การเลี้ยวเบนอิเล็กตรอนของไมโครคริสตัล^{หรือ MicroED [ 1} ] [ 2 ^{] เป็นวิธีการCryoEM}ที่พัฒนาโดย ห้องปฏิบัติการ Gonenในช่วงปลายปี 2013 ที่วิทยาเขตวิจัย Janeliaของสถาบันการแพทย์ Howard Hughes MicroED เป็นรูปแบบหนึ่งของผลึกศาสตร์อิเล็กตรอนที่ใช้ผลึก 3 มิติบางๆ ในการกำหนดโครงสร้างโดยการเลี้ยวเบนอิเล็กตรอนก่อนการสาธิตนี้ ผลึกศาสตร์อิเล็กตรอนของโมเลกุลขนาดใหญ่ (โปรตีน) ส่วนใหญ่ใช้กับผลึก 2 มิติ เป็นต้น^{[ 3 ] [ 4 ]}วิธีนี้เป็นหนึ่งในวิธีการสมัยใหม่หลายวิธีในการกำหนดโครงสร้างอะตอมโดยใช้การเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนซึ่งสาธิตครั้งแรกสำหรับตำแหน่งของอะตอมไฮโดรเจนในผลึก NH4Cl โดย WE Laschkarew และ ID Usykin ในปี 1933 ^{[ 5 ]}ซึ่งต่อมาได้ถูกนำมาใช้กับพื้นผิว^{[ 6 ]}ผ่านการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนแบบพรีเซสชัน^[ 7 ^{] โดย}งานในช่วงแรกส่วนใหญ่อธิบายไว้ในงานของBoris Vainshtein ^{[ 8 ]}และDouglas L. Dorset ^{[ 9 ]}

วิธีการนี้ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อกำหนดโครงสร้างของโปรตีนจากนาโนคริสตัล ซึ่งโดยทั่วไปแล้วไม่เหมาะสำหรับการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์เนื่องจากขนาดของมัน^{[ 10 ]}คริสตัลที่มีขนาดเล็กกว่าขนาดที่จำเป็นสำหรับการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์ ถึงหนึ่งในพันล้านส่วน สามารถให้ข้อมูลคุณภาพสูงได้^{[ 11 ]}ตัวอย่างจะถูกแช่แข็งแบบไฮเดรตเช่นเดียวกับวิธีการ CryoEM อื่นๆ แต่แทนที่จะใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน ( TEM ) ในโหมดการถ่ายภาพ จะใช้ใน โหมด การเลี้ยวเบนโดยมีการเปิดรับอิเล็กตรอนต่ำ (โดยทั่วไป < 0.01 e ⁻ /Å ² /s) นาโนคริสตัลจะถูกฉายรังสีและหมุนอย่างต่อเนื่อง^{[ 2 ]}ในขณะที่การเลี้ยวเบนจะถูกบันทึกด้วยกล้องความเร็วสูงในรูปแบบภาพยนตร์^{[ 2 ]}จากนั้นข้อมูล MicroED จะถูกประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์สำหรับการตกผลึกด้วยรังสีเอกซ์เพื่อการวิเคราะห์โครงสร้างและการปรับปรุง^{[ 12 ]}ฮาร์ดแวร์และซอฟต์แวร์ที่ใช้ในการทดลอง MicroED เป็นมาตรฐานและหาได้ง่าย^{[ 13 ] [ 14 ]}

การเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนเพื่อแก้ปัญหาโครงสร้างผลึกมีมาตั้งแต่ยุคแรกเริ่มของการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอน การสาธิต MicroED ที่ประสบความสำเร็จครั้งแรกได้รับการรายงานในปี 2013 โดยห้องปฏิบัติการGonen ^{[ 1 ]}สำหรับโครงสร้างของไลโซไซม์ซึ่งเป็นโปรตีนทดสอบคลาสสิกในผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์

โปรโตคอลโดยละเอียดสำหรับการตั้งค่ากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนและการเก็บรวบรวมข้อมูลได้รับการเผยแพร่แล้ว^{[ 15 ]}

ข้อมูล MicroED รวบรวมโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (ไครโอเจนิก)กล้องจุลทรรศน์สามารถติดตั้งช่องรับแสงเฉพาะพื้นที่ได้ แต่ MicroED ก็สามารถทำได้โดยไม่ต้องใช้ช่องรับแสงเฉพาะพื้นที่เช่นกัน แม้ว่าจะมีการรายงานโครงสร้างบางอย่างโดยไม่ต้องแช่แข็ง แต่บางครั้งความเสียหายจากรังสีก็ลดลงและได้ความละเอียดสูงขึ้นโดยใช้การทำความเย็นแบบไครโอเจนิก แม้แต่กับโมเลกุลขนาดเล็ก^{[ 16 ]}

มีการใช้เครื่องตรวจจับหลายชนิดเพื่อรวบรวมข้อมูลการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนในการทดลอง MicroED เครื่องตรวจจับที่ใช้ เทคโนโลยี อุปกรณ์ประจุคู่ (CCD)และเซมิคอนดักเตอร์โลหะออกไซด์เสริม (CMOS)ได้ถูกนำมาใช้แล้ว ด้วยเครื่องตรวจจับ CMOS สามารถตีความจำนวนอิเล็กตรอนแต่ละตัวได้^{[ 17 ]}เมื่อไม่นานมานี้ เครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงได้ถูกนำมาใช้อย่างประสบความสำเร็จทั้งในโหมดเชิงเส้นและโหมดการนับ^{[ 18 ] [ 19 ]}ในตัวอย่างเหล่านี้ การนับอิเล็กตรอนทำให้สามารถกำหนดเฟสและแสดงภาพไฮโดรเจนในโปรตีนได้ตั้งแต่เริ่มต้น

การตีพิมพ์หลักฐานแนวคิดเบื้องต้นเกี่ยวกับ MicroED ใช้ผลึกไลโซไซม์^{[ 1 ]}รวบรวมข้อมูลได้มากถึง 90 องศาจากผลึกนาโนเดี่ยว โดยมีขั้นตอน 1 องศาแยกกันระหว่างเฟรม แต่ละรูปแบบการเลี้ยวเบนถูกรวบรวมด้วยอัตราปริมาณรังสีต่ำมากที่ ~0.01 e ⁻ /Å ² /s ข้อมูลจากผลึก 3 ชิ้นถูกรวมเข้าด้วยกัน^{[ 20 ]}เพื่อให้ได้โครงสร้างที่มีความละเอียด 2.9Å พร้อมสถิติการปรับแต่งที่ดี ทำให้สามารถกำหนดโครงสร้างของโปรตีนที่ไวต่อปริมาณรังสีจากไมโครคริสตัล 3 มิติในสภาวะแช่แข็งได้

MicroED ใช้การหมุนอย่างต่อเนื่องในระหว่างกระบวนการเก็บข้อมูล^{[ 2 ]}โดยผลึกจะหมุนช้าๆ ในทิศทางเดียวในขณะที่การเลี้ยวเบนถูกบันทึกด้วยกล้องความเร็วสูงในรูปแบบภาพยนตร์ ซึ่งนำไปสู่การปรับปรุงคุณภาพข้อมูลหลายประการและอนุญาตให้ประมวลผลข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์มาตรฐาน^{[ 2 ]}การหมุนอย่างต่อเนื่องของ MicroED ช่วยปรับปรุงการสุ่มตัวอย่างพื้นที่ผกผัน^{[ 21 ]}

โปรโตคอลโดยละเอียดสำหรับการประมวลผลข้อมูล MicroED ได้รับการเผยแพร่แล้ว^{[ 12 ]} เมื่อรวบรวมข้อมูล MicroED โดยใช้การหมุนแท่นอย่างต่อเนื่องสามารถใช้ ซอฟต์แวร์ผลึกศาสตร์ มาตรฐาน ^{[ 14 ] ได้}

วิธีการเลี้ยวเบนอิเล็กตรอนอื่นๆ ที่ได้รับการพัฒนาและแสดงให้เห็นว่าใช้งานได้ ได้แก่ Automated Diffraction Tomography (ADT) ^{[ 22 ]}และ Rotation Electron Diffraction (RED ^{[ 23 ]} ) วิธีการเหล่านี้แตกต่างจาก MicroED เล็กน้อย: ใน ADT จะใช้ขั้นตอนการเอียงของโกนิโอมิเตอร์ แบบไม่ต่อเนื่อง เพื่อครอบคลุมพื้นที่ผกผันร่วมกับการหมุนลำแสงเพื่อลดผลกระทบของการเลี้ยวเบนแบบไดนามิก^{[ 22 ]} ADT ใช้ฮาร์ดแวร์และซอฟต์แวร์สำหรับการหมุน และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนส่งผ่านสำหรับการติดตามผลึก^{[ 22 ]} RED ทำใน TEM แต่โกนิโอมิเตอร์จะถูกเอียงเป็นขั้นตอนแบบไม่ต่อเนื่อง และใช้การเอียงลำแสงเพื่อเติมช่องว่าง^{[ 23 ]}ใช้ซอฟต์แวร์ในการประมวลผลข้อมูล ADT และ RED ^{[ 23 ]}

MicroED ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดโครงสร้างของโปรตีนทรงกลมขนาดใหญ่^{[ 24 ]}โปรตีนขนาดเล็ก^{[ 2 ]}เปปไทด์^{[ 25 ]}โปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์^{[ 26 ]}โมเลกุลอินทรีย์^{[ 27 ] [ 28 ]}และสารประกอบอนินทรีย์^{[ 29 ]}ในตัวอย่างเหล่านี้จำนวนมาก พบว่ามีไฮโดรเจนและไอออนที่มีประจุ^{[ 25 ] [ 26 ]}

โครงสร้างแรกที่ได้รับการแก้ไขโดย MicroED ได้รับการตีพิมพ์ในช่วงปลายปี 2015 ^{[ 25 ]}โครงสร้างเหล่านี้เป็นชิ้นส่วนของเปปไทด์ที่ประกอบเป็นแกนพิษของα-synculeinซึ่งเป็นโปรตีนที่ก่อให้เกิดโรคพาร์กินสันและนำไปสู่ความเข้าใจในกลไกการรวมตัวของสารพิษ โครงสร้างได้รับการแก้ไขที่ความละเอียด 1.4 Å

โครงสร้างใหม่ของโปรตีนตัวแรกที่ได้รับการแก้ไขโดย MicroED ได้รับการตีพิมพ์ในปี 2019 ^{[ 30 ]}โปรตีนดังกล่าวคือเมทัลโลเอนไซม์ R2-like ligand-binding oxidase (R2lox) จาก Sulfolobus acidocaldarius โครงสร้างได้รับการแก้ไขที่ความละเอียด 3.0 Å โดยการแทนที่โมเลกุลโดยใช้แบบจำลองที่มีความเหมือนของลำดับ 35% ซึ่งสร้างขึ้นจากโฮโมล็อกที่ใกล้เคียงที่สุดที่มีโครงสร้างที่ทราบแล้ว

• ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับ MicroED จาก ThermoFisher Scientific ผู้ผลิตกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านรายใหญ่
  • วิดีโอสัมภาษณ์เกี่ยวกับการพัฒนา MicroED และการประยุกต์ใช้งาน
• ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับ MicroED จาก Janelia Archives
• ข้อมูลเบื้องต้นและผลงานตีพิมพ์เกี่ยวกับ MicroED จากห้องปฏิบัติการ Gonen