกรรมการส่งสัญญาณ และอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน ปัจจัยเหล่านี้ล้วนเกี่ยวข้องกับความถี่ในการถ่ายภาพและความเข้มของแสงสว่าง

ความเป็นพิษจากแสงอาจเกิดขึ้นจากการสัมผัสกับแสงปริมาณมากเป็นเวลานาน เซลล์จะเกิดความเครียด ซึ่งอาจนำไปสู่ การตายของเซลล์ (apoptosis ) การถ่ายภาพด้วยความถี่และความเข้มสูงอาจทำให้สัญญาณฟลูออโรฟอร์ลดลงเนื่องจากการฟอกสีด้วยแสง การถ่ายภาพด้วยความถี่สูงโดยทั่วไปจะทำให้การติดตามเซลล์แบบอัตโนมัติง่ายขึ้น ความถี่ในการถ่ายภาพควรสามารถจับภาพการเปลี่ยนแปลงที่จำเป็นต่อกิจกรรมการส่งสัญญาณได้ การถ่ายภาพที่มีความเข้มต่ำหรือตัวรายงานที่ไม่ดีอาจทำให้ไม่สามารถตรวจจับกิจกรรมการส่งสัญญาณในระดับต่ำภายในเซลล์ได้

หลังจากการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตแล้ว ซอฟต์แวร์ติดตามอัตโนมัติจะถูกนำมาใช้เพื่อดึงข้อมูลอนุกรมเวลาจากวิดีโอของเซลล์ การติดตามเซลล์มีชีวิตโดยทั่วไปจะแบ่งออกเป็นสองขั้นตอน คือการแบ่งส่วนภาพของเซลล์หรือนิวเคลียส และการติดตามเซลล์/นิวเคลียสตามส่วนต่างๆ เหล่านี้ ยังคงมีความท้าทายมากมายในขั้นตอนนี้ของการศึกษาการถ่ายภาพเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิต^{[ 16 ]}อย่างไรก็ตาม ความก้าวหน้าล่าสุดได้รับการเน้นย้ำในสาขานี้ โดยเป็นการเปรียบเทียบเชิงวัตถุประสงค์ครั้งแรกของเทคนิคการติดตามเซลล์เดี่ยว^{[ 17 ]}

การถ่ายภาพเฟสเชิงปริมาณ (QPI) มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการติดตามเซลล์ที่มีชีวิต เนื่องจาก QPI ไม่ต้องใช้ฉลาก จึงไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อแสง และไม่ได้รับผลกระทบจากการฟอกสีด้วยแสงที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายภาพฟลูออเรสเซนซ์^{[ 18 ]} QPI ให้ความคมชัดสูงกว่าเทคนิคการถ่ายภาพเฟสแบบดั้งเดิม เช่นกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสความคมชัดที่สูงขึ้นช่วยให้การแบ่งส่วนและการติดตามเซลล์มีความแม่นยำมากขึ้นกว่าที่ทำได้ด้วยการถ่ายภาพเฟสแบบดั้งเดิม^{[ 19 ]}

เทคนิคใหม่ที่ใช้การผสมผสานระหว่างเทคนิคการแบ่งส่วนภาพแบบดั้งเดิมและการเรียนรู้เชิงลึกเพื่อแบ่งส่วนเซลล์ก็กำลังเป็นที่นิยมใช้มากขึ้นเช่นกัน^{[ 20 ]}

ในขั้นตอนสุดท้ายของการศึกษาการถ่ายภาพเซลล์เดี่ยวแบบสด จะมีการสร้างแบบจำลองและการวิเคราะห์ข้อมูลอนุกรมเวลาที่สกัดจากเซลล์ที่ติดตาม สามารถสร้างโปรไฟล์แผนผังลำดับวงศ์ตระกูลเพื่อเปิดเผยความแตกต่างในการตอบสนองของเซลล์แต่ละเซลล์และการส่งสัญญาณปลายทาง^{[ 21 ] [ 22 ]}การปรับปรุงและบีบอัดข้อมูลจากการติดตามเซลล์เดี่ยวแบบวิดีโอสามารถให้ข้อมูลป้อนเข้าที่เกี่ยวข้องสำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลขนาดใหญ่ ซึ่งมีส่วนช่วยในการระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพเพื่อการวินิจฉัยและการพยากรณ์โรคที่ดีขึ้น^{[ 23 ]} มี การทับซ้อนกันอย่างมากระหว่างการวิเคราะห์ข้อมูลเซลล์เดี่ยวแบบสดและการสร้างแบบจำลองระบบชีวภาพโดยใช้สมการเชิงอนุพันธ์สามัญผลลัพธ์จากขั้นตอนการวิเคราะห์ข้อมูลที่สำคัญนี้จะผลักดันการทดลองเพิ่มเติม ตัวอย่างเช่น โดยการรบกวนบางส่วนของระบบที่กำลังศึกษาแล้วเปรียบเทียบพลวัตการส่งสัญญาณกับประชากรควบคุม

ด้วยการวิเคราะห์พลวัตการส่งสัญญาณของเซลล์เดี่ยวในประชากรทั้งหมด การศึกษาเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตทำให้เราเข้าใจว่าพลวัตเหล่านี้ส่งผลต่อกระบวนการตัดสินใจของเซลล์ที่สำคัญอย่างไร ตัวอย่างเช่น การศึกษาเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตของปัจจัยการเจริญเติบโตERKเผยให้เห็นว่ามันมีการกระตุ้นแบบดิจิทัลทั้งหมดหรือไม่มีเลย^{[ 24 ]}ยิ่งไปกว่านั้น การกระตุ้นแบบทั้งหมดหรือไม่มีเลยนี้เป็นแบบเป็นจังหวะ และความถี่ของจังหวะจะเป็นตัวกำหนดว่าเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจะเข้าสู่รอบการแบ่งเซลล์หรือไม่ ในอีกตัวอย่างสำคัญ การศึกษาเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตของ กิจกรรม CDK2ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแสดงให้เห็นว่าการแยกตัวของกิจกรรม CDK2 หลังจากการแบ่งเซลล์แบบไมโทซิสเป็นตัวกำหนดว่าเซลล์จะยังคงเพิ่มจำนวนต่อไปหรือเข้าสู่สภาวะสงบ^{[ 25 ]}ซึ่งขณะนี้แสดงให้เห็นแล้วโดยใช้วิธีการเซลล์เดี่ยวแบบมีชีวิตว่าเกิดจากความเสียหายของ DNA แบบสุ่มที่กระตุ้นให้มีการเพิ่มขึ้นของp21ซึ่งยับยั้งกิจกรรม CDK2 ^{[ 26 ]}ในอนาคต การศึกษาเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิตจะรวมเอาผู้รายงานหลายรายเข้าไว้ในสายเซลล์เดี่ยวเพื่อให้เข้าใจกระบวนการตัดสินใจที่ซับซ้อนได้ อย่างไรก็ตาม ความท้าทายยังคงมีอยู่ในการขยายขนาดการศึกษาเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิต