การโคลนนิ่งย่อย
ในชีววิทยาระดับโมเลกุลการโคลนนิ่งย่อยเป็นเทคนิคที่ใช้ในการย้ายลำดับดีเอ็นเอเฉพาะจากเวกเตอร์ต้นแบบไปยัง เวก เตอร์ปลายทาง
การโคลนนิ่งย่อย (Subcloning) ไม่ควรสับสนกับการโคลนนิ่งระดับโมเลกุล (Molecular cloning ) ซึ่งเป็นเทคนิคที่เกี่ยวข้อง
ขั้นตอน
เอนไซม์ตัดจำเพาะใช้ในการตัดยีนที่สนใจ ( ส่วนแทรก ) ออกจากยีนต้นแบบ จากนั้นจึงทำการทำให้บริสุทธิ์ส่วนแทรกเพื่อแยกออกจากโมเลกุล DNA อื่นๆ วิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่นิยมใช้คือการแยกด้วยเจล จากนั้นจึงทำการเพิ่มจำนวนสำเนาของยีนโดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR)
ในขณะเดียวกัน ก็มีการใช้ เอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกันในการย่อย (ตัด) เวกเตอร์เป้าหมาย แนวคิดเบื้องหลังการใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกันก็คือ เพื่อสร้างปลายเหนียวที่เข้ากันได้ ซึ่งจะช่วยอำนวยความสะดวกในการเชื่อมต่อในภายหลัง นอกจากนี้ยังมีการเติม ฟอสฟาเทสซึ่งโดยทั่วไปคืออัลคาไลน์ฟอสฟาเทสจากลำไส้ลูกวัว (CIAP) เพื่อป้องกันการเชื่อมต่อตัวเองของเวกเตอร์เป้าหมาย เวกเตอร์เป้าหมายที่ถูกย่อยแล้วจะถูกแยก/ทำให้บริสุทธิ์
จากนั้นจะนำอินเสิร์ตและเวกเตอร์ปลายทางมาผสมกันโดยใช้ DNA ligase อัตราส่วนโมลทั่วไปของยีนอินเสิร์ตต่อเวกเตอร์ปลายทางคือ 3:1 [ 1 ]โดยการเพิ่มความเข้มข้นของอินเสิร์ต การเชื่อมต่อตัวเองจะลดลงอีก หลังจากปล่อยให้ส่วนผสมของปฏิกิริยาตั้งทิ้งไว้เป็นระยะเวลาหนึ่งที่อุณหภูมิเฉพาะ (ขึ้นอยู่กับขนาดของสายที่กำลังเชื่อมต่อ สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม โปรดดูDNA ligase ) อินเสิร์ตควรจะถูกรวมเข้ากับพลาสมิดปลายทาง ได้สำเร็จ
การขยายพลาสมิดของผลิตภัณฑ์
โดยทั่วไปแล้ว พลาสมิดจะถูกถ่ายโอนเข้าไปในแบคทีเรียเช่นอี . โคไล ในอุดมคติแล้ว เมื่อแบคทีเรียแบ่งตัวพลาสมิดก็ควรจะถูกจำลองแบบไปด้วย ในกรณีที่ดีที่สุด เซลล์แบคทีเรียแต่ละเซลล์ควรมีพลาสมิดหลายสำเนา หลังจากที่แบคทีเรียเจริญเติบโตได้จำนวนมากแล้ว ก็สามารถทำการสกัดดีเอ็นเอพลาสมิดโดยใช้กรรมวิธีมินิ เพรปปิ้งได้
การคัดเลือก
เพื่อให้แน่ใจว่าจะมีเฉพาะแบคทีเรียที่ได้รับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม (ซึ่งมีพลาสมิดที่ต้องการเก็บเกี่ยว) เท่านั้นที่จะเจริญเติบโต จึง มีการใช้ ยีนเครื่องหมายในเวกเตอร์เป้าหมายสำหรับการคัดเลือก โดย ทั่วไปแล้วยีนเครื่องหมายจะใช้สำหรับการต้านทานยาปฏิชีวนะหรือการสังเคราะห์ สารอาหาร ตัวอย่างเช่น "ยีนเครื่องหมาย" อาจเป็นยีนสำหรับการต้านทานยาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน หากแบคทีเรียที่ควรจะได้รับพลาสมิดที่ต้องการได้รับยีนที่ต้องการด้วยแล้ว แบคทีเรียเหล่านั้นก็จะมี "ยีนเครื่องหมาย" อยู่ด้วย ดังนั้นแบคทีเรียที่ได้รับพลาสมิดจะสามารถเจริญเติบโตได้ในแอมพิซิลลิน ในขณะที่แบคทีเรียที่ไม่ได้รับพลาสมิดที่ต้องการจะยังคงอ่อนแอและถูกทำลายได้ด้วยแอมพิซิลลิน ด้วยเหตุนี้ แบคทีเรียที่ได้รับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมสำเร็จจึงจะถูก "คัดเลือก"
ตัวอย่างกรณี: การโคลนนิ่งพลาสมิดของแบคทีเรีย
ในตัวอย่างนี้ ยีนจากคลังยีนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจะถูกโคลนย่อยลงในพลาสมิดของแบคทีเรีย (แพลตฟอร์มปลายทาง) พลาสมิดของแบคทีเรียเป็นชิ้นส่วนของดีเอ็นเอรูปวงกลมซึ่งมีองค์ประกอบควบคุมที่ช่วยให้แบคทีเรียสามารถผลิตผลิตภัณฑ์ของยีน ( การแสดงออกของยีน ) ได้หากวางไว้ในตำแหน่งที่ถูกต้องในพลาสมิด บริเวณที่ผลิตยีนนั้นถูกล้อมรอบด้วยตำแหน่งตัดของเอนไซม์จำกัดสองตำแหน่ง "A" และ "B" ซึ่งมีปลายเหนียวที่ไม่เข้ากัน
ดีเอ็นเอของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไม่มีตำแหน่งตัดจำเพาะเหล่านี้ ดังนั้นจึงต้องสร้างขึ้นโดยใช้เทคนิค PCR แบบต่อขยายส่วนที่ทับซ้อนกันไพรเมอร์ถูกออกแบบมาเพื่อวางตำแหน่งตัดจำเพาะอย่างระมัดระวัง เพื่อให้การเข้ารหัสโปรตีนอยู่ในเฟรมที่ถูกต้อง และมีการเพิ่มกรดอะมิโนส่วนเกินน้อยที่สุดในแต่ละด้านของโปรตีน
ทั้งผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีจีนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมพร้อมไซต์ตัดจำเพาะใหม่ และพลาสมิดเป้าหมาย จะถูกนำไปย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ และผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยจะถูกทำให้บริสุทธิ์โดย การแยกด้วย เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส
ผลิตภัณฑ์จากการย่อยด้วยเอนไซม์ ซึ่งตอนนี้มีปลายเหนียวที่เข้ากันได้ซึ่งกันและกัน (แต่มีปลายเหนียวที่ไม่เข้ากันกับตัวเอง) จะถูกนำไปเชื่อมต่อกัน ทำให้เกิดพลาสมิดใหม่ซึ่งมีองค์ประกอบพื้นฐานของพลาสมิดเดิมพร้อมกับชิ้นส่วนแทรกที่แตกต่างกัน
พลาสมิดถูกถ่ายโอนเข้าไปในแบคทีเรีย และยืนยันเอกลักษณ์ของส่วนที่แทรกเข้าไปโดยการลำดับดีเอ็นเอ