การจัดลำดับรุ่นที่สาม (หรือที่เรียกว่าการจัดลำดับแบบอ่านยาว ) เป็นวิธี การจัดลำดับดีเอ็นเอประเภทหนึ่งที่มีความสามารถในการสร้างลำดับที่ยาวกว่ามาก (ตั้งแต่ 10 กิโลเบสถึง >1 เมกะเบส) ^{[ 1 ]}เมื่อเทียบกับการจัดลำดับรุ่นที่สองหรือที่เรียกว่าวิธีการจัดลำดับรุ่นถัดไป^{[ 2 ]}วิธีการเหล่านี้เกิดขึ้นในปี 2551 โดยมีลักษณะเด่นคือเทคโนโลยีต่างๆ เช่นการจัดลำดับนาโนพอเรหรือการจัดลำดับแบบเรียลไทม์ระดับโมเลกุลเดี่ยวและยังคงได้รับการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง^{[ 2 ]}ความสามารถในการจัดลำดับลำดับที่ยาวขึ้นมีนัยสำคัญอย่างยิ่งต่อทั้งวิทยาศาสตร์จีโนมและการศึกษาชีววิทยาโดยทั่วไป ใน การระบุ ความแปรผันเชิงโครงสร้างพบว่าการจัดลำดับรุ่นที่สามมีประสิทธิภาพเหนือกว่าวิธีการที่มีอยู่เดิม แม้กระทั่งที่ระดับความลึกของการครอบคลุมการจัดลำดับที่ต่ำ^{[ 3 ]}อย่างไรก็ตาม ข้อมูลการจัดลำดับรุ่นที่สามมีอัตราความผิดพลาดสูงกว่าเทคโนโลยีรุ่นก่อนๆ มาก ซึ่งอาจทำให้การประกอบจีโนมและการวิเคราะห์ข้อมูลที่ได้มีความซับซ้อนมากขึ้น^{[ 4 ]}เทคโนโลยีเหล่านี้กำลังอยู่ระหว่างการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง และคาดว่าจะมีการปรับปรุงอัตราข้อผิดพลาดที่สูง^{[ 1 ]}

เทคโนโลยีการจัดลำดับที่มีแนวทางที่แตกต่างจากแพลตฟอร์มรุ่นที่สองได้รับการอธิบายครั้งแรกว่าเป็น "รุ่นที่สาม" ในปี 2551-2552 ^{[ 5 ]}

ปัจจุบันมีบริษัทหลายแห่งที่เป็นผู้นำในการพัฒนาเทคโนโลยีการลำดับดีเอ็นเอรุ่นที่สาม ได้แก่Pacific Biosciences , Oxford Nanopore Technology , Quantapore (แคลิฟอร์เนีย-สหรัฐอเมริกา) และ Stratos (วอชิงตัน-สหรัฐอเมริกา) บริษัทเหล่านี้ใช้วิธีการที่แตกต่างกันอย่างสิ้นเชิงในการลำดับโมเลกุลดีเอ็นเอเดี่ยว

PacBio ได้พัฒนาแพลตฟอร์มการจัดลำดับดีเอ็นเอแบบ เรี ยลไทม์ระดับโมเลกุลเดี่ยว (SMRT)โดยอาศัยคุณสมบัติของตัวนำคลื่นแสงแบบศูนย์โหมดสัญญาณที่ได้จะอยู่ในรูปของแสงฟลูออเรสเซนต์ที่เปล่งออกมาจากนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวที่ถูกรวมเข้าไปโดยเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสที่ยึดติดอยู่กับด้านล่างของช่อง zL

เทคโนโลยีของ Oxford Nanoporeเกี่ยวข้องกับการส่งโมเลกุล DNA ผ่านโครงสร้างรูพรุนระดับนาโน แล้ววัดการเปลี่ยนแปลงของสนามไฟฟ้าที่อยู่รอบรูพรุน ในขณะที่ Quantapore มีวิธีการนาโนพอเรที่เป็นกรรมสิทธิ์ที่แตกต่างออกไป ส่วน Stratos Genomics ใช้สารแทรกโพลีเมอร์ " Xpandomers " เพื่อเว้นระยะห่างระหว่างเบสของ DNA เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนในการอ่าน ssDNA ด้วยนาโนพอเร

สิ่งที่น่าสนใจอีกอย่างคือ วิธีการเรืองแสงระดับโมเลกุลเดี่ยวของ Helicosแต่บริษัทได้ล้มละลายในฤดูใบไม้ร่วงปี 2015

เมื่อเปรียบเทียบกับเทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สอง การจัดลำดับรุ่นที่สามมีข้อได้เปรียบที่ชัดเจนคือสามารถสร้างลำดับการอ่านที่ยาวกว่ามาก คาดว่าความยาวของลำดับการอ่านที่ยาวขึ้นนี้จะช่วยลดความท้าทายในการคำนวณมากมายที่เกี่ยวข้องกับการประกอบจีโนม การสร้างทรานสคริปต์ขึ้นใหม่ และเมตาจีโนมิกส์ รวมถึงสาขาสำคัญอื่นๆ ของชีววิทยาและการแพทย์สมัยใหม่^{[ 2 ]}

เป็นที่ทราบกันดีว่าจีโนมของสิ่งมีชีวิตยูคาริโอต รวมถึงไพรเมตและมนุษย์นั้นมีความซับซ้อนและมีบริเวณที่ซ้ำกันเป็นช่วงยาวจำนวนมาก การอ่านลำดับสั้นๆ จากการจัดลำดับรุ่นที่สองจำเป็นต้องใช้กลยุทธ์โดยประมาณเพื่ออนุมานลำดับในช่วงยาวสำหรับการประกอบและการระบุความแปรผันทางพันธุกรรม การอ่านแบบคู่ปลาย (pair end reads)ได้ถูกนำมาใช้ในการจัดลำดับรุ่นที่สองเพื่อแก้ไขข้อจำกัดเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม ความยาวที่แน่นอนของชิ้นส่วนแบบคู่ปลายมักไม่เป็นที่ทราบและต้องใช้การประมาณเช่นกัน เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามมีข้อได้เปรียบที่ชัดเจนในการทำให้สามารถอ่านลำดับยาวได้

เครื่องหมายเอพิเจเนติกส์คือการดัดแปลงโมเลกุล DNA ที่เสถียรและอาจถ่ายทอดทางพันธุกรรมได้ ซึ่งไม่ได้อยู่ในลำดับของ DNA ตัวอย่างเช่น การเมทิลเลชั่นของ DNA ที่ไซต์ CpGซึ่งพบว่ามีอิทธิพลต่อการแสดงออกของยีน การดัดแปลงฮิสโตนก็เป็นอีกตัวอย่างหนึ่ง เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นปัจจุบันอาศัยเทคนิคในห้องปฏิบัติการ เช่นChIP-sequencingสำหรับการตรวจจับเครื่องหมายเอพิเจเนติกส์ เทคนิคเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการติดแท็กสาย DNA การตัดและกรองชิ้นส่วนที่มีเครื่องหมาย ตามด้วยการจัดลำดับ การจัดลำดับรุ่นที่สามอาจช่วยให้สามารถตรวจจับเครื่องหมายเหล่านี้ได้โดยตรงเนื่องจากสัญญาณที่โดดเด่นจากเบสนิวคลีโอไทด์อีกสี่ตัว^{[ 6 ]}

ข้อดีที่สำคัญอื่นๆ ของเทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สาม ได้แก่ ความสะดวกในการพกพาและความเร็วในการจัดลำดับ^{[ 7 ]}เนื่องจากการเตรียมตัวอย่างขั้นต่ำที่จำเป็นเมื่อเทียบกับการจัดลำดับรุ่นที่สอง ทำให้สามารถออกแบบอุปกรณ์ที่มีขนาดเล็กกว่าได้ Oxford Nanopore Technology เพิ่งวางจำหน่ายเครื่องจัดลำดับ MinIONเครื่องจัดลำดับนี้มีขนาดประมาณแฟลชไดรฟ์ USB ทั่วไป และสามารถใช้งานได้ง่ายโดยการเชื่อมต่อกับแล็ปท็อป นอกจากนี้ เนื่องจากกระบวนการจัดลำดับไม่ได้ขนานกันในแต่ละส่วนของจีโนม ข้อมูลจึงสามารถรวบรวมและวิเคราะห์ได้แบบเรียลไทม์ ข้อดีเหล่านี้ของการจัดลำดับรุ่นที่สามอาจเหมาะสมกับการใช้งานในโรงพยาบาลที่ต้องการการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูลอย่างรวดเร็วและในสถานที่

การจัดลำดับรุ่นที่สาม ณ ปี 2551 เผชิญกับความท้าทายที่สำคัญ โดยส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการระบุเบสของนิวคลีโอไทด์อย่างแม่นยำ อัตราความผิดพลาดยังคงสูงกว่าการจัดลำดับรุ่นที่สองมาก^{[ 4 ]}โดยทั่วไปแล้วเป็นเพราะความไม่เสถียรของกลไกโมเลกุลที่เกี่ยวข้อง ตัวอย่างเช่น ในเทคโนโลยีการจัดลำดับโมเลกุลเดี่ยวและแบบเรียลไทม์ของ PacBio โมเลกุลของ DNA polymerase จะได้รับความเสียหายมากขึ้นเรื่อยๆ เมื่อกระบวนการจัดลำดับเกิดขึ้น^{[ 4 ]}นอกจากนี้ เนื่องจากกระบวนการเกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว สัญญาณที่ปล่อยออกมาจากเบสแต่ละตัวอาจถูกบดบังด้วยสัญญาณจากเบสข้างเคียง ซึ่งก่อให้เกิดความท้าทายในการคำนวณใหม่สำหรับการถอดรหัสสัญญาณและอนุมานลำดับ วิธีการต่างๆ เช่นHidden Markov Modelsเป็นต้น ได้ถูกนำมาใช้เพื่อจุดประสงค์นี้และประสบความสำเร็จในระดับหนึ่ง^{[ 6 ]}

โดยเฉลี่ยแล้ว บุคคลต่างๆ ในประชากรมนุษย์จะมีพันธุกรรมที่เหมือนกันประมาณ 99.9% กล่าวอีกนัยหนึ่งคือ จะมีเบสที่แตกต่างกันเพียงประมาณหนึ่งในพันเบสเท่านั้นระหว่างคนสองคน อัตราความผิดพลาดสูงที่เกิดขึ้นในการลำดับดีเอ็นเอรุ่นที่สามนั้นเป็นปัญหาอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้สำหรับการระบุความแตกต่างระหว่างบุคคลที่พบในสมาชิกของสายพันธุ์เดียวกัน

การประกอบจีโนมคือการสร้างลำดับดีเอ็นเอของจีโนมทั้งหมดขึ้นใหม่ โดยทั่วไปแล้วจะทำได้ด้วยสองแนวทางที่แตกต่างกันโดยพื้นฐาน

เมื่อ มี จีโนมอ้างอิงอยู่แล้ว เช่น ในกรณีของมนุษย์ ลำดับเบสที่ได้ใหม่สามารถนำมาจัดเรียงกับจีโนมอ้างอิงเพื่อศึกษาคุณสมบัติได้โดยตรง การประกอบจีโนมโดยใช้จีโนมอ้างอิงนั้นรวดเร็วและง่าย แต่มีข้อเสียคือ "ซ่อน" ลำดับเบสใหม่และตัวแปรจำนวนสำเนา ขนาดใหญ่ นอกจากนี้ จีโนมอ้างอิงยังไม่มีอยู่สำหรับสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่

การประกอบจีโนม แบบ de novoเป็นวิธีการประกอบจีโนมทางเลือกนอกเหนือจากการจัดเรียงลำดับจีโนมอ้างอิง หมายถึงการสร้างลำดับจีโนมทั้งหมดขึ้นใหม่จากข้อมูลลำดับดิบ วิธีการนี้จะถูกเลือกใช้เมื่อไม่มีจีโนมอ้างอิง เมื่อไม่ทราบชนิดของสิ่งมีชีวิต เช่น ในงานเมตาจีโนมิกส์หรือเมื่อมีตัวแปรทางพันธุกรรมที่น่าสนใจซึ่งอาจตรวจไม่พบโดยการจัดเรียงลำดับจีโนมอ้างอิง

เนื่องจากข้อมูลลำดับสั้นที่ได้จากเทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นปัจจุบัน การประกอบจีโนมแบบ de novo จึงเป็นปัญหาการคำนวณ ที่สำคัญ โดยปกติแล้วจะใช้วิธีการวนซ้ำในการค้นหาและเชื่อมต่อข้อมูลลำดับที่มีการทับซ้อนกันอย่างเหมาะสม มีการใช้เทคนิคการคำนวณและสถิติต่างๆ เช่นกราฟ de bruijnและกราฟฉันทามติการจัดวางการทับซ้อน เพื่อแก้ปัญหานี้ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากลักษณะที่ซ้ำซ้อนสูงของจีโนมยูคาริโอต การสร้างลำดับจีโนมขึ้นใหม่ที่ถูกต้องและสมบูรณ์ในการประกอบจีโนมแบบ de novo จึงยังคงเป็นเรื่องท้าทายข้อมูลลำดับปลายคู่ได้รับการเสนอให้เป็นวิธีแก้ปัญหาที่เป็นไปได้ แม้ว่าความยาวของชิ้นส่วนที่แน่นอนมักจะไม่ทราบและต้องประมาณค่า^{[ 8 ]}

ความยาวในการอ่านที่ยาวขึ้นซึ่งได้จากการจัดลำดับรุ่นที่สามอาจช่วยบรรเทาความท้าทายหลายประการที่การประกอบจีโนมแบบ de novo กำลังเผชิญอยู่ในปัจจุบัน ตัวอย่างเช่น หากสามารถจัดลำดับบริเวณที่ซ้ำกันทั้งหมดได้อย่างชัดเจนในการอ่านเพียงครั้งเดียว ก็ไม่จำเป็นต้องใช้การอนุมานทางคอมพิวเตอร์ วิธีการทางคอมพิวเตอร์ได้รับการเสนอเพื่อบรรเทาปัญหาอัตราข้อผิดพลาดสูง ตัวอย่างเช่น ในการศึกษาหนึ่ง พบว่าการประกอบจีโนมจุลินทรีย์แบบ de novo โดยใช้การจัดลำดับ PacBio เพียงอย่างเดียวมีประสิทธิภาพเหนือกว่าการจัดลำดับรุ่นที่สอง^{[ 9 ]}

การจัดลำดับรุ่นที่สามอาจใช้ร่วมกับการจัดลำดับรุ่นที่สองได้เช่นกัน วิธีการนี้มักเรียกว่าการจัดลำดับแบบไฮบริด ตัวอย่างเช่น การอ่านแบบยาวจากการจัดลำดับรุ่นที่สามอาจใช้เพื่อแก้ไขความกำกวมที่มีอยู่ในจีโนมที่ประกอบขึ้นก่อนหน้านี้โดยใช้การจัดลำดับรุ่นที่สอง ในทางกลับกัน การอ่านแบบสั้นจากการจัดลำดับรุ่นที่สองได้ถูกนำมาใช้เพื่อแก้ไขข้อผิดพลาดที่มีอยู่ในการอ่านแบบยาวจากการจัดลำดับรุ่นที่สาม โดยทั่วไป วิธีการไฮบริดนี้ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าช่วยปรับปรุงการประกอบจีโนมแบบ de novo ได้อย่างมีนัยสำคัญ^{[ 10 ]}

การเมทิลเลชันของ DNA (DNAm) – การดัดแปลงDNA แบบโควาเลน ต์ที่ไซต์ CpG ส่งผลให้มีหมู่เมทิล ติดอยู่ – เป็นองค์ประกอบที่เข้าใจได้ดีที่สุดของ กลไก เอพิเจเนติกส์ การดัดแปลง DNA และการแสดงออกของยีนที่เกิดขึ้นอาจแตกต่างกันไปตามชนิดของเซลล์ การพัฒนาตามเวลา บรรพบุรุษทางพันธุกรรม สามารถเปลี่ยนแปลงได้เนื่องจากสิ่งกระตุ้นจากสิ่งแวดล้อม และสามารถถ่ายทอดทางพันธุกรรมได้ หลังจากการค้นพบ DNAm นักวิจัยยังพบความสัมพันธ์กับโรคต่างๆ เช่น มะเร็งและออทิสติก [ ^{11 ] ใน}บริบทของสาเหตุของโรคนี้ DNAm เป็นแนวทางสำคัญสำหรับการวิจัยเพิ่มเติม

วิธีการที่ใช้กันทั่วไปในปัจจุบันสำหรับการตรวจสอบสถานะเมทิลเลชันต้องใช้การทดสอบที่ทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นเล็ก ๆ ก่อนการจัดลำดับรุ่นที่สองมาตรฐานบน แพลตฟอร์ม Illuminaส่งผลให้ความยาวของการอ่านสั้น ทำให้ข้อมูลเกี่ยวกับรูปแบบเมทิลเลชันที่ยาวกว่าสูญหายไป^{[ 6 ]}เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามมีศักยภาพในการจัดลำดับแบบเรียลไทม์ของโมเลกุลเดี่ยวที่มีการอ่านที่ยาวกว่า และตรวจจับการดัดแปลง DNA โดยไม่ต้องใช้การทดสอบดังกล่าว^{[ 12 ]}

เทคโนโลยีนาโนพอเรของออกซ์ฟอร์ด MinION ถูกนำมาใช้ในการตรวจจับ DNAm เนื่องจากสาย DNA แต่ละสายผ่านรูพรุน จึงสร้างสัญญาณไฟฟ้าซึ่งพบว่ามีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในนิวคลีโอไทด์ และแบบจำลองมาร์คอฟแบบซ่อนเร้น (HMM) ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล MinION เพื่อตรวจจับการดัดแปลง DNA 5-เมทิลไซโตซีน (5mC) ^{[ 6 ]}แบบจำลองได้รับการฝึกฝนโดยใช้ DNA ของ E. coli ที่ถูกเมทิลเลชันสังเคราะห์ และสัญญาณที่ได้จะถูกวัดโดยเทคโนโลยีนาโนพอเร จากนั้นแบบจำลองที่ได้รับการฝึกฝนแล้วจะถูกนำมาใช้ในการตรวจจับ 5mC ในการอ่านจีโนมของ MinION จากสายเซลล์มนุษย์ที่มีเมทิลโลมอ้างอิงอยู่แล้ว ตัวจำแนกมีความแม่นยำ 82% ในตำแหน่งซิงเกิลตันที่สุ่มตัวอย่าง ซึ่งเพิ่มขึ้นเป็น 95% เมื่อใช้เกณฑ์ที่เข้มงวดมากขึ้น^{[ 6 ]}

วิธีการอื่นๆ กล่าวถึงการดัดแปลง DNA ประเภทต่างๆ โดยใช้แพลตฟอร์ม MinION Stoiber และคณะได้ตรวจสอบ 4-methylcytosine (4mC) และ 6-methyladenine (6mA) พร้อมกับ 5mC และยังสร้างซอฟต์แวร์เพื่อแสดงภาพข้อมูลดิบของ MinION โดยตรงในรูปแบบที่เข้าใจง่ายสำหรับมนุษย์^{[ 13 ]}ในที่นี้พวกเขาพบว่าในE. coliซึ่งมีเมทิลโลม ที่ทราบแล้ว สามารถใช้หน้าต่างเหตุการณ์ที่มีความยาว 5 คู่เบสเพื่อแบ่งและวิเคราะห์สัญญาณไฟฟ้าดิบของ MinION ทางสถิติได้การทดสอบ Mann-Whitney U แบบตรงไปตรงมา สามารถตรวจจับส่วนที่ถูกดัดแปลงของ ลำดับ E. coliได้ เช่นเดียวกับการแบ่งการดัดแปลงออกเป็นบริเวณ 4mC, 6mA หรือ 5mC เพิ่มเติม^{[ 13 ]}

ดูเหมือนว่าในอนาคต ข้อมูลดิบจาก MinION จะถูกนำมาใช้ในการตรวจจับเครื่องหมายทางพันธุกรรมต่างๆ ในดีเอ็นเอได้มากมาย

การจัดลำดับ PacBioยังถูกนำมาใช้ในการตรวจจับการเมทิลเลชั่นของ DNA ด้วย ในแพลตฟอร์มนี้ ความกว้างของพัลส์ – ความกว้างของพัลส์แสงฟลูออเรสเซนต์ – จะสอดคล้องกับเบสเฉพาะ ในปี 2010 พบว่าระยะห่างระหว่างพัลส์ในตัวอย่างควบคุมและตัวอย่างที่มีการเมทิลเลชั่นนั้นแตกต่างกัน และมีความกว้างของพัลส์ที่เป็น "เอกลักษณ์" สำหรับการเมทิลเลชั่นแต่ละประเภท^{[ 12 ]}ในปี 2012 การใช้แพลตฟอร์ม PacBio ได้มีการระบุลักษณะ ของตำแหน่งการจับของ DNA เมทิลทรานส เฟอเรส ^{[ 14 ]}การตรวจจับ N6-เมทิลเลชั่นในC Elegansได้รับการแสดงให้เห็นในปี 2015 ^{[ 15 ]}การเมทิลเลชั่นของ DNA บนN ⁶ -อะดีนีนโดยใช้แพลตฟอร์ม PacBio ในเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน ของหนู ได้รับการแสดงให้เห็นในปี 2016 ^{[ 16 ]}

การเปลี่ยนแปลงดีเอ็นเอในรูปแบบอื่นๆ เช่น จากโลหะหนัก การออกซิเดชัน หรือความเสียหายจากรังสียูวี ก็เป็นอีกแนวทางหนึ่งที่สามารถทำการวิจัยได้โดยใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับดีเอ็นเอรุ่นที่สามของ Oxford Nanopore และ PacBio

การประมวลผลข้อมูลดิบ เช่น การปรับค่าให้เป็นค่ามัธยฐานของสัญญาณ เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับข้อมูลดิบของ MinION ซึ่งลดความสามารถในการทำงานแบบเรียลไทม์ของเทคโนโลยี^{[ 13 ]}ความสม่ำเสมอของสัญญาณไฟฟ้ายังคงเป็นปัญหา ทำให้ยากที่จะระบุตำแหน่งของนิวคลีโอไทด์ได้อย่างแม่นยำ MinION มีอัตราการประมวลผลต่ำ เนื่องจากการอ่านที่ซ้อนทับกันหลายครั้งทำได้ยาก ซึ่งนำไปสู่ปัญหาความแม่นยำในการตรวจจับการดัดแปลง DNA ในขั้นตอนต่อไป ทั้งแบบจำลองมาร์คอฟแบบซ่อนเร้นและวิธีการทางสถิติที่ใช้กับข้อมูลดิบของ MinION จำเป็นต้องมีการสังเกตการดัดแปลง DNA ซ้ำๆ เพื่อการตรวจจับ ซึ่งหมายความว่านิวคลีโอไทด์ที่ถูกดัดแปลงแต่ละตัวจะต้องมีอยู่อย่างสม่ำเสมอในสำเนาของจีโนมหลายชุด เช่น ในเซลล์หรือพลาสมิดหลายตัวในตัวอย่าง

สำหรับแพลตฟอร์ม PacBio นั้น ขึ้นอยู่กับว่าคุณคาดหวังว่าจะพบการเมทิลเลชั่นแบบใด ความต้องการความครอบคลุมก็อาจแตกต่างกันไป ณ เดือนมีนาคม 2560 ปัจจัยทางพันธุกรรมอื่นๆ เช่น การดัดแปลงฮิสโตน ยังไม่สามารถค้นพบได้โดยใช้เทคโนโลยีรุ่นที่สาม รูปแบบการเมทิลเลชั่นที่ยาวกว่ามักจะสูญหายไป เนื่องจากยังคงต้องประกอบคอนติ๊กขนาดเล็กเข้าด้วยกัน

ทรานสคริปโตมิกส์คือการศึกษาทรานสคริปโตมโดยปกติจะทำโดยการหาปริมาณสัมพัทธ์ของ โมเลกุล เมสเซนเจอร์อาร์ เอ็น เอในเนื้อเยื่อที่กำลังศึกษา ตามหลักการพื้นฐานของชีววิทยาโมเลกุลข้อมูลทางพันธุกรรมจะไหลจากโมเลกุลดีเอ็นเอแบบสองสายไปยังโมเลกุลเอ็มอาร์เอ็นเอแบบสายเดียว ซึ่งสามารถแปลเป็นโมเลกุลโปรตีนที่ทำหน้าที่ได้ การศึกษาทรานสคริปโตมทำให้เราได้รับข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าเกี่ยวกับการควบคุมการแสดงออกของยีน

แม้ว่าระดับการแสดงออกจะสามารถแสดงได้อย่างแม่นยำมากขึ้นหรือน้อยลงด้วยการจัดลำดับรุ่นที่สอง (เราสามารถสันนิษฐานได้ว่าความอุดมสมบูรณ์ที่แท้จริงของประชากรของทรานสคริปต์จะถูกสุ่มตัวอย่าง) แต่ข้อมูลระดับทรานสคริปต์ยังคงเป็นความท้าทายที่สำคัญ^{[ 17 ]}ด้วยเหตุนี้ บทบาทของการสไปลซิงทางเลือกในชีววิทยาโมเลกุลจึงยังคงคลุมเครือเป็นส่วนใหญ่ เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามมีแนวโน้มที่ดีในการแก้ไขปัญหานี้โดยการทำให้สามารถจัดลำดับโมเลกุล mRNA ที่ความยาวเต็มได้

การสลับตำแหน่งของยีน (Alternative splicing , AS) เป็นกระบวนการที่ยีนเดียวอาจก่อให้เกิด mRNA ที่แตกต่างกันหลายแบบ และส่งผลให้เกิดการแปลโปรตีนที่แตกต่างกัน^{[ 18 ]}หลักฐานบางอย่างชี้ให้เห็นว่า AS เป็นปรากฏการณ์ที่พบได้ทั่วไปและอาจมีบทบาทสำคัญในการกำหนดลักษณะฟีโนไทป์ของสิ่งมีชีวิต โดยเฉพาะอย่างยิ่งในยูคาริโอตที่ซับซ้อน ยูคาริโอตทั้งหมดมียีนที่ประกอบด้วยอินทรอนซึ่งอาจเกิด AS ได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มีการประมาณการว่า AS เกิดขึ้นใน 95% ของยีนหลายเอ็กซอนของมนุษย์ทั้งหมด^{[ 19 ]} AS มีศักยภาพที่ไม่อาจปฏิเสธได้ในการส่งผลต่อกระบวนการทางชีววิทยามากมาย การพัฒนาความรู้ในด้านนี้มีนัยสำคัญต่อการศึกษาชีววิทยาโดยทั่วไป

เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นปัจจุบันสร้างเฉพาะลำดับอ่านสั้นๆ ซึ่งจำกัดความสามารถในการตรวจจับทรานสคริปต์ที่แตกต่างกันอย่างมาก ลำดับอ่านสั้นๆ จะต้องถูกวิเคราะห์ย้อนกลับเป็นทรานสคริปต์ดั้งเดิมที่อาจก่อให้เกิดการสังเกตลำดับอ่านที่ได้^{[ 20 ]}งานนี้ยิ่งซับซ้อนขึ้นไปอีกเนื่องจากระดับการแสดงออกที่แปรผันสูงในทรานสคริปต์ต่างๆ และส่งผลให้ความครอบคลุมของลำดับอ่านแปรผันไปทั่วทั้งลำดับของยีน^{[ 20 ]}นอกจากนี้เอ็กซอนอาจถูกใช้ร่วมกันระหว่างทรานสคริปต์แต่ละตัว ทำให้การอนุมานที่ชัดเจนเป็นไปไม่ได้ในทางปฏิบัติ^{[ 18 ]}วิธีการคำนวณที่มีอยู่จะทำการอนุมานโดยอาศัยการสะสมของลำดับอ่านสั้นๆ ในตำแหน่งลำดับต่างๆ โดยมักจะใช้สมมติฐานที่ทำให้ง่ายขึ้น^{[ 20 ]} Cufflinksใช้แนวทางที่ประหยัด โดยพยายามอธิบายลำดับอ่านทั้งหมดด้วยจำนวนทรานสคริปต์ที่น้อยที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้^{[ 21 ]}ในทางกลับกัน StringTie พยายามประมาณความอุดมสมบูรณ์ของทรานสคริปต์ไปพร้อมๆ กับการประกอบลำดับอ่าน^{[ 20 ]}วิธีการเหล่านี้แม้จะสมเหตุสมผล แต่ก็อาจไม่สามารถระบุบันทึกจริงได้เสมอไป

การศึกษาที่ตีพิมพ์ในปี 2551 ได้สำรวจโปรโตคอลการสร้างทรานสคริปต์ที่มีอยู่ 25 แบบ^{[ 17 ]}หลักฐานชี้ให้เห็นว่าวิธีการที่มีอยู่โดยทั่วไปอ่อนแอในการประกอบทรานสคริปต์ แม้ว่าความสามารถในการตรวจจับเอ็กซอนแต่ละตัวจะค่อนข้างสมบูรณ์^{[ 17 ]}จากการประมาณการ ความไวเฉลี่ยในการตรวจจับเอ็กซอนในโปรโตคอลทั้ง 25 แบบอยู่ที่ 80% สำหรับยีนของCaenorhabditis elegans ^{[ 17 ]}เมื่อเปรียบเทียบกัน ความไวในการระบุทรานสคริปต์ลดลงเหลือ 65% สำหรับมนุษย์ การศึกษารายงานความไวในการตรวจจับเอ็กซอนโดยเฉลี่ยที่ 69% และความไวในการตรวจจับทรานสคริปต์มีค่าเฉลี่ยเพียง 33% ^{[ 17 ]}กล่าวอีกนัยหนึ่ง สำหรับมนุษย์ วิธีการที่มีอยู่สามารถระบุทรานสคริปต์ที่มีอยู่ได้น้อยกว่าครึ่งหนึ่ง

เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามแสดงให้เห็นถึงแนวโน้มที่ดีในการแก้ปัญหาการตรวจจับทรานสคริปต์ รวมถึงการประมาณความอุดมสมบูรณ์ของ mRNA ในระดับทรานสคริปต์ แม้ว่าอัตราข้อผิดพลาดจะยังคงสูง แต่เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามมีความสามารถในการสร้างความยาวของการอ่านที่ยาวขึ้นมาก^{[ 22 ]} Pacific Bioscience ได้แนะนำแพลตฟอร์ม iso-seq ซึ่งเสนอให้จัดลำดับโมเลกุล mRNA ที่ความยาวเต็ม^{[ 22 ]}คาดว่า Oxford Nanopore จะนำเสนอเทคโนโลยีที่คล้ายกัน ปัญหาอัตราข้อผิดพลาดที่สูงขึ้นอาจบรรเทาลงได้ด้วยการอ่านสั้นคุณภาพสูงเพิ่มเติม วิธีการนี้ได้รับการทดสอบและรายงานก่อนหน้านี้แล้วว่าสามารถลดอัตราข้อผิดพลาดได้มากกว่า 3 เท่า^{[ 23 ]}

เมตาจีโนมิกส์คือการวิเคราะห์สารพันธุกรรมที่ได้มาจากตัวอย่างสิ่งแวดล้อมโดยตรง

ข้อได้เปรียบหลักของเทคโนโลยีการจัดลำดับดีเอ็นเอรุ่นที่สามในด้านเมตาจีโนมิกส์คือความเร็วในการจัดลำดับเมื่อเทียบกับเทคนิครุ่นที่สอง ความเร็วในการจัดลำดับมีความสำคัญ เช่น ในบริบททางคลินิก (เช่น การระบุ เชื้อโรค ) เพื่อให้สามารถวินิจฉัยได้อย่างมีประสิทธิภาพและดำเนินการรักษาได้ทันท่วงที

ในปี 2015 มีการใช้ MinION ของ Oxford Nanopore สำหรับการตรวจจับเมตาจีโนมิกแบบเรียลไทม์ของเชื้อโรคในตัวอย่างทางคลินิกที่ซับซ้อนและมีพื้นหลังสูง การอ่านลำดับ ไวรัสอีโบลา (EBOV) ครั้งแรกเกิดขึ้นภายใน 44 วินาทีหลังจาก การ เก็บข้อมูล^{[ 24 ]}มีการจับคู่การอ่านกับจีโนมอย่างสม่ำเสมอ อย่างน้อยหนึ่งการอ่านจับคู่กับจีโนมมากกว่า 88% การอ่านที่ค่อนข้างยาวทำให้สามารถจัดลำดับจีโนมไวรัสที่เกือบสมบูรณ์ด้วยความแม่นยำสูง (ความเหมือน 97–99%) โดยตรงจากตัวอย่างทางคลินิกหลัก^{[ 24 ]}

เครื่องหมาย ทางวิวัฒนาการทั่วไปสำหรับการศึกษาความหลากหลายของชุมชนจุลินทรีย์คือ ยีน RNA ไรโบโซม 16S ทั้ง MinION และแพลตฟอร์ม SMRT ของ PacBio ถูกนำมาใช้ในการจัดลำดับยีนนี้^{[ 25 ] [ 26 ]}ในบริบทนี้ อัตราข้อผิดพลาดของ PacBio เทียบได้กับการอ่านที่สั้นกว่าจาก แพลตฟอร์มการจัดลำดับ 454และ MiSeq ของ Illumina

อัตราความผิดพลาดสูงของ MinION (~10-40%) ทำให้ไม่สามารถระบุ เครื่องหมาย ต้านทานยาต้านจุลชีพได้ซึ่งจำเป็นต้องมีความละเอียดระดับนิวคลีโอไทด์เดี่ยว ด้วยเหตุผลเดียวกันนี้ จึง ไม่สามารถระบุเชื้อก่อโรคยู คาริโอตได้ ^{[ 24 ]}ความง่ายในการปนเปื้อนจากการนำเซลล์ไหลเดิมกลับมาใช้ใหม่ (โปรโตคอลการล้างมาตรฐานใช้ไม่ได้ผล) ก็เป็นข้อกังวลเช่นกัน บาร์โค้ดเฉพาะอาจช่วยให้สามารถทำมัลติเพล็กซ์ได้มากขึ้น นอกจากนี้ การระบุชนิดของแบคทีเรีย เชื้อราและปรสิตได้อย่าง แม่นยำ นั้นทำได้ยากมาก เนื่องจากพวกมันมีส่วนของจีโนมร่วมกันเป็นส่วนใหญ่ และบางชนิดแตกต่างกันเพียง <5% เท่านั้น

ต้นทุนการจัดลำดับเบสต่อเบสยังคงสูงกว่า MiSeq อย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม โอกาสในการเสริมฐานข้อมูลอ้างอิงด้วยลำดับความยาวเต็มจากสิ่งมีชีวิตที่อยู่ต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับจากวิธีการSanger ^{[ 25 ]}อาจช่วยในการระบุสิ่งมีชีวิตในเมตาจีโนมิกส์ได้อย่างมาก

• การจัดลำดับรุ่นแรก
• การจัดลำดับรุ่นที่สอง

• Marx, Vivien (12 มกราคม 2023). "วิธีการแห่งปี: การจัดลำดับแบบอ่านยาว" Nature Methods . 20 (1): 6– 11. Bibcode : 2023NatCB..20....6M . doi : 10.1038/s41592-022-01730-w . ISSN  1548-7105 . PMID  36635542 .