การทดลองติดฉลากไอโซโทปเป็นวิธีที่เหมาะสมที่สุดในการรวบรวมข้อมูลการทดลองที่จำเป็นสำหรับ MFA เนื่องจากฟลักซ์เป็นตัวกำหนดรูปแบบการติดฉลากไอโซโทปของเมตาบอไลต์ภายในเซลล์ การวัดรูปแบบเหล่านี้ทำให้สามารถอนุมานฟลักซ์ได้^{[ 10 ]}ขั้นตอนแรกในกระบวนการทำงานของการทดลองติดฉลากไอโซโทปคือการเพาะเลี้ยงเซลล์บนสารตั้งต้นที่ติดฉลาก สารตั้งต้นเช่นกลูโคสจะถูกติดฉลากด้วยไอโซโทป (ส่วนใหญ่มักจะเป็น^13C ) และถูกนำเข้าสู่ตัวกลางการเพาะเลี้ยง ตัวกลางนี้มักจะมีวิตามินและกรดอะมิโนที่จำเป็นเพื่อช่วยในการเจริญเติบโตของเซลล์^{[ 11 ]}จากนั้นเซลล์จะเผาผลาญสารตั้งต้นที่ติดฉลาก ทำให้เกิดการรวมตัวของ ตัวติดตาม ^13Cในเมตาบอไลต์ภายในเซลล์อื่นๆ หลังจากที่เซลล์ถึงสภาวะสมดุลทางสรีรวิทยา (เช่น ความเข้มข้นของเมตาบอไลต์คงที่ในการเพาะเลี้ยง) เซลล์จะถูกสลายเพื่อสกัดเมตาบอไลต์ สำหรับเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การสกัดเกี่ยวข้องกับการหยุดกระบวนการเผาผลาญของเซลล์โดยใช้เมทานอลและตามด้วยการสกัดเมตาบอไลต์โดยใช้เมทานอลและน้ำ^{[ 12 ]}ความเข้มข้นของเมตาบอไลต์และไอโซโทปที่มีฉลากในเมตาบอไลต์ของสารสกัดจะถูกวัดโดยเครื่องมือต่างๆ เช่นโครมาโทกราฟีของเหลว-แมสสเปกโทรเมตรีหรือ NMR ซึ่งยังให้ข้อมูลเกี่ยวกับตำแหน่งและจำนวนของอะตอมที่มีฉลากบนเมตาบอไลต์ด้วย^{[ 11 ]}ข้อมูลเหล่านี้จำเป็นสำหรับการทำความเข้าใจพลวัตของการเผาผลาญภายในเซลล์และอัตราการหมุนเวียนของเมตาบอไลต์เพื่ออนุมานการไหลเวียนของเมตาบอลิซึม

วิธีการหลักสำหรับการวิเคราะห์ฟลักซ์เมตาบอลิซึมคือ MFA ที่มีสถานะคงที่ของไอโซโทป เทคนิคการหาปริมาณฟลักซ์นี้สามารถนำไปใช้ได้ภายใต้สภาวะสมดุลของเมตาบอลิซึมและไอโซโทป^{[ 13 ]}ซึ่งเป็นสองเงื่อนไขที่ถือว่าความเข้มข้นของเมตาบอไลต์และ การกระจายตัวของ ไอโซโทปเมอร์จะไม่เปลี่ยนแปลงตามเวลา ความรู้เกี่ยวกับเมทริกซ์สโตอิคิโอเมตริก (S) ที่ประกอบด้วยการบริโภคและการผลิตเมตาบอไลต์ภายในปฏิกิริยาชีวเคมีนั้นจำเป็นสำหรับการปรับสมดุลฟลักซ์ (v) รอบแบบจำลองเครือข่ายเมตาบอลิซึมที่สมมติขึ้น^{[ 13 ]}เมื่อสมมติว่าอยู่ในสภาวะสมดุลของเมตาบอลิซึม ฟลักซ์เมตาบอลิซึมจึงสามารถหาปริมาณได้โดยการแก้สมการพีชคณิตเชิงเส้น อย่างง่ายแบบผกผันดังต่อไปนี้ :

${\displaystyle S\times v=0}$

เพื่อลดพื้นที่แก้ปัญหาที่เป็นไปได้สำหรับการกระจายฟลักซ์ MFA ที่มีสถานะคงที่ทางไอโซโทปจำเป็นต้องมีข้อจำกัดทางสัดส่วนเพิ่มเติม เช่น อัตราการเติบโต การหลั่งและการดูดซึมของสารตั้งต้น และอัตราการสะสมของผลิตภัณฑ์ รวมถึงขอบเขตบนและล่างสำหรับฟลักซ์^{[ 14 ]}แม้ว่า MFA ที่มีสถานะคงที่ทางไอโซโทปจะช่วยให้สามารถอนุมานฟลักซ์เมตาบอลิซึมได้อย่างแม่นยำผ่านการสร้างแบบจำลองทางคณิตศาสตร์ แต่การวิเคราะห์นั้นจำกัดอยู่เฉพาะการเพาะเลี้ยงแบบกลุ่มในช่วงระยะเอกซ์โพเนนเชียล^{[ 15 ]}ยิ่งไปกว่านั้น หลังจากเติมสารตั้งต้นที่มีฉลากแล้ว จุดเวลาที่สามารถสันนิษฐานได้อย่างแม่นยำว่าอยู่ในสภาวะสมดุลทางเมตาบอลิซึมและไอโซโทปนั้นอาจยากที่จะระบุได้^{[ 13 ]}

เมื่อการติดฉลากไอโซโทปเกิดขึ้นชั่วคราวและยังไม่สมดุล ไอโซโทปิกไม่คงที่ MFA (INST-MFA) มีข้อได้เปรียบในการอนุมานฟลักซ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบที่มีพลวัตการติดฉลากช้า คล้ายกับไอโซโทปิกคงที่ MFA วิธีนี้ต้องการสมดุลของมวลและไอโซโทปเมอร์เพื่อกำหนดลักษณะสัดส่วนและการเปลี่ยนผ่านของอะตอมของเครือข่ายเมตาบอลิซึม อย่างไรก็ตาม แตกต่างจากวิธีการ MFA แบบดั้งเดิม INST-MFA ต้องการการใช้สมการเชิงอนุพันธ์สามัญเพื่อตรวจสอบว่ารูปแบบการติดฉลากไอโซโทปของเมตาบอไลต์เปลี่ยนแปลงไปอย่างไรเมื่อเวลาผ่านไป การตรวจสอบดังกล่าวสามารถทำได้โดยการวัดรูปแบบการติดฉลากไอโซโทปที่เปลี่ยนแปลงไปในช่วงเวลาต่างๆ เพื่อป้อนเข้าสู่ INST-MFA ^{[ 16 ]}ดังนั้น INST-MFA จึงเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการอธิบายฟลักซ์ของระบบที่มีคอขวดของเส้นทางและเปิดเผยฟีโนไทป์ เมตาบอลิซึม ของสิ่งมีชีวิตออโตโทรฟิก^{[ 16 ]}แม้ว่าความต้องการในการคำนวณที่เข้มข้นของ INST-MFA ก่อนหน้านี้จะเป็นอุปสรรคต่อการใช้งานอย่างแพร่หลาย แต่เครื่องมือซอฟต์แวร์ที่พัฒนาขึ้นใหม่ได้ปรับปรุง INST-MFA ให้มีประสิทธิภาพมากขึ้นเพื่อลดเวลาและความต้องการในการคำนวณ^{[ 17 ]}

การวิเคราะห์ฟลักซ์เมตาบอลิซึมตามหลักอุณหพลศาสตร์ (TMFA) ^{[ 18 ]}เป็นการวิเคราะห์ฟลักซ์เมตาบอลิซึมแบบพิเศษที่ใช้ข้อจำกัดทางอุณหพลศาสตร์เชิงเส้น นอกเหนือจากข้อจำกัดสมดุลมวลเพื่อสร้างฟลักซ์และโปรไฟล์กิจกรรมของเมตาบอไลต์ที่เป็นไปได้ทางอุณหพลศาสตร์ TMFA จะพิจารณาเฉพาะเส้นทางและฟลักซ์ที่เป็นไปได้โดยใช้ การเปลี่ยนแปลง พลังงานอิสระของกิบส์ของปฏิกิริยาและกิจกรรมของเมตาบอไลต์ที่เป็นส่วนหนึ่งของแบบจำลอง ด้วยการคำนวณพลังงานอิสระของกิบส์ของปฏิกิริยาเมตาบอลิซึมและความเหมาะสมทางอุณหพลศาสตร์ TMFA ช่วยให้สามารถระบุปฏิกิริยาคอขวดของเส้นทางที่จำกัดซึ่งอาจเป็นตัวเลือกที่เหมาะสมสำหรับการควบคุมเส้นทางได้

การวิเคราะห์ฟลักซ์เมตาบอลิซึมถูกนำมาใช้เพื่อเป็นแนวทางในการขยายขนาดการหมักเชื้อเพลิงชีวภาพ^{[ 23 ]}ด้วยการวัดอัตราการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์โดยตรง MFA สามารถจับภาพพลวัตของพฤติกรรมของเซลล์และฟีโนไทป์เมตาบอลิซึมในไบโอรีแอคเตอร์ระหว่างการหมักขนาดใหญ่ได้^{[ 23 ]}ตัวอย่างเช่น โมเดล MFA ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการแปลงไซโลสเป็นเอทานอลในยีสต์ที่หมักไซโลสโดยใช้การกระจายฟลักซ์ที่คำนวณได้เพื่อกำหนดความสามารถทางทฤษฎีสูงสุดของยีสต์ที่เลือกไว้สำหรับการผลิตเอทานอล^{[ 24 ]}

การระบุเอนไซม์ที่เป็นคอขวดจะช่วยกำหนดปฏิกิริยาที่จำกัดอัตราซึ่งจำกัดประสิทธิภาพของเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพ นอกจากนี้ MFA ยังสามารถช่วยทำนายฟีโนไทป์ที่ไม่คาดคิดของสายพันธุ์ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมโดยการสร้างความเข้าใจพื้นฐานเกี่ยวกับวิธีการเชื่อมต่อฟลักซ์ในเซลล์ที่ได้รับการดัดแปลง^{[ 25 ]}ตัวอย่างเช่น การคำนวณพลังงานอิสระของกิบส์ของปฏิกิริยาใน การเผาผลาญของ Escherichia coliทำให้ TMFA สามารถระบุปฏิกิริยาที่เป็นคอขวดทางอุณหพลศาสตร์ในแบบจำลองระดับจีโนมของEscherichia coli ได้ ^{[ 18 ]}