การจัดลำดับเซลล์เดี่ยว จะตรวจสอบข้อมูล ลำดับกรดนิวคลีอิกจากเซลล์ แต่ละเซลล์ ด้วยเทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นใหม่ ที่ได้รับการปรับปรุง ทำให้ได้ความละเอียดสูงขึ้นของความแตกต่างระหว่างเซลล์และความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับหน้าที่ของเซลล์แต่ละเซลล์ในบริบทของสภาพแวดล้อมจุลภาค ^{[ 1 ]}ตัวอย่างเช่น ในมะเร็ง การจัดลำดับดีเอ็นเอของเซลล์แต่ละเซลล์สามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในกลุ่มเซลล์ขนาดเล็ก ในการพัฒนา การจัดลำดับอาร์เอ็นเอที่แสดงออกโดยเซลล์แต่ละเซลล์สามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการดำรงอยู่และพฤติกรรมของเซลล์ประเภทต่างๆ^{[ 2 ]} ในระบบจุลินทรีย์ ประชากรของสายพันธุ์เดียวกันอาจปรากฏเป็นโคลนทางพันธุกรรม อย่างไรก็ตาม การจัดลำดับอาร์เอ็นเอหรือการดัดแปลง เอพิเจเนติ กส์ ของเซลล์เดี่ยวสามารถเปิดเผยความแปรปรวนระหว่างเซลล์ ซึ่งอาจช่วยให้ประชากรปรับตัวได้อย่างรวดเร็วเพื่อความอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงไป^{[ 3 ]}

เซลล์มนุษย์ทั่วไปประกอบด้วยคู่เบส DNA ประมาณ 2 x 3.3 พันล้านคู่ และเบส mRNA 600 ล้านเบส โดยปกติแล้ว จะใช้เซลล์หลายล้านเซลล์ผสมกันในการจัดลำดับ DNA หรือ RNA โดยใช้วิธีการแบบดั้งเดิม เช่นการจัดลำดับแบบ Sangerหรือการจัดลำดับรุ่นใหม่การจัดลำดับ DNA และ RNA จากเซลล์เดียวอย่างละเอียดช่วยให้สามารถตรวจสอบการทำงานของเซลล์ได้อย่างครอบคลุม^{[ 1 ]}เช่นเดียวกับการทดลองจัดลำดับรุ่นใหม่ทั่วไป โปรโตคอลการจัดลำดับเซลล์เดี่ยวโดยทั่วไปประกอบด้วยขั้นตอนต่อไปนี้: การแยกเซลล์เดี่ยวการสกัดและการขยายกรดนิวคลี อิก การเตรียม ไลบรารีสำหรับ การจัดลำดับ การจัดลำดับ และ การวิเคราะห์ข้อมูล ทางชีวสารสนเทศการจัดลำดับเซลล์เดี่ยวมีความท้าทายมากกว่าการจัดลำดับจากเซลล์จำนวนมาก ปริมาณวัสดุเริ่มต้นที่น้อยจากเซลล์เดี่ยวทำให้การเสื่อมสภาพ การสูญเสียตัวอย่าง และการปนเปื้อนส่งผลกระทบอย่างมากต่อคุณภาพของข้อมูลการจัดลำดับ นอกจากนี้ เนื่องจากจำนวนกรดนิวคลีอิกที่ใช้อยู่ในระดับพิโคแกรม^{[ 4 ]}จึงมักจำเป็นต้องมีการขยายสัญญาณจำนวนมากในระหว่างการเตรียมตัวอย่างสำหรับการจัดลำดับเซลล์เดี่ยว ส่งผลให้การครอบคลุมไม่สม่ำเสมอ มีสัญญาณรบกวน และการหาปริมาณข้อมูลการจัดลำดับไม่ถูกต้อง

การพัฒนาทางเทคนิคเมื่อเร็วๆ นี้ทำให้การจัดลำดับเซลล์เดี่ยวเป็นเครื่องมือที่มีศักยภาพในการแก้ปัญหาที่ดูเหมือนจะเข้าถึงได้ยาก ตัวอย่างเช่น ตัวอย่างที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน เซลล์ชนิดหายาก ความสัมพันธ์ของสายพันธุ์เซลล์ ภาวะโมเสกของเนื้อเยื่อร่างกาย การวิเคราะห์จุลินทรีย์ที่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้ และวิวัฒนาการของโรค ล้วนสามารถอธิบายได้ด้วยการจัดลำดับเซลล์เดี่ยว^{[ 5 ]} การจัดลำดับเซลล์เดี่ยวได้รับการคัดเลือกให้เป็นวิธีการแห่งปี 2013 โดย Nature Publishing Group ^{[ 6 ]}

การจัดลำดับจีโนม DNA ของเซลล์เดี่ยวเกี่ยวข้องกับการแยกเซลล์เดี่ยว การขยายจีโนมทั้งหมดหรือบริเวณที่สนใจ การสร้างไลบรารีการจัดลำดับ และจากนั้นใช้การจัดลำดับ DNA รุ่นใหม่ (เช่นIllumina , Ion Torrent ) การจัดลำดับ DNA ของเซลล์เดี่ยวได้รับการประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางในระบบสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเพื่อศึกษาสรีรวิทยาปกติและโรคต่างๆ ความละเอียดระดับเซลล์เดี่ยวสามารถเปิดเผยบทบาทของภาวะโมเสกทางพันธุกรรมหรือความหลากหลายทางพันธุกรรม ภายในเนื้องอก ในการพัฒนาของมะเร็งหรือการตอบสนองต่อการรักษา^{[ 7 ]}ในบริบทของไมโครไบโอม จีโนมจากสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวเรียกว่าจีโนมที่ขยายเดี่ยว (SAG) ความก้าวหน้าในการจัดลำดับ DNA ของเซลล์เดี่ยวทำให้สามารถรวบรวมข้อมูลจีโนมจากสายพันธุ์โปรคาริโอตที่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้ซึ่งมีอยู่ในไมโครไบโอมที่ซับซ้อน^{[ 8 ]}  แม้ว่า SAG จะมีลักษณะความสมบูรณ์ต่ำและมีอคติอย่างมาก แต่ความก้าวหน้าทางด้านการคำนวณเมื่อเร็วๆ นี้ได้ทำให้สามารถประกอบจีโนมที่เกือบสมบูรณ์จาก SAG แบบผสมได้^{[ 9 ]}ข้อมูลที่ได้จากจุลินทรีย์อาจสร้างกระบวนการสำหรับการเพาะเลี้ยงในอนาคต^{[ 10 ]} เครื่องมือประกอบจีโนมบางส่วนที่ใช้ในการจัดลำดับจีโนมแบบเซลล์เดียว ได้แก่SPAdes , IDBA-UD, Cortex และ HyDA ^{[ 11 ]}

มีการเผยแพร่รายชื่อวิธีการโอไมซ์เซลล์เดี่ยวที่แตกต่างกันมากกว่า 100 วิธี^{[ 12 ]}

การขยายดีเอ็นเอแบบหลายสายด้วย การแทนที่ (Multiple displacement amplification หรือ MDA)เป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ช่วยให้สามารถขยายดีเอ็นเอจากแบคทีเรียในระดับเฟมโตแกรมไปจนถึงระดับไมโครกรัมเพื่อนำไปวิเคราะห์หาลำดับเบส สารเคมีที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยา MDA ได้แก่ ไพรเมอร์แบบสุ่มและเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสจากแบคทีริโอเฟจ phi29 ในปฏิกิริยาแบบไอโซเทอร์มอลที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ดีเอ็นเอจะถูกขยายด้วยสารเคมีที่ให้มา ในขณะที่เอนไซม์พอลิเมอเรสสร้างสายใหม่ ปฏิกิริยาการแทนที่สายจะเกิดขึ้น ทำให้เกิดการสังเคราะห์สำเนาหลายชุดจากดีเอ็นเอต้นแบบแต่ละสาย ในขณะเดียวกัน สายที่ถูกขยายไปก่อนหน้านี้ก็จะถูกแทนที่ ผลิตภัณฑ์ MDA จะมีความยาวประมาณ 12 กิโลเบส และอาจยาวได้ถึงประมาณ 100 กิโลเบส ทำให้สามารถนำไปใช้ในการวิเคราะห์หาลำดับเบสของดีเอ็นเอได้^{[ 10 ]}ในปี 2017 ได้มีการนำเทคนิคนี้ซึ่งได้รับการปรับปรุงครั้งสำคัญ เรียกว่า WGA-X มาใช้ โดยใช้ประโยชน์จากเอนไซม์โพลีเมอเรส phi29 ที่กลายพันธุ์ซึ่งทนความร้อนได้ ทำให้สามารถกู้คืนจีโนมจากเซลล์แต่ละเซลล์ได้ดีขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งเซลล์ที่มีปริมาณ G+Cสูง^{[ 13 ]}นอกจากนี้ MDA ยังได้รับการนำไปใช้ในระบบหยดไมโครฟลูอิดิกเพื่อให้ได้การขยายจีโนมทั้งหมดของเซลล์เดี่ยวแบบขนานสูง โดยการห่อหุ้มเซลล์เดี่ยวไว้ในหยดเพื่อจับและขยาย DNA วิธีนี้ช่วยลดอคติและเพิ่มปริมาณงานเมื่อเทียบกับ MDA แบบดั้งเดิม^{[ 14 ]}

อีกวิธีหนึ่งที่ใช้กันทั่วไปคือMALBAC ^{[ 15 ]}เช่นเดียวกับที่ทำใน MDA วิธีนี้เริ่มต้นด้วยการขยายแบบไอโซเทอร์มอล แต่ไพรเมอร์จะถูกล้อมรอบด้วยลำดับ "ทั่วไป" สำหรับการขยาย PCR ในขั้นตอนต่อไปเมื่อสร้างแอมพลิคอนเบื้องต้น ลำดับทั่วไปจะส่งเสริมการเชื่อมต่อตัวเองและการก่อตัวของ "ลูป" เพื่อป้องกันการขยายเพิ่มเติม ในทางตรงกันข้ามกับ MDA เครือข่าย DNA ที่แตกแขนงอย่างมากจะไม่เกิดขึ้น แต่ลูปจะถูกทำให้เสียสภาพในรอบอุณหภูมิอื่น ทำให้สามารถขยายชิ้นส่วนด้วย PCR ได้ MALBAC ยังถูกนำไปใช้ในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก แต่ประสิทธิภาพการขยายไม่ได้ดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อห่อหุ้มในหยดนาโนลิตร^{[ 16 ]}

เมื่อเปรียบเทียบ MDA และ MALBAC แล้ว MDA ให้ผลลัพธ์การครอบคลุมจีโนมที่ดีกว่า แต่ MALBAC ให้การครอบคลุมที่สม่ำเสมอกว่าทั่วทั้งจีโนม MDA อาจมีประสิทธิภาพมากกว่าในการระบุSNPในขณะที่ MALBAC เหมาะสมกว่าสำหรับการตรวจจับความแปรผันของจำนวนสำเนา แม้ว่าการทำ MDA ด้วยอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกจะช่วยลดอคติและการปนเปื้อนได้อย่างมาก แต่เคมีที่เกี่ยวข้องใน MALBAC ไม่ได้แสดงศักยภาพในการเพิ่มประสิทธิภาพได้ดีเท่าที่ควร

วิธีการที่เหมาะสมเป็นพิเศษสำหรับการค้นพบความแปรผันโครงสร้าง จีโนม คือการจัดลำดับดีเอ็นเอแม่แบบเซลล์เดี่ยว (หรือที่รู้จักกันในชื่อ Strand-seq) ^{[ 17 ]}โดยใช้หลักการประมวลผลแบบสามช่องทางของเซลล์เดี่ยว ซึ่งใช้การสร้างแบบจำลองร่วมกันของทิศทางการอ่าน ความลึกของการอ่าน และเฟสแฮพลอไทป์ Strand-seq ช่วยให้สามารถค้นพบความแปรผันโครงสร้าง โซมาติกทั้งหมด ที่มีขนาด ≥200kb ได้ Strand-seq เอาชนะข้อจำกัดของวิธีการขยายจีโนมทั้งหมดสำหรับการระบุความแปรผันทางพันธุกรรม โซมาติก ในเซลล์เดี่ยว^{[ 18 ]}เนื่องจากไม่ไวต่อลูกผสมการอ่านที่นำไปสู่สิ่งประดิษฐ์การเรียก (กล่าวถึงรายละเอียดในส่วนด้านล่าง) และได้รับผลกระทบจากการขาดหายน้อยกว่า การเลือกวิธีการขึ้นอยู่กับเป้าหมายของการจัดลำดับเนื่องจากแต่ละวิธีมีข้อดีที่แตกต่างกัน^{[ 7 ]}

การทำ MDA ของจีโนมเซลล์แต่ละเซลล์ส่งผลให้การครอบคลุมจีโนมไม่สม่ำเสมออย่างมาก กล่าวคือ มีการแสดงผลเกินและต่ำกว่าความเป็นจริงของภูมิภาคต่างๆ ของแม่แบบ ส่งผลให้ลำดับบางส่วนสูญหายไป กระบวนการนี้ประกอบด้วยสองส่วน คือ ก) การขยายมากเกินไปและน้อยเกินไปแบบสุ่มของภูมิภาคแบบสุ่ม และ ข) อคติที่เป็นระบบต่อภูมิภาคที่มี %GC สูง ส่วนประกอบแบบสุ่มอาจแก้ไขได้โดยการรวมปฏิกิริยา MDA ของเซลล์เดี่ยวจากเซลล์ประเภทเดียวกัน โดยใช้การผสมแบบฟลูออเรสเซนต์ในแหล่งกำเนิด (FISH) และ/หรือการยืนยันหลังการจัดลำดับ^{[ 10 ]}อคติของ MDA ต่อภูมิภาคที่มี %GC สูงสามารถแก้ไขได้โดยการใช้พอลิเมอเรสที่ทนความร้อน เช่น ในกระบวนการที่เรียกว่า WGA-X ^{[ 13 ]}

โพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNPs) ซึ่งเป็นส่วนสำคัญของความแปรผันทางพันธุกรรมในจีโนมมนุษย์และความแปรผันของจำนวนสำเนา (CNV) ก่อให้เกิดปัญหาในการลำดับดีเอ็นเอจากเซลล์เดี่ยว เช่นเดียวกับปริมาณดีเอ็นเอที่สกัดได้จากเซลล์เดี่ยวมีจำกัด เนื่องจากปริมาณดีเอ็นเอมีน้อย การวิเคราะห์ดีเอ็นเออย่างแม่นยำจึงเป็นเรื่องยากแม้หลังจากการขยายจำนวนสำเนาแล้ว เนื่องจากความครอบคลุมต่ำและมีโอกาสเกิดข้อผิดพลาดสูง ด้วยวิธี MDA ความครอบคลุมของจีโนมโดยเฉลี่ยต่ำกว่า 80% และ SNPs ที่ไม่ได้รับการครอบคลุมโดยลำดับดีเอ็นเอจะถูกตัดออก นอกจากนี้ MDA ยังแสดงอัตราการสูญหายของอัลลีล สูง คือไม่สามารถตรวจจับอัลลีลจากตัวอย่างเฮเทอโรไซกัสได้ ปัจจุบันมีการใช้อัลกอริทึม SNP หลายแบบ แต่ไม่มีแบบใดที่เฉพาะเจาะจงกับการลำดับดีเอ็นเอจากเซลล์เดี่ยว MDA ร่วมกับ CNV ยังก่อให้เกิดปัญหาในการระบุ CNV ปลอมที่ปกปิด CNV จริง เพื่อแก้ปัญหานี้ เมื่อสามารถสร้างรูปแบบจาก CNV ปลอมได้ อัลกอริทึมสามารถตรวจจับและกำจัดสัญญาณรบกวนนี้เพื่อสร้างตัวแปรที่แท้จริงได้^{[ 19 ]}

Strand-seqเอาชนะข้อจำกัดของวิธีการที่ใช้การขยายจีโนมทั้งหมดสำหรับการเรียกตัวแปรทางพันธุกรรม: เนื่องจาก Strand-seq ไม่ต้องการการอ่าน (หรือคู่การอ่าน) ที่ข้ามขอบเขต (หรือจุดแตกหัก) ของ CNV หรือคลาสตัวแปรโครงสร้างที่สมดุลสำเนา จึงมีความอ่อนไหวต่อสิ่งแปลกปลอมทั่วไปของวิธีการเซลล์เดี่ยวที่ใช้การขยายจีโนมทั้งหมดน้อยกว่า ซึ่งรวมถึงการเรียกตัวแปรที่ขาดหายไปเนื่องจากการอ่านที่จุดแตกหักของตัวแปรและคิเมราของการอ่าน^{[ 7 ] [ 18 ]} Strand-seq ค้นพบสเปกตรัมเต็มรูปแบบของ คลาส การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่มีขนาดอย่างน้อย 200kb รวมถึงวงจรการแตกหัก-การหลอมรวม-สะพานและ เหตุการณ์ โครโมทริปซิสตลอดจนการผกผันที่สมดุล และการย้ายตำแหน่งที่สมดุลหรือไม่สมดุลของจำนวนสำเนา^{[ 18 ]} " การเรียกตัวแปรโครงสร้างที่ทำโดย Strand-seq ได้รับการแก้ไขโดยแฮพลอไทป์ ความยาวโครโมโซม ซึ่งให้ความจำเพาะในการเรียกตัวแปรเพิ่มเติม^{[ 18 ]}ข้อจำกัดในปัจจุบันคือ Strand-seq ต้องการเซลล์ที่กำลังแบ่งตัวเพื่อการติดฉลากเฉพาะสายโดยใช้โบรโมดีออกซีอูริดีน (BrdU) และวิธีนี้ไม่สามารถตรวจจับตัวแปรที่มีขนาดเล็กกว่า 200kb ได้ เช่นการแทรกองค์ประกอบเคลื่อนที่

ไมโครไบโอมเป็นเป้าหมายหลักของจีโนมิกส์ระดับเซลล์เดี่ยว เนื่องจากความยากลำบากในการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ส่วนใหญ่ในสภาพแวดล้อมส่วนใหญ่ จีโนมิกส์ระดับเซลล์เดี่ยวเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการได้ลำดับจีโนมของจุลินทรีย์โดยไม่ต้องเพาะเลี้ยง วิธีการนี้ถูกนำไปประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางกับไมโครไบโอมในทะเล ดิน ใต้พื้นดิน สิ่งมีชีวิต และไมโครไบโอมประเภทอื่นๆ เพื่อตอบคำถามมากมายที่เกี่ยวข้องกับนิเวศวิทยาของจุลินทรีย์วิวัฒนาการ สุขภาพของประชาชน และศักยภาพทางเทคโนโลยีชีวภาพ^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]}

การจัดลำดับมะเร็งยังเป็นการประยุกต์ใช้ scDNAseq ที่กำลังเกิดขึ้นใหม่ เนื้องอกสดหรือแช่แข็งสามารถวิเคราะห์และจัดหมวดหมู่ตาม SCNAs, SNVs และการจัดเรียงใหม่ได้อย่างดีโดยใช้แนวทาง DNAS ของจีโนมทั้งหมด^{[ 29 ]} scDNAseq ของมะเร็งมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการตรวจสอบความซับซ้อนและการกลายพันธุ์แบบผสมที่มีอยู่ในเป้าหมายการรักษาที่ขยาย เช่น ยีนตัวรับไทโรซีนไคเนส (EGFR, PDGFRA เป็นต้น) ซึ่งวิธีการระดับประชากรแบบดั้งเดิมของเนื้องอกโดยรวมไม่สามารถแก้ไขรูปแบบการเกิดร่วมกันของการกลายพันธุ์เหล่านี้ภายในเซลล์เดียวของเนื้องอกได้ การทับซ้อนดังกล่าวอาจทำให้เกิดความซ้ำซ้อนของการกระตุ้นเส้นทางและความต้านทานของเซลล์เนื้องอก

การจัดลำดับเมทิลโลม DNA ของเซลล์เดี่ยวจะวัดปริมาณเมทิลเลชันของ DNAมีเมทิลเลชันหลายประเภทที่ทราบกันดีว่าเกิดขึ้นในธรรมชาติ ได้แก่5-เมทิลไซโตซีน (5mC), 5-ไฮดรอกซีเมทิลไซโตซีน (5hmC), 6-เมทิลอะดีโนซีน (6mA) และ 4-เมทิลไซโตซีน (4mC) ในยูคาริโอต โดยเฉพาะสัตว์ 5mC พบได้ทั่วไปในจีโนมและมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการแสดงออกของยีนโดยการยับยั้งองค์ประกอบที่เคลื่อนย้ายได้ [ ^{31 ] การ}จัดลำดับ 5mC ในเซลล์แต่ละเซลล์สามารถเปิดเผยได้ว่าการเปลี่ยนแปลงทางเอพิเจเนติกส์ในเซลล์ที่มีพันธุกรรมเหมือนกันจากเนื้อเยื่อหรือประชากรเดียวกันทำให้เกิดเซลล์ที่มีฟีโนไทป์ที่แตกต่างกันได้อย่างไร

การจัดลำดับด้วยไบซัลไฟต์ได้กลายเป็นมาตรฐานทองคำในการตรวจจับและจัดลำดับ 5mC ในเซลล์เดี่ยว^{[ 32 ]}การบำบัด DNA ด้วยไบซัลไฟต์จะเปลี่ยนสารตกค้างไซโตซีนเป็นยูราซิล แต่สารตกค้าง 5-เมทิลไซโตซีนจะไม่ได้รับผลกระทบ ดังนั้น DNA ที่ได้รับการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์จึงคงไว้เฉพาะไซโตซีนที่มีเมทิลเท่านั้น เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เมทิลโลม ลำดับที่ได้รับการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์จะถูกจัดเรียงกับจีโนมที่ไม่ได้รับการดัดแปลง การจัดลำดับไบซัลไฟต์ของจีโนมทั้งหมดในเซลล์เดี่ยวประสบความสำเร็จในปี 2014 ^{[ 33 ]}วิธีนี้เอาชนะการสูญเสีย DNA ที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนทั่วไป ซึ่งมีการเพิ่มอะแดปเตอร์การจัดลำดับก่อนการแตกตัวด้วยไบซัลไฟต์ แต่จะเพิ่มอะแดปเตอร์หลังจากที่ DNA ได้รับการบำบัดและแตกตัวด้วยไบซัลไฟต์แล้ว ทำให้สามารถขยายชิ้นส่วนทั้งหมดได้ด้วย PCR ^{[ 34 ]}การใช้การจัดลำดับเชิงลึก วิธีนี้สามารถจับ CpG ได้ประมาณ 40% ของ CpG ทั้งหมดในแต่ละเซลล์ ด้วยเทคโนโลยีที่มีอยู่ DNA ไม่สามารถขยายได้ก่อนการบำบัดด้วยไบซัลไฟต์ เนื่องจากเครื่องหมาย 5mC จะไม่ถูกคัดลอกโดยพอลิเมอเรส

การจัดลำดับบิซัลไฟต์แบบลดการแสดงผลของเซลล์เดี่ยว (scRRBS) เป็นอีกวิธีหนึ่ง^{[ 35 ]}วิธีนี้ใช้ประโยชน์จากแนวโน้มของไซโตซีนที่ถูกเมทิลเลตที่จะรวมกลุ่มกันที่เกาะ CpG (CGIs) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของบริเวณจีโนมที่มีปริมาณ CpG สูง ซึ่งจะช่วยลดต้นทุนการจัดลำดับเมื่อเทียบกับการจัดลำดับบิซัลไฟต์ทั้งจีโนม แต่จำกัดความครอบคลุมของวิธีนี้ เมื่อ ใช้ RRBSกับตัวอย่างจำนวนมาก จะตรวจพบไซต์ CpG ส่วนใหญ่ในโปรโมเตอร์ยีน แต่ไซต์ในโปรโมเตอร์ยีนคิดเป็นเพียง 10% ของไซต์ CpG ในจีโนมทั้งหมด^{[ 36 ]}ในเซลล์เดี่ยว จะตรวจพบไซต์ CpG 40% จากตัวอย่างจำนวนมาก เพื่อเพิ่มความครอบคลุม วิธีนี้ยังสามารถนำไปใช้กับกลุ่มเซลล์เดี่ยวขนาดเล็กได้ ในตัวอย่างเซลล์เดี่ยวที่รวมกัน 20 เซลล์ จะตรวจพบไซต์ CpG 63% จากตัวอย่างจำนวนมาก การรวมเซลล์เดี่ยวเข้าด้วยกันเป็นกลยุทธ์หนึ่งในการเพิ่มความครอบคลุมของเมทิลโลม แต่มีข้อเสียคือการบดบังความหลากหลายในประชากรเซลล์

แม้ว่าการจัดลำดับด้วยไบซัลไฟต์ยังคงเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดสำหรับการตรวจจับ 5mC แต่การบำบัดทางเคมีนั้นรุนแรงและทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยและเสื่อมสภาพ ผลกระทบนี้จะรุนแรงขึ้นเมื่อเปลี่ยนจากตัวอย่างจำนวนมากไปเป็นเซลล์เดี่ยว วิธีการอื่นในการตรวจจับเมทิลเลชั่นของ DNA ได้แก่ เอนไซม์ตัดจำเพาะที่ไวต่อเมทิลเลชั่น เอนไซม์ตัดจำเพาะยังช่วยให้สามารถตรวจจับเมทิลเลชั่นประเภทอื่นได้ เช่น 6mA ด้วย^{DpnI [ 37} ] ^การ จัด^{ลำดับ}โดยใช้นาโนพอเรยังเป็นอีกวิธีหนึ่งสำหรับการจัดลำดับเมทิลเลชั่นโดยตรงโดยไม่ต้องทำให้ DNA เดิมแตกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยหรือดัดแปลง การจัดลำดับนาโนพอเรถูกนำมาใช้ในการจัดลำดับเมทิลโลมของแบคทีเรีย ซึ่งส่วนใหญ่เป็น 6mA และ 4mC (ตรงข้ามกับ 5mC ในยูคาริโอต) แต่เทคนิคนี้ยังไม่ได้รับการปรับขนาดให้ใช้กับเซลล์เดี่ยว^{[ 38 ]}

การลำดับเมทิลเลชัน DNA ของเซลล์เดี่ยวได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อสำรวจความแตกต่างทางเอพิเจเนติกในเซลล์ที่มีพันธุกรรมคล้ายคลึงกัน ในการตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการเหล่านี้ในระหว่างการพัฒนา ข้อมูลเมทิลโลมของเซลล์เดี่ยวของประชากรผสมได้รับการจำแนกประเภทโดยการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นเพื่อระบุประเภทเซลล์ที่แตกต่างกัน^{[ 35 ]}การประยุกต์ใช้อีกอย่างหนึ่งคือการศึกษาเซลล์เดี่ยวในช่วงการแบ่งเซลล์ไม่กี่ครั้งแรกในระยะเริ่มต้นของการพัฒนาเพื่อทำความเข้าใจว่าเซลล์ประเภทต่างๆ เกิดขึ้นจากตัวอ่อนตัวเดียวได้อย่างไร^{[ 39 ]}การลำดับไบซัลไฟต์ของจีโนมทั้งหมดของเซลล์เดี่ยวยังถูกนำมาใช้เพื่อศึกษาเซลล์ประเภทที่หายากแต่มีการทำงานสูงในมะเร็ง เช่น เซลล์มะเร็งที่หมุนเวียน (CTCs) ^{[ 40 ]}

การจัดลำดับโครมาตินที่เข้าถึงได้ด้วยทรานสโพเซสในเซลล์เดี่ยวจะทำแผนที่การเข้าถึงโครมาตินทั่วทั้งจีโนม ทรานสโพเซสจะแทรกอะแดปเตอร์การจัดลำดับเข้าไปในบริเวณเปิดของโครมาตินโดยตรง ทำให้บริเวณเหล่านั้นสามารถขยายและจัดลำดับได้^{[ 41 ]}

วิธีการเตรียมไลบรารีสองวิธีใน scATAC-Seq นั้นใช้หลักการของการจัดทำดัชนีเซลล์แบบแยกกลุ่มและการใช้ไมโครฟลูอิดิกส์

วิธีการมาตรฐาน เช่นไมโครอาร์เรย์และ การวิเคราะห์ RNA-seq แบบกลุ่ม จะวิเคราะห์การแสดงออกของ RNA จากประชากรเซลล์จำนวนมาก การวัดเหล่านี้อาจบดบังความแตกต่างที่สำคัญระหว่างเซลล์แต่ละเซลล์ในประชากรเซลล์ผสม^{[ 42 ] [ 43 ]}

การจัดลำดับ RNA ระดับเซลล์เดี่ยว (scRNA-seq) ให้ข้อมูลโปรไฟล์การแสดงออกของเซลล์แต่ละเซลล์ และถือเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการกำหนดสถานะและฟีโนไทป์ของเซลล์ ณ ปี 2020 ^{[ 44 ]}แม้ว่าจะไม่สามารถได้รับข้อมูลที่สมบูรณ์เกี่ยวกับ RNA ทุกตัวที่แสดงออกโดยแต่ละเซลล์ได้ เนื่องจากมีวัสดุอยู่จำนวนน้อย แต่รูปแบบการแสดงออกของยีนสามารถระบุได้ผ่านการวิเคราะห์การจัดกลุ่มยีน^{[ 45 ]}ซึ่งสามารถเปิดเผยเซลล์ชนิดหายากภายในประชากรเซลล์ที่อาจไม่เคยพบเห็นมาก่อน ตัวอย่างเช่น กลุ่มนักวิทยาศาสตร์กลุ่มหนึ่งที่ทำการ scRNA-seq บนเนื้อเยื่อเนื้องอกของเนื้องอกประสาทได้ระบุเซลล์มะเร็ง pan-neuroblastoma ที่หายาก ซึ่งอาจเป็นที่น่าสนใจสำหรับแนวทางการรักษาแบบใหม่^{[ 46 ]}

โปรโตคอล scRNA-seq ในปัจจุบันเกี่ยวข้องกับการแยกเซลล์เดี่ยวและ RNA ของเซลล์เหล่านั้น จากนั้นจึงทำตามขั้นตอนเดียวกับ bulk RNA-seq ได้แก่การถอดรหัสย้อนกลับ (RT) การขยาย การสร้างไลบรารี และการจัดลำดับ วิธีการในยุคแรกๆ จะแยกเซลล์แต่ละเซลล์ลงในหลุมแยกกัน วิธีการที่ทันสมัยกว่านั้นจะห่อหุ้มเซลล์แต่ละเซลล์ไว้ในหยดของเหลวในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก ซึ่งปฏิกิริยาการถอดรหัสย้อนกลับจะเกิดขึ้น โดยแปลง RNA เป็น cDNA แต่ละหยดจะมี "บาร์โค้ด" DNA ที่ติดฉลาก cDNA ที่ได้จากเซลล์แต่ละเซลล์อย่างเฉพาะเจาะจง เมื่อการถอดรหัสย้อนกลับเสร็จสมบูรณ์แล้ว cDNA จากหลายเซลล์สามารถนำมาผสมกันเพื่อจัดลำดับได้ เนื่องจากทรานสคริปต์จากเซลล์เฉพาะจะถูกระบุด้วยบาร์โค้ดที่ไม่ซ้ำกัน^{[ 47 ] [ 48 ]}

ความท้าทายสำหรับ scRNA-Seq ได้แก่ การรักษาความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์เริ่มต้นของ mRNA ในเซลล์และการระบุทรานสคริปต์ที่หายาก^{[ 49 ]}ขั้นตอนการถอดรหัสย้อนกลับมีความสำคัญอย่างยิ่ง เนื่องจากประสิทธิภาพของปฏิกิริยา RT จะเป็นตัวกำหนดว่าประชากร RNA ของเซลล์จะได้รับการวิเคราะห์โดยซีเควนเซอร์มากน้อยเพียงใดกระบวนการทำงานของเอนไซม์ถอดรหัสย้อนกลับและกลยุทธ์การไพรเมอร์ที่ใช้อาจส่งผลต่อการผลิต cDNA แบบเต็มความยาวและการสร้างไลบรารีที่เอนเอียงไปทางปลาย 3' หรือ 5' ของยีน

ในขั้นตอนการขยายสัญญาณ ปัจจุบันมีการใช้ PCR หรือการถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) เพื่อขยาย cDNA ข้อดีอย่างหนึ่งของวิธีการที่ใช้ PCR คือความสามารถในการสร้าง cDNA ที่มีความยาวเต็ม อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพ PCR ที่แตกต่างกันในลำดับเฉพาะ (เช่น ปริมาณ GC และโครงสร้าง snapback) อาจถูกขยายสัญญาณแบบทวีคูณ ทำให้เกิดไลบรารีที่มีความครอบคลุมไม่สม่ำเสมอ ในทางกลับกัน แม้ว่าไลบรารีที่สร้างโดย IVT จะสามารถหลีกเลี่ยงอคติของลำดับที่เกิดจาก PCR ได้ แต่ลำดับเฉพาะอาจถูกถอดรหัสอย่างไม่มีประสิทธิภาพ ทำให้เกิดการสูญหายของลำดับหรือสร้างลำดับที่ไม่สมบูรณ์^{[ 1 ] [ 42 ]} มีการเผยแพร่โปรโตคอล scRNA-seq หลายรายการ ได้แก่ Tang et al., ^{[ 50 ]} STRT, ^{[ 51 ]} SMART-seq, ^{[ 52 ]} SORT-seq, ^{[ 53 ]} CEL-seq, ^{[ 54 ]} RAGE-seq, ^{[ 55 ]} Quartz-seq ^{[ 56 ]} และ C1-CAGE ^{[ 57 ]}โปรโตคอลเหล่านี้แตกต่างกันในแง่ของกลยุทธ์สำหรับการถอดรหัสย้อนกลับ การสังเคราะห์และการขยาย cDNA และความเป็นไปได้ในการรองรับบาร์โค้ดเฉพาะลำดับ (เช่นUMI ) หรือความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างแบบรวม^{[ 58 ]}

ในปี 2017 มีการนำวิธีการสองวิธีมาใช้เพื่อวัดการแสดงออกของ mRNA และโปรตีนในเซลล์เดี่ยวพร้อมกันโดยใช้แอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยโอลิโกนิวคลีโอไทด์ ซึ่งรู้จักกันในชื่อ REAP-seq ^{[ 59 ]}และ CITE-seq ^{[ 60 ]} การรวบรวมเนื้อหาของเซลล์หลังจากการบันทึกทางสรีรวิทยาไฟฟ้าโดยใช้แพทช์แคลมป์ยังช่วยให้สามารถพัฒนา วิธีการ Patch-Seqซึ่งกำลังได้รับความนิยมมากขึ้นเรื่อยๆ ในด้านประสาทวิทยาศาสตร์^{[ 61 ]}

แพลตฟอร์มการจัดลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยวนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ทรานสคริปโตมแบบเซลล์ต่อเซลล์ได้โดยใช้การแบ่งส่วนไมโครฟลูอิดิกเพื่อจับเซลล์เดี่ยวและเตรียมไลบรารี cDNA สำหรับการจัดลำดับรุ่นต่อไป ( NGS) ^{[ 62 ]}แพลตฟอร์มแบบหยดน้ำช่วยให้สามารถจัดลำดับ mRNA แบบขนานจำนวนมากในเซลล์แต่ละเซลล์จำนวนมากได้โดยการจับเซลล์เดี่ยวในหยดน้ำมัน^{[ 63 ]}

โดยรวมแล้ว ในขั้นตอนแรก เซลล์แต่ละเซลล์จะถูกจับแยกกันและสลาย จากนั้นจะทำการถอดรหัสย้อนกลับ (RT) ของmRNA และจะได้ไลบรารี cDNA เพื่อเลือก mRNA จะทำ RT โดยใช้ ไพรเมอร์ดีออกซีไทมีน (oligo dT) ลำดับสายเดี่ยวซึ่งจับกับหางโพลี(A) ของโมเลกุล mRNA โดยเฉพาะ ต่อมา ไลบรารี cDNA ที่ขยายแล้วจะถูกนำไปใช้ในการจัดลำดับ^{[ 64 ]}

ดังนั้น ขั้นตอนแรกของวิธีการคือการห่อหุ้มเซลล์เดี่ยวและการเตรียมไลบรารี เซลล์จะถูกห่อหุ้มลงในเจลบีดส์ในอิมัลชัน (GEMs) ด้วยเครื่องอัตโนมัติ ในการสร้างเวสิเคิลเหล่านี้ เครื่องอัตโนมัติจะใช้ชิปไมโครฟลูอิดิกและรวมส่วนประกอบทั้งหมดเข้ากับน้ำมัน GEM ที่ใช้งานได้แต่ละอันประกอบด้วยเซลล์เดี่ยว เจลบีดเดี่ยว และรีเอเจนต์ RT บนเจลบีด โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ประกอบด้วยส่วนที่แตกต่างกัน 4 ส่วนจะถูกผูกไว้ ได้แก่ไพรเมอร์ PCR (จำเป็นสำหรับการจัดลำดับ) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่มีบาร์โค้ด 10X ลำดับ Unique Molecular Identifier (UMI) และลำดับ PolydT (ที่ช่วยให้สามารถจับ โมเลกุล mRNA ที่มีโพลีอะดีนิเลตได้ ) ^{[ 65 ]} ภายในเวสิเคิลปฏิกิริยา GEM แต่ละอัน เซลล์เดี่ยวจะถูกทำลายและเกิดการถอดรหัสย้อนกลับ cDNA จากเซลล์เดียวกันจะถูกระบุด้วยบาร์โค้ด 10X ทั่วไป นอกจากนี้ จำนวน UMI ยังแสดงถึงระดับการแสดงออกของยีน และการวิเคราะห์ยังช่วยให้สามารถตรวจจับยีนที่มีความแปรปรวนสูงได้ ข้อมูลเหล่านี้มักใช้สำหรับการจำแนกประเภทฟีโนไทป์ของเซลล์หรือการระบุประชากรย่อยใหม่^{[ 66 ]}

ขั้นตอนสุดท้ายของแพลตฟอร์มคือการจัดลำดับ ไลบรารีที่สร้างขึ้นสามารถนำไปใช้โดยตรงสำหรับการจัดลำดับทรานสคริปต์ทั้งหมดของเซลล์เดี่ยวหรือเวิร์กโฟลว์การจัดลำดับเป้าหมาย การจัดลำดับจะดำเนินการโดยใช้ วิธี การจัดลำดับสีย้อมของ Illuminaวิธีการจัดลำดับนี้อิงตามหลักการจัดลำดับโดยการสังเคราะห์ (SBS) และการใช้ตัวหยุดสีย้อมแบบย้อนกลับได้ ซึ่งช่วยให้สามารถระบุแต่ละนิวคลีโอไทด์เดี่ยวได้ ในการอ่านลำดับทรานสคริปต์ที่ปลายด้านหนึ่ง และบาร์โค้ดและ UMI ที่ปลายอีกด้านหนึ่ง จำเป็นต้องใช้เครื่องอ่านการจัดลำดับแบบคู่ปลาย^{[ 67 ]}

แพลตฟอร์มแบบหยดช่วยให้สามารถตรวจจับเซลล์ชนิดหายากได้เนื่องจากมีประสิทธิภาพสูง ในความเป็นจริง สามารถจับเซลล์ได้ 500 ถึง 20,000 เซลล์ต่อตัวอย่างจากสารละลายเซลล์เพียงตัวเดียว โปรโตคอลดำเนินการได้ง่ายและให้ผลลัพธ์การกู้คืนเซลล์สูงถึง 65% กระบวนการทำงานโดยรวมของแพลตฟอร์มแบบหยดใช้เวลา 8 ชั่วโมง ซึ่งเร็วกว่าวิธีการแบบไมโครเวลล์ (BD Rhapsody) ที่ใช้เวลา 10 ชั่วโมง อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มีข้อจำกัดบางประการ เช่น ความจำเป็นต้องใช้ตัวอย่างสด และการตรวจจับ mRNA ในขั้นสุดท้ายทำได้เพียง 10% เท่านั้น

ความแตกต่างหลักระหว่างวิธีการแบบหยดและวิธีการแบบไมโครเวลล์คือเทคนิคที่ใช้ในการแบ่งเซลล์^{[ 64 ]}

วิธีการ RNA-seq ส่วนใหญ่อาศัย การจับ หาง poly(A)เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของ mRNA และลด rRNA ที่มีปริมาณมากและไม่ให้ข้อมูล ดังนั้นจึงมักจำกัดอยู่เฉพาะการจัดลำดับโมเลกุล mRNA ที่มี polyadenylated เท่านั้น อย่างไรก็ตาม การศึกษาล่าสุดเริ่มตระหนักถึงความสำคัญของ RNA ที่ไม่มี poly(A) เช่น long-noncoding RNA และ microRNA ในการควบคุมการแสดงออกของยีน Small-seq เป็นวิธีการในเซลล์เดียวที่จับ RNA ขนาดเล็ก (<300 นิวคลีโอไทด์) เช่น microRNA ชิ้นส่วนของ tRNA และ small nucleolar RNA ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 68 ]}วิธีนี้ใช้การผสมผสานระหว่าง "หน้ากากโอลิโกนิวคลีโอไทด์" (ที่ยับยั้งการจับโมเลกุล 5.8S rRNA ที่มีปริมาณมาก) และการเลือกขนาดเพื่อแยก RNA ขนาดใหญ่ เช่น โมเลกุล rRNA ที่มีปริมาณมากอื่นๆ ออกไป เพื่อกำหนดเป้าหมาย RNA ที่ไม่ใช่ poly(A) ขนาดใหญ่ เช่น mRNA ที่ไม่ใช่รหัสยาว, mRNA ของฮิสโตน, RNA วงกลม และ RNA ตัวเร่งปฏิกิริยา การเลือกขนาดไม่สามารถใช้ได้สำหรับการลดจำนวนโมเลกุล RNA ไรโบโซมที่มีปริมาณมาก (18S และ 28s rRNA) ^{[ 69 ]} RamDA-Seq ในเซลล์เดียวเป็นวิธีการที่บรรลุเป้าหมายนี้โดยการทำการถอดรหัสย้อนกลับด้วยไพรเมอร์แบบสุ่ม (การขยายการแทนที่แบบสุ่ม) ในการมีอยู่ของไพรเมอร์ "ไม่สุ่มมากนัก" (NSR) ที่ออกแบบมาโดยเฉพาะเพื่อหลีกเลี่ยงการไพรเมอร์บนโมเลกุล rRNA ^{[ 70 ]}แม้ว่าวิธีการนี้จะสามารถจับทรานสคริปต์ RNA ทั้งหมดแบบเต็มความยาวสำหรับการจัดลำดับและตรวจจับ RNA ที่ไม่ใช่ poly(A) ได้หลากหลายชนิดด้วยความไวสูง แต่ก็มีข้อจำกัดบางประการ ไพรเมอร์ NSR ได้รับการออกแบบอย่างระมัดระวังตามลำดับ rRNA ในสิ่งมีชีวิตเฉพาะ (หนู) และการออกแบบชุดไพรเมอร์ใหม่สำหรับสายพันธุ์อื่นจะต้องใช้ความพยายามอย่างมาก เมื่อเร็วๆ นี้ วิธีการที่ใช้ CRISPR ชื่อ scDASH (การลดจำนวนลำดับที่มีมากในเซลล์เดียวโดยการไฮบริดไดเซชัน) ได้แสดงให้เห็นถึงแนวทางอีกทางหนึ่งในการลดจำนวนลำดับ rRNA จากไลบรารี RNA-seq รวมของเซลล์เดียว^{[ 71 ]}

ปัจจุบันแบคทีเรียและโปรคาริโอตอื่นๆ ยังไม่เหมาะสมกับการทำ RNA-seq ระดับเซลล์เดี่ยว เนื่องจากขาด mRNA ที่มีโพลีอะดีนิเลต ดังนั้น การพัฒนาวิธีการ RNA-seq ระดับเซลล์เดี่ยวที่ไม่ขึ้นอยู่กับการจับหางโพลี(A) จะเป็นเครื่องมือสำคัญในการทำให้การศึกษาไมโครไบโอมมีความละเอียดระดับเซลล์เดี่ยว การศึกษาแบคทีเรียแบบรวมมักใช้การกำจัด rRNA ทั่วไปเพื่อเอาชนะปัญหาการขาด mRNA ที่มีโพลีอะดีนิเลตในแบคทีเรีย แต่ในระดับเซลล์เดี่ยว ปริมาณ RNA ทั้งหมดที่พบในเซลล์เดียวนั้นน้อยเกินไป^{[ 69 ]}การขาด mRNA ที่มีโพลีอะดีนิเลตและความขาดแคลนของ RNA ทั้งหมดที่พบในเซลล์แบคทีเรียเดี่ยวเป็นอุปสรรคสำคัญสองประการที่จำกัดการใช้งาน scRNA-seq ในแบคทีเรีย

ข้อจำกัดเนื่องจากการสุ่มตัวอย่าง scRNA-seq ที่ไม่สมบูรณ์และมีอคติเกิดขึ้นเนื่องจาก scRNA-seq จับได้เพียงภาพรวมของกิจกรรมของเซลล์เท่านั้น ตัวอย่างเช่น ในเซลล์ขนาดใหญ่ที่มีกิ่งก้านสาขามากมาย เช่นเซลล์ประสาทการแยกเซลล์เดี่ยวจะจับได้เฉพาะ RNA จากส่วนกลางของเซลล์ที่แยกออกจากกระบวนการระหว่างการบด ในสมองคาดว่ามากกว่า 40% ของ RNA ทั้งหมดอยู่ในกระบวนการของเซลล์ เช่นแอกซอนเดนไดรต์ปลายเท้าของแอ สโทรไซต์ และด้วยเหตุนี้จึงมองไม่เห็นด้วยวิธีการ scRNA-seq ^{[ 72 ]}

scRNA-Seq กำลังถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในสาขาชีววิทยาต่างๆ รวมถึง^{ชีววิทยา}พัฒนาการ [ ^{73 ]}ประสาทวิทยา [ ^{74 ] เนื้องอก}วิทยา[ ^{75 ] [ 76 ] [ 77 ] ภูมิคุ้มกัน}วิทยา [ ^{78 ] [ 79 ] [ 80 ]}การวิจัยเกี่ยวกับหัวใจและ^{หลอดเลือด[ 81 ] [ 82 ] โรคสมอง} [ 83 ^{] และ}โรคติดเชื้อ^{[ 84 ] [ 85 ]}

การใช้ วิธี การเรียนรู้ของเครื่องข้อมูลจาก bulk RNA-Seq ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนใน scRNA-Seq โดยเฉพาะอย่างยิ่ง นักวิทยาศาสตร์ได้ใช้โปรไฟล์การแสดงออกของยีนจาก ชุดข้อมูล มะเร็งหลายชนิดเพื่อสร้างเครือข่ายการแสดงออกร่วมกันจากนั้นจึงนำเครือข่ายเหล่านี้ไปใช้กับโปรไฟล์การแสดงออกของยีนในเซลล์เดี่ยว ทำให้ได้วิธีการที่แข็งแกร่งยิ่งขึ้นในการตรวจจับการกลายพันธุ์ในเซลล์แต่ละเซลล์โดยใช้ระดับการถอดรหัส^{[ 86 ]}

วิธีการ scRNA-seq บางวิธีได้ถูกนำไปใช้กับจุลินทรีย์เซลล์เดียวด้วยเช่นกัน SMART-seq2 ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์จุลินทรีย์ยูคาริโอตเซลล์เดียว แต่เนื่องจากต้องอาศัยการจับหางโพลี(A) จึงไม่ได้นำมาใช้กับเซลล์โปรคาริโอต^{[ 87 ]}วิธีการไมโครฟลูอิดิก เช่น Drop-seq และอุปกรณ์ Fluidigm IFC-C1 ถูกนำมาใช้ในการจัดลำดับปรสิตมาลาเรียเซลล์เดียวหรือเซลล์ยีสต์เซลล์เดียว^{[ 88 ] [ 89 ]}การศึกษาเซลล์ยีสต์เซลล์เดียวมุ่งเน้นที่จะศึกษาลักษณะความทนทานต่อความเครียดที่แตกต่างกันในเซลล์ยีสต์ไอโซจีนิกก่อนและหลังที่ยีสต์สัมผัสกับความเครียดจากเกลือ การวิเคราะห์เซลล์เดียวของปัจจัยการถอดรหัสหลายตัวโดย scRNA-seq เผยให้เห็นความแตกต่างในประชากร ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการควบคุมแตกต่างกันไปในหมู่สมาชิกของประชากรเพื่อเพิ่มโอกาสในการอยู่รอดสำหรับส่วนหนึ่งของประชากร

การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมของเซลล์เดี่ยวครั้งแรกในสปีชีส์โปรคาริโอตสำเร็จโดยใช้เอนไซม์เทอร์มิเนเตอร์เอ็กโซนิวคลีเอสเพื่อย่อยสลาย rRNA อย่างเลือกสรร และการขยายแบบวงกลม (RCA) ของ mRNA ^{[ 90 ]}ในวิธีนี้ ปลายของ DNA สายเดี่ยวจะถูกเชื่อมต่อเข้าด้วยกันเพื่อสร้างวงกลม และลูปที่ได้จะถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการขยาย RNA แบบเส้นตรง จากนั้นไลบรารีผลิตภัณฑ์สุดท้ายจะถูกวิเคราะห์โดยไมโครอาร์เรย์ โดยมีอคติต่ำและครอบคลุมดี อย่างไรก็ตาม RCA ยังไม่ได้รับการทดสอบกับ RNA-seq ซึ่งโดยทั่วไปจะใช้การจัดลำดับรุ่นต่อไป RNA-seq ของเซลล์เดี่ยวสำหรับแบคทีเรียจะมีประโยชน์อย่างมากสำหรับการศึกษาไมโครไบโอม มันจะช่วยแก้ไขปัญหาที่พบในวิธีการเมตาทรานสคริปโตมิกส์แบบดั้งเดิม เช่น การไม่สามารถจับสปีชีส์ที่มีอยู่จำนวนน้อย และการไม่สามารถแก้ไขความแตกต่างระหว่างประชากรเซลล์ได้

^{scRNA-Seq ได้ให้ข้อมูลเชิงลึกมากมายเกี่ยวกับการพัฒนา ของ}ตัวอ่อนและสิ่งมีชีวิต รวมถึงหนอนCaenorhabditis elegans [ ^{91 ]}และแพลนารียาที่สามารถสร้างใหม่ได้Schmidtea mediterranea ^{[ 92 ] [ 93 ]}และซาลาแมนเดอร์Ambystoma mexicanum ^{[ 94 ] [ 95} ] สัตว์มีกระดูกสันหลังกลุ่มแรกที่ได้รับการทำแผนที่ด้วยวิธีนี้คือปลาซีบร้า^{[ 96 ] [ 97 ] [ 98 ]}และ^กบ Xenopus laevis [ ^{99 ] ใน}แต่ละกรณีมีการศึกษาตัวอ่อนหลายระยะ ทำให้สามารถทำแผนที่กระบวนการพัฒนาทั้งหมดได้ในระดับเซลล์ต่อเซลล์ วารสารScienceได้ยกย่องความก้าวหน้าเหล่านี้ให้เป็นความก้าวหน้าแห่งปี 2018 ^{[ 100 ]}

มีการสร้างแผนที่เซลล์โมเลกุลของอัณฑะหนูเพื่อกำหนดความเป็นพิษของอัณฑะก่อนวัยเจริญพันธุ์ที่เกิดจาก BDE47 โดยใช้แนวทาง ScRNA-seq ซึ่งให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกลไกและเส้นทางพื้นฐานที่เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของอัณฑะที่เกี่ยวข้องกับ BDE47 ที่ความละเอียดระดับเซลล์เดียว^{[ 101 ]}

มีหลายวิธีในการแยกเซลล์แต่ละเซลล์ก่อนการขยายและลำดับจีโนมทั้งหมด การคัดแยกเซลล์ด้วยการกระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนซ์ (FACS) เป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย นอกจากนี้ยังสามารถเก็บเซลล์แต่ละเซลล์ได้ด้วยการจัดการระดับจุลภาค เช่น การเจือจางแบบอนุกรม หรือการใช้ปิเปตแบบแพทช์หรือนาโนทิวบ์เพื่อเก็บเกี่ยวเซลล์เดี่ยว^{[ 15 ] [ 102 ]} ข้อดีของการจัดการระดับจุลภาคคือความง่ายและต้นทุนต่ำ แต่ต้องใช้แรงงานมากและเสี่ยงต่อการระบุชนิดของเซลล์ผิดพลาดภายใต้กล้องจุลทรรศน์การตัดแยกเซลล์ด้วยเลเซอร์ (LCM) ก็สามารถใช้ในการเก็บเซลล์เดี่ยวได้เช่นกัน แม้ว่า LCM จะรักษาความรู้เกี่ยวกับตำแหน่งเชิงพื้นที่ของเซลล์ที่สุ่มตัวอย่างภายในเนื้อเยื่อ แต่ก็ยากที่จะจับเซลล์เดี่ยวทั้งหมดโดยไม่เก็บวัสดุจากเซลล์ข้างเคียงด้วย^{[ 42 ] [ 103 ] [ 104 ]}วิธีการที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับการแยกเซลล์เดี่ยวยังรวมถึงไมโครฟลูอิดิกส์ด้วย ทั้ง FACS และไมโครฟลูอิดิกส์มีความแม่นยำ อัตโนมัติ และสามารถแยกตัวอย่างที่ไม่ลำเอียงได้ อย่างไรก็ตาม ทั้งสองวิธีจำเป็นต้องแยกเซลล์ออกจากสภาพแวดล้อมขนาดเล็กก่อน ซึ่งทำให้เกิดการรบกวนต่อโปรไฟล์การถอดรหัสในการวิเคราะห์การแสดงออกของ RNA ^{[ 105 ] [ 106 ]}

โปรโตคอล RNA-Seq ของเซลล์เดี่ยวมีความแตกต่างกันในด้านประสิทธิภาพการจับ RNA ซึ่งส่งผลให้จำนวนทรานสคริปต์ที่สร้างจากแต่ละเซลล์เดี่ยวแตกต่างกัน ไลบรารีของเซลล์เดี่ยวมักจะถูกจัดลำดับที่ความลึก 1,000,000 รีด เนื่องจากยีนส่วนใหญ่สามารถตรวจพบได้ด้วย 500,000 รีด^{[ 107 ]}การเพิ่มจำนวนเซลล์และลดความลึกของการอ่านจะเพิ่มประสิทธิภาพในการระบุประชากรเซลล์หลัก อย่างไรก็ตาม ความลึกของการอ่านที่ต่ำอาจไม่ให้ข้อมูลที่จำเป็นเกี่ยวกับยีนเสมอไป และความแตกต่างในการแสดงออกของยีนระหว่างประชากรเซลล์ขึ้นอยู่กับความเสถียรและการตรวจจับโมเลกุล mRNA

ตัวแปรควบคุมคุณภาพทำหน้าที่เป็นกลยุทธ์ในการวิเคราะห์จำนวนเซลล์ ตัวแปรเหล่านี้ส่วนใหญ่ประกอบด้วยการกรองตามความลึกของการนับ จำนวนยีน และสัดส่วนของการนับจากยีนไมโทคอนเดรีย ซึ่งนำไปสู่การตีความสัญญาณของเซลล์

• การจัดลำดับดีเอ็นเอ
• แผนที่เซลล์มนุษย์
• แผนที่เซลล์โรค
• การวิเคราะห์เซลล์เดี่ยว
• เอพิเจโนมิกส์ระดับเซลล์เดี่ยว
• ทรานสคริปโตมิกส์ระดับเซลล์เดี่ยว
• การบูรณาการข้อมูลหลายโอไมซ์ระดับเซลล์เดี่ยว
• ทีซีอาร์-ซีเค
• การจัดลำดับจีโนมทั้งหมด

• "ชุดเครื่องมือ Seurat R สำหรับจีโนมิกส์ระดับเซลล์เดี่ยว "