ในทางพันธุศาสตร์การจัดลำดับแบบช็อตกัน (Shotgun sequencing)เป็นวิธีการที่ใช้ในการจัดลำดับ สาย ดีเอ็นเอแบบสุ่ม ชื่อนี้ได้มาจากการเปรียบเทียบกับ กลุ่มกระสุนที่ขยายตัวอย่างรวดเร็วและกึ่งสุ่มของปืน ลูกซอง

วิธี การ หาลำดับดีเอ็นเอแบบหยุดสาย ("การหาลำดับแบบแซงเกอร์") สามารถใช้ได้กับสายดีเอ็นเอสั้นๆ ที่มีความยาว 100 ถึง 1000 คู่เบส เท่านั้น เนื่องจากข้อจำกัดด้านขนาดนี้ ลำดับที่ยาวกว่าจึงถูกแบ่งออกเป็นชิ้นส่วนเล็กๆ ที่สามารถหาลำดับแยกกันได้ และชิ้นส่วนเหล่านี้จะถูกประกอบเข้าด้วยกันเพื่อให้ได้ลำดับทั้งหมด

ในการจัดลำดับแบบช็อตกัน^{[ 1 ] [ 2 ]} DNA จะถูกแบ่งออกเป็นส่วนเล็กๆ จำนวนมากแบบสุ่ม ซึ่งจะถูกจัดลำดับโดยใช้วิธีการยุติสายโซ่เพื่อให้ได้ข้อมูลการอ่าน ข้อมูลการอ่านที่ทับซ้อนกันหลายรายการสำหรับ DNA เป้าหมายจะได้รับโดยการดำเนินการแบ่งส่วนและจัดลำดับหลายรอบ จากนั้นโปรแกรมคอมพิวเตอร์จะใช้ปลายที่ทับซ้อนกันของข้อมูลการอ่านต่างๆ เพื่อประกอบเข้าด้วยกันเป็นลำดับต่อเนื่อง^{[ 1 ]}

การจัดลำดับดีเอ็นเอแบบช็อตกัน (Shotgun sequencing) เป็นหนึ่งในเทคโนโลยีพื้นฐานที่ทำให้สามารถจัดลำดับจีโนมทั้งหมดได้

ตัวอย่างเช่น ลองพิจารณาตัวอย่างการอ่านข้อความแบบปืนลูกซองสองรอบต่อไปนี้:

ในตัวอย่างที่ง่ายมากนี้ การอ่านแต่ละครั้งไม่ได้ครอบคลุมความยาวทั้งหมดของลำดับดั้งเดิม แต่การอ่านทั้งสี่ครั้งสามารถนำมาประกอบกันเป็นลำดับดั้งเดิมได้โดยใช้ส่วนที่ทับซ้อนกันของปลายเพื่อจัดเรียงและเรียงลำดับ ในความเป็นจริง กระบวนการนี้ใช้ข้อมูลจำนวนมหาศาลซึ่งเต็มไปด้วยความคลุมเครือและข้อผิดพลาดในการจัดลำดับ การประกอบจีโนมที่ซับซ้อนยิ่งขึ้นนั้นมีความซับซ้อนมากขึ้นเนื่องจากมีลำดับซ้ำ จำนวนมาก ซึ่งหมายความว่าการอ่านสั้นๆ ที่คล้ายกันอาจมาจากส่วนต่างๆ ของลำดับที่แตกต่างกันโดยสิ้นเชิง

จำเป็นต้องมีการอ่านทับซ้อนกันจำนวนมากสำหรับแต่ละส่วนของ DNA ดั้งเดิมเพื่อเอาชนะความยากลำบากเหล่านี้และประกอบลำดับได้อย่างแม่นยำ ตัวอย่างเช่น เพื่อให้โครงการจีโนมมนุษย์ เสร็จสมบูรณ์ จีโนมมนุษย์ส่วนใหญ่ได้รับการจัดลำดับที่ความครอบคลุม 12 เท่าหรือมากกว่า นั่นคือ เบสแต่ละตัวในลำดับสุดท้ายปรากฏอยู่ในการอ่านที่แตกต่างกันโดยเฉลี่ย 12 ครั้ง ถึงกระนั้น วิธีการในปัจจุบันก็ยังไม่สามารถแยกหรือประกอบลำดับที่เชื่อถือได้สำหรับจีโนมมนุษย์ ( ยูโครมาติก ) ประมาณ 1% ณ ปี 2547 ^{[ 3 ]}

การจัดลำดับจีโนมแบบช็อตกันสำหรับจีโนมขนาดเล็ก (4000 ถึง 7000 คู่เบส) ได้รับการเสนอแนะครั้งแรกในปี พ.ศ. 2522 ^{[ 1 ]}จีโนมแรกที่ได้รับการจัดลำดับโดยการจัดลำดับแบบช็อตกันคือจีโนมของไวรัสโมเสกของดอกกะหล่ำซึ่งตีพิมพ์ในปี พ.ศ. 2524 ^{[ 4 ] [ 5 ]}

การประยุกต์ใช้ที่กว้างขึ้นได้รับประโยชน์จากการจัดลำดับปลายคู่ (pairwise end sequencing ) ซึ่งเรียกกันทั่วไปว่า การจัดลำดับแบบปืนลูกซอง สองลำกล้อง (double-barrel shotgun sequencing ) เมื่อโครงการจัดลำดับดีเอ็นเอเริ่มครอบคลุมลำดับดีเอ็นเอที่ยาวและซับซ้อนมากขึ้น กลุ่มวิจัยหลายกลุ่มเริ่มตระหนักว่าสามารถได้ข้อมูลที่เป็นประโยชน์โดยการจัดลำดับปลายทั้งสองข้างของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ แม้ว่าการจัดลำดับปลายทั้งสองข้างของชิ้นส่วนเดียวกันและติดตามข้อมูลที่จับคู่กันจะยุ่งยากกว่าการจัดลำดับปลายด้านเดียวของชิ้นส่วนที่แตกต่างกันสองชิ้น แต่ความรู้ที่ว่าลำดับทั้งสองมีทิศทางตรงกันข้ามและอยู่ห่างกันประมาณความยาวของชิ้นส่วนนั้นมีค่าในการสร้างลำดับของชิ้นส่วนเป้าหมายดั้งเดิมขึ้นมาใหม่

ประวัติความเป็นมา คำอธิบายที่ตีพิมพ์ครั้งแรกเกี่ยวกับการใช้ปลายคู่เกิดขึ้นในปี 1990 ^{[ 6 ]}ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการจัดลำดับของ ตำแหน่ง HGPRT ของมนุษย์ แม้ว่าการใช้ปลายคู่จะจำกัดอยู่เพียงการปิดช่องว่างหลังจากการใช้แนวทางการจัดลำดับแบบช็อตกันแบบดั้งเดิมก็ตาม คำอธิบายเชิงทฤษฎีครั้งแรกของกลยุทธ์การจัดลำดับปลายคู่แบบบริสุทธิ์ โดยสมมติว่าชิ้นส่วนมีความยาวคงที่ เกิดขึ้นในปี 1991 ^{[ 7 ]}ในขณะนั้น มีฉันทามติในชุมชนว่าความยาวชิ้นส่วนที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการจัดลำดับปลายคู่ควรเป็นสามเท่าของความยาวลำดับที่อ่านได้ ในปี 1995 Roach et al. ^{[ 8 ]}ได้นำเสนอนวัตกรรมของการใช้ชิ้นส่วนที่มีขนาดแตกต่างกัน และแสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์การจัดลำดับปลายคู่แบบบริสุทธิ์นั้นเป็นไปได้สำหรับเป้าหมายขนาดใหญ่ ต่อมา สถาบันวิจัยจีโนมิกส์ (TIGR) ได้นำกลยุทธ์นี้ไปใช้ในการจัดลำดับจีโนมของแบคทีเรียHaemophilus influenzaeในปี 1995 ^{[ 9 ]}จากนั้นCelera Genomics ก็ได้นำ ไปใช้ในการจัดลำดับ จีโนมของ Drosophila melanogaster (แมลงวันผลไม้) ในปี 2000 ^{[ 10 ]}และต่อมาก็ใช้จัดลำดับจีโนมของมนุษย์

ในการประยุกต์ใช้กลยุทธ์นี้ สายดีเอ็นเอที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงจะถูกตัดเป็นชิ้นส่วนแบบสุ่ม เลือกขนาด (โดยปกติคือ 2, 10, 50 และ 150 กิโลเบส) และโคลน ลงใน เวกเตอร์ที่เหมาะสมจากนั้นโคลนจะถูกหาลำดับจากทั้งสองด้านโดยใช้วิธีการยุติสายโซ่ทำให้ได้ลำดับสั้นๆ สองลำดับ แต่ละลำดับเรียกว่าลำดับปลายหรือลำดับที่ 1 และลำดับที่ 2และลำดับสองลำดับจากโคลนเดียวกันเรียกว่าคู่ลำดับเนื่องจากวิธีการยุติสายโซ่มักจะสร้างลำดับที่มีความยาวระหว่าง 500 ถึง 1000 เบสเท่านั้น ดังนั้นในโคลนส่วนใหญ่ คู่ลำดับจึงแทบจะไม่ทับซ้อนกัน

ลำดับดั้งเดิมถูกสร้างขึ้นใหม่จากข้อมูลการอ่านโดยใช้ ซอฟต์แวร์ ประกอบลำดับขั้นแรก ข้อมูลการอ่านที่ซ้อนทับกันจะถูกรวบรวมเป็นลำดับประกอบที่ยาวขึ้นซึ่งเรียกว่าคอนติ๊ก คอนติ๊กสามารถเชื่อมต่อกันเป็นสแคฟโฟลด์ได้โดยการติดตามการเชื่อมต่อระหว่างคู่เมท ระยะห่างระหว่างคอนติ๊กสามารถอนุมานได้จากตำแหน่งของคู่เมทหากทราบความยาวเฉลี่ยของชิ้นส่วนในไลบรารีและมีช่วงความคลาดเคลื่อนที่แคบ ขึ้นอยู่กับขนาดของช่องว่างระหว่างคอนติ๊ก สามารถใช้เทคนิคต่างๆ ในการค้นหาลำดับในช่องว่างได้ หากช่องว่างมีขนาดเล็ก (5-20 กิโลเบส) จำเป็นต้องใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) เพื่อขยายบริเวณนั้น ตามด้วยการจัดลำดับ หากช่องว่างมีขนาดใหญ่ (>20 กิโลเบส) ชิ้นส่วนขนาดใหญ่จะถูกโคลนในเวกเตอร์พิเศษ เช่นโครโมโซมเทียมของแบคทีเรีย (BAC) ตามด้วยการจัดลำดับของเวกเตอร์

ผู้สนับสนุนแนวทางนี้โต้แย้งว่าสามารถจัดลำดับจีโนม ทั้งหมด ได้ในคราวเดียวโดยใช้อาร์เรย์ขนาดใหญ่ของเครื่องจัดลำดับ ซึ่งทำให้กระบวนการทั้งหมดมีประสิทธิภาพมากกว่าวิธีการแบบดั้งเดิมมาก ผู้คัดค้านโต้แย้งว่าถึงแม้เทคนิคนี้จะจัดลำดับดีเอ็นเอในบริเวณกว้างได้อย่างรวดเร็ว แต่ความสามารถในการเชื่อมโยงบริเวณเหล่านี้อย่างถูกต้องนั้นน่าสงสัย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ จีโนม ยูคาริโอตที่มีบริเวณที่ซ้ำกัน เมื่อ โปรแกรม ประกอบลำดับมีความซับซ้อนมากขึ้นและกำลังการประมวลผลมีราคาถูกลง อาจเป็นไปได้ที่จะเอาชนะข้อจำกัดนี้ได้^{[ 11 ]}

ความครอบคลุม (ความลึกของการอ่าน หรือ ความลึก) คือจำนวนเฉลี่ยของการอ่านที่แสดงถึงนิวคลีโอไทด์ ที่กำหนด ในลำดับที่สร้างขึ้นใหม่ สามารถคำนวณได้จากความยาวของจีโนมดั้งเดิม ( G ) จำนวนการอ่าน ( N ) และความยาวเฉลี่ยของการอ่าน ( L ) ตัวอย่างเช่น จีโนมสมมติที่มี 2,000 คู่เบสที่สร้างขึ้นใหม่จากการอ่าน 8 ครั้ง โดยมีความยาวเฉลี่ย 500 นิวคลีโอไทด์ จะมีค่าความซ้ำซ้อน 2 เท่า พารามิเตอร์นี้ยังช่วยให้สามารถประมาณค่าอื่นๆ ได้ เช่น เปอร์เซ็นต์ของจีโนมที่ครอบคลุมโดยการอ่าน (บางครั้งเรียกว่าความครอบคลุมเช่นกัน) ความครอบคลุมสูงในการจัดลำดับแบบช็อตกันเป็นที่ต้องการ เนื่องจากสามารถเอาชนะข้อผิดพลาดในการระบุเบสและการประกอบได้ หัวข้อของทฤษฎีการจัดลำดับดีเอ็นเอจะกล่าวถึงความสัมพันธ์ของปริมาณดังกล่าว ${\displaystyle N\times L/G}$

บางครั้งมีการแยกความแตกต่างระหว่างการครอบคลุมลำดับและการครอบคลุมทางกายภาพการครอบคลุมลำดับคือจำนวนครั้งเฉลี่ยที่อ่านเบส (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) การครอบคลุมทางกายภาพคือจำนวนครั้งเฉลี่ยที่อ่านเบสหรือครอบคลุมโดยคู่การอ่าน^{[ 12 ]}

แม้ว่าในทางทฤษฎีแล้วการจัดลำดับแบบช็อตกันสามารถนำไปใช้กับจีโนมที่มีขนาดใดก็ได้ แต่การนำไปใช้โดยตรงกับการจัดลำดับจีโนมขนาดใหญ่ (เช่นจีโนมมนุษย์ ) นั้นมีข้อจำกัดจนกระทั่งช่วงปลายทศวรรษ 1990 เมื่อความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีทำให้สามารถจัดการกับข้อมูลที่ซับซ้อนจำนวนมหาศาลที่เกี่ยวข้องในกระบวนการนี้ได้^{[ 13 ]}ในอดีต เชื่อกันว่าการจัดลำดับแบบช็อตกันของจีโนมทั้งหมดนั้นมีข้อจำกัดทั้งจากขนาดของจีโนมขนาดใหญ่และความซับซ้อนที่เพิ่มขึ้นจากเปอร์เซ็นต์ของดีเอ็นเอที่ซ้ำกันสูง (มากกว่า 50% สำหรับจีโนมมนุษย์) ที่มีอยู่ในจีโนมขนาดใหญ่^{[ 14 ]}ยังไม่มีการยอมรับกันอย่างกว้างขวางว่าการจัดลำดับแบบช็อตกันของจีโนมขนาดใหญ่จะให้ข้อมูลที่เชื่อถือได้ ด้วยเหตุผลเหล่านี้ จึงต้องใช้กลยุทธ์อื่นๆ ที่ช่วยลดภาระการคำนวณของการประกอบลำดับก่อนที่จะทำการจัดลำดับแบบช็อตกัน^{[ 14 ]} ในการจัดลำดับแบบลำดับชั้น หรือที่เรียกว่าการจัดลำดับแบบบนลงล่าง จะมีการสร้าง แผนที่ทางกายภาพของจีโนมที่มีความละเอียดต่ำก่อนที่จะทำการจัดลำดับจริง จากแผนที่นี้ จะมีการเลือกชิ้นส่วนจำนวนน้อยที่สุดที่ครอบคลุมทั้งโครโมโซมเพื่อนำไปจัดลำดับ^{[ 15 ]}ด้วยวิธีนี้ จึงต้องการปริมาณการจัดลำดับและการประกอบที่มีปริมาณงานสูงน้อยที่สุด

จีโนมที่ถูกขยายแล้วจะถูกตัดแบ่งเป็นชิ้นใหญ่ๆ (50-200 กิโลเบส) ก่อน จากนั้นจึงนำไปโคลนลงในโฮสต์แบคทีเรียโดยใช้ BAC หรือโครโมโซมเทียมที่ได้จาก P1 (PAC) เนื่องจากมีการตัดสำเนาจีโนมหลายชุดแบบสุ่ม ชิ้นส่วนที่อยู่ในโคลนเหล่านี้จึงมีปลายที่แตกต่างกัน และด้วยความครอบคลุมที่เพียงพอ (ดูหัวข้อด้านบน) การค้นหาโครงร่าง ที่เล็กที่สุด ของคอนติ๊ก BACที่ครอบคลุมจีโนมทั้งหมดจึงเป็นไปได้ในทางทฤษฎี โครงร่างนี้เรียกว่าเส้นทางการเรียงตัวขั้นต่ำ (minimum tiling path )

เมื่อพบเส้นทางการเรียงตัวแล้ว BAC ที่สร้างเส้นทางนี้จะถูกตัดแบบสุ่มเป็นชิ้นส่วนเล็กๆ และสามารถเรียงลำดับโดยใช้วิธีช็อตกันในระดับที่เล็กกว่าได้^{[ 16 ]}

แม้ว่าจะไม่ทราบลำดับทั้งหมดของคอนติ๊ก BAC แต่ทราบทิศทางของคอนติ๊กเหล่านั้นเมื่อเทียบกับกันและกัน มีหลายวิธีในการอนุมานลำดับนี้และเลือก BAC ที่ประกอบเป็นเส้นทางการเรียงตัว กลยุทธ์ทั่วไปเกี่ยวข้องกับการระบุตำแหน่งของโคลนเมื่อเทียบกับกันและกัน จากนั้นเลือกโคลนจำนวนน้อยที่สุดที่จำเป็นในการสร้างโครงร่างต่อเนื่องที่ครอบคลุมพื้นที่ที่สนใจทั้งหมด ลำดับของโคลนจะถูกอนุมานโดยการพิจารณาวิธีที่พวกมันทับซ้อนกัน^{[ 17 ]}สามารถระบุโคลนที่ทับซ้อนกันได้หลายวิธี โพรบขนาดเล็กที่ติดฉลากด้วยกัมมันตรังสีหรือสารเคมีที่มีไซต์ติดแท็กลำดับ (STS) สามารถไฮบริดกับไมโครอาร์เรย์ที่พิมพ์โคลนไว้^{[ 17 ]}ด้วยวิธีนี้ โคลนทั้งหมดที่มีลำดับเฉพาะในจีโนมจะถูกระบุ จากนั้นสามารถจัดลำดับปลายของโคลนเหล่านี้เพื่อให้ได้โพรบใหม่และทำซ้ำกระบวนการในวิธีการที่เรียกว่าการเดินโครโมโซม

อีกทางเลือกหนึ่งคือสามารถ ย่อย ไลบรารี BAC ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะได้โคลนสองตัวที่มีขนาดชิ้นส่วนร่วมกันหลายชิ้นจะถูกอนุมานว่าทับซ้อนกัน เนื่องจากมีไซต์ตัดจำเพาะที่มีระยะห่างคล้ายกันหลายไซต์ร่วมกัน^{[ 17 ]}วิธีการทำแผนที่จีโนมนี้เรียกว่าการทำลายนิ้วมือด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะหรือ BAC เนื่องจากระบุชุดของไซต์ตัดจำเพาะที่มีอยู่ในแต่ละโคลน เมื่อพบการทับซ้อนกันระหว่างโคลนและทราบลำดับของพวกมันเทียบกับจีโนมแล้ว โครงร่างของชุดย่อยขั้นต่ำของคอนติ๊กเหล่านี้ที่ครอบคลุมจีโนมทั้งหมดจะถูกจัดลำดับแบบช็อตกัน^{[ 15 ]}

เนื่องจากเกี่ยวข้องกับการสร้างแผนที่จีโนมที่มีความละเอียดต่ำก่อน การจัดลำดับช็อตกันแบบลำดับชั้นจึงช้ากว่าการจัดลำดับช็อตกันทั้งจีโนม แต่พึ่งพาอัลกอริทึมคอมพิวเตอร์น้อยกว่าการจัดลำดับช็อตกันทั้งจีโนม อย่างไรก็ตาม กระบวนการสร้างไลบรารี BAC ที่ครอบคลุมและการเลือกเส้นทางไทล์ทำให้การจัดลำดับช็อตกันแบบลำดับชั้นช้าและต้องใช้แรงงานมาก เมื่อเทคโนโลยีพร้อมใช้งานและความน่าเชื่อถือของข้อมูลได้รับการพิสูจน์แล้ว^{[ 14 ]}ความเร็วและประสิทธิภาพด้านต้นทุนของการจัดลำดับช็อตกันทั้งจีโนมทำให้เป็นวิธีการหลักสำหรับการจัดลำดับจีโนม

การจัดลำดับดีเอ็นเอแบบช็อตกัน (shotgun sequencing) แบบดั้งเดิมนั้นอิงตามวิธีการจัดลำดับแบบแซงเกอร์ (Sanger sequencing method) ซึ่งเป็นเทคนิคที่ทันสมัยที่สุดสำหรับการจัดลำดับจีโนมในช่วงประมาณปี 1995-2005 กลยุทธ์ช็อตกันยังคงถูกนำมาใช้ในปัจจุบัน แต่ใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับอื่นๆ เช่นการจัดลำดับแบบอ่านสั้น (short-read sequencing)และการจัดลำดับแบบอ่านยาว (long-read sequencing ) แทน

การจัดลำดับแบบอ่านสั้นหรือ "รุ่นต่อไป" สร้างลำดับที่สั้นกว่า (ตั้งแต่ 25–500 bp) แต่ได้ลำดับหลายแสนหรือหลายล้านลำดับในเวลาที่ค่อนข้างสั้น (ประมาณหนึ่งวัน) ^{[ 18 ]} ส่งผลให้มีความครอบคลุมสูง แต่กระบวนการประกอบนั้นต้องใช้การคำนวณที่เข้มข้นกว่ามาก เทคโนโลยีเหล่านี้เหนือกว่าการจัดลำดับแบบ Sanger อย่างมากเนื่องจากปริมาณข้อมูลสูงและใช้เวลาค่อนข้างสั้นในการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด^{[ 19 ]}

การอ่านที่มีความยาว 400-500 คู่เบสก็เพียงพอที่จะระบุชนิดหรือสายพันธุ์ของสิ่งมีชีวิตที่ DNA มาจากได้ หากทราบจีโนมอยู่แล้ว เช่น โดยใช้ ซอฟต์แวร์ จำแนกอนุกรมวิธานแบบk -mer การอ่านหลายล้านครั้งจากการจัดลำดับรุ่นต่อไปของตัวอย่างสิ่งแวดล้อมทำให้สามารถรับภาพรวมที่สมบูรณ์ของไมโครไบโอมที่ซับซ้อนใดๆ ที่มีหลายพันสายพันธุ์ เช่นจุลินทรีย์ในลำไส้ ข้อดีเหนือ การจัดลำดับแอมพลิคอน 16S rRNAคือ ไม่จำกัดเฉพาะแบคทีเรีย การจำแนกในระดับสายพันธุ์ ในขณะที่การจัดลำดับแอมพลิคอนได้เพียงระดับสกุล และความเป็นไปได้ในการสกัดยีนทั้งหมดและระบุหน้าที่ของยีนเหล่านั้นเป็นส่วนหนึ่งของเมตาจีโนม^{[ 20 ]}ความไวของการจัดลำดับเมตาจีโนมทำให้เป็นตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับการใช้งานทางคลินิก^{[ 21 ]}อย่างไรก็ตาม มันเน้นย้ำถึงปัญหาการปนเปื้อนของตัวอย่างหรือกระบวนการจัดลำดับ^{[ 22 ]}

• การจัดลำดับจีโนมแบบเมตาจีโนมิกส์ทางคลินิก
• ทฤษฎีการจัดลำดับดีเอ็นเอ
• การเดินเบื้องต้น

 บทความนี้ได้นำเนื้อหาที่เป็นสาธารณสมบัติจากNCBI Handbook มา ใช้(ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ )