การคัดกรองทางพันธุกรรมหรือการคัดกรองการกลายพันธุ์ เป็นเทคนิคการทดลองที่ใช้ในการระบุและคัดเลือกบุคคลที่มีฟีโนไทป์ที่น่าสนใจในประชากรที่ได้รับการกลายพันธุ์^{[ 1 ]} ดังนั้น การคัดกรองทางพันธุกรรมจึงเป็นประเภทหนึ่งของการคัดกรองฟีโนไทป์ การคัดกรองทางพันธุกรรมสามารถให้ข้อมูลที่สำคัญเกี่ยวกับ หน้าที่ ของยีนตลอดจนเหตุการณ์ระดับโมเลกุลที่เป็นพื้นฐานของกระบวนการหรือวิถีทางชีวภาพ ในขณะที่โครงการจีโนมได้ระบุรายการยีนจำนวนมากในสิ่งมีชีวิตที่แตกต่างกันหลายชนิด การคัดกรองทางพันธุกรรมสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีค่าเกี่ยวกับวิธีการทำงานของยีนเหล่านั้นได้^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

พันธุศาสตร์แบบไปข้างหน้า (หรือการคัดกรองทางพันธุกรรมแบบไปข้างหน้า) เริ่มต้นด้วยฟีโนไทป์ จากนั้นพยายามระบุการกลายพันธุ์ที่เป็นสาเหตุและยีนที่รับผิดชอบต่อฟีโนไทป์นั้น ตัวอย่างเช่น การคัดกรองที่มีชื่อเสียงโดย Christiane Nüsslein-Volhardและ Eric Wieschausได้ทำการกลายพันธุ์แมลงวันผลไม้ จากนั้นจึงเริ่มค้นหายีนที่ทำให้เกิดฟีโนไทป์กลายพันธุ์ที่สังเกตได้ ^{[ 7 ]}

การคัดกรองทางพันธุกรรมแบบไปข้างหน้าที่ประสบความสำเร็จมักต้องการพื้นฐานทางพันธุกรรมที่กำหนดไว้และขั้นตอนการทดลองที่ง่าย กล่าวคือ เมื่อมีการทำให้บุคคลหลายคนกลายพันธุ์ พวกเขาควรมีพันธุกรรมเหมือนกัน เพื่อให้ฟีโนไทป์แบบป่าเหมือนกันด้วย และฟีโนไทป์กลายพันธุ์จะระบุได้ง่ายขึ้น วิธีการคัดกรองที่ง่ายช่วยให้สามารถคัดกรองบุคคลจำนวนมากขึ้น ซึ่งจะเพิ่มโอกาสในการสร้างและระบุตัวกลายพันธุ์ที่น่าสนใจ^{[ 3 ]}

เนื่องจาก การกลายพันธุ์ ของอัลลีล ตามธรรมชาติ เกิดขึ้นได้ยาก ก่อนการคัดกรอง นักพันธุศาสตร์มักจะทำให้ประชากรเกิดการกลายพันธุ์โดยการให้บุคคลสัมผัสกับสารก่อกลายพันธุ์ ที่ทราบ เช่น สารเคมีหรือรังสี ซึ่งทำให้เกิดการกลายพันธุ์ของโครโมโซมใน ความถี่ที่สูงขึ้นมาก ^{[ 1 ]} ในสิ่งมีชีวิตบางชนิดสารก่อกลายพันธุ์ถูกนำมาใช้เพื่อทำการคัดกรองแบบอิ่มตัวนั่นคือ การคัดกรองที่ใช้เพื่อค้นหา ยีน ทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับฟีโนไทป์เฉพาะChristiane Nüsslein-VolhardและEric Wieschausเป็นบุคคลแรกที่ทำการคัดกรองประเภทนี้ในสัตว์^{[ 8 ]}

พันธุศาสตร์ย้อนกลับ (หรือการคัดกรองพันธุศาสตร์ย้อนกลับ) เริ่มต้นด้วยยีนที่ทราบแล้ว และทดสอบผลกระทบของการรบกวนยีนนั้นโดยการวิเคราะห์ฟีโนไทป์ที่เกิดขึ้น ตัวอย่างเช่น ในการคัดกรองแบบน็อคเอาต์ ยีนหนึ่งหรือมากกว่านั้นจะถูกลบออกอย่างสมบูรณ์ และตัวกลายพันธุ์จากการลบจะถูกทดสอบฟีโนไทป์ การคัดกรองดังกล่าวได้ดำเนินการกับยีนทั้งหมดในแบคทีเรียหลายชนิดและแม้แต่สิ่งมีชีวิตที่ซับซ้อน เช่น C. elegans [ ^{1 ] การ}คัดกรองพันธุศาสตร์ย้อนกลับโดยทั่วไปเริ่มต้นด้วยลำดับยีนตามด้วยการทำให้ไม่ทำงานแบบกำหนดเป้าหมาย ^{[ 9 ]}นอกจากนี้ยังกระตุ้นให้เกิดการกลายพันธุ์ในสิ่งมีชีวิตต้นแบบเพื่อเรียนรู้บทบาทของพวกมันในโรค ^{[ 10 ]}พันธุศาสตร์ย้อนกลับยังใช้เพื่อให้สถิติที่แม่นยำอย่างยิ่งเกี่ยวกับการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในยีนเฉพาะ จากการคัดกรองเหล่านี้ คุณสามารถกำหนดได้ว่าการกลายพันธุ์นั้นเกิดขึ้นโดยบังเอิญมากน้อยเพียงใด และการกลายพันธุ์เกิดขึ้นบ่อยแค่ไหน ^{[ 11 ]}

มีการคิดค้นวิธีการคัดกรองหลายรูปแบบเพื่อชี้แจงยีนที่นำไปสู่ฟีโนไทป์กลายพันธุ์ที่น่าสนใจ อีกรูปแบบหนึ่งที่สำคัญคือการคัดกรองแบบสังเคราะห์ที่ทำให้ตายซึ่งมองหาคู่การกลายพันธุ์ที่สามารถอยู่รอดได้ทีละตัวแต่ทำให้ตายเมื่อรวมกัน และสามารถเปิดเผยยีนที่ทำงานในเส้นทางที่ซ้ำซ้อนหรือขนานกันได้^{[ 12 ] [ 13 ]} === ตัวเร่งปฏิกิริยา ===

การคัดกรองตัวเร่งปฏิกิริยาเริ่มต้นด้วยบุคคลกลายพันธุ์ที่มีกระบวนการที่สนใจได้รับผลกระทบโดยมีการกลายพันธุ์ของยีนที่ทราบแล้ว จากนั้นสามารถใช้การคัดกรองเพื่อระบุยีนเพิ่มเติมหรือการกลายพันธุ์ของยีนที่มีบทบาทในกระบวนการทางชีววิทยาหรือสรีรวิทยา การคัดกรองตัวเร่งปฏิกิริยาทางพันธุกรรมจะระบุการกลายพันธุ์ที่เพิ่มฟีโนไทป์ที่สนใจในบุคคลกลายพันธุ์อยู่แล้ว ฟีโนไทป์ของบุคคลกลายพันธุ์คู่ (บุคคลที่มีทั้งตัวเร่งปฏิกิริยาและการกลายพันธุ์พื้นฐานดั้งเดิม) จะเด่นชัดกว่าฟีโนไทป์ของบุคคลกลายพันธุ์เดี่ยว การเพิ่มขึ้นจะต้องเหนือกว่าฟีโนไทป์ที่คาดหวังของการกลายพันธุ์ทั้งสองโดยลำพัง ดังนั้นการกลายพันธุ์แต่ละอย่างอาจถือได้ว่าเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาของอีกอย่างหนึ่ง การแยกตัวกลายพันธุ์ตัวเร่งปฏิกิริยาสามารถนำไปสู่การระบุยีนที่โต้ตอบกันหรือยีนที่ทำงานซ้ำซ้อนกัน^{[ 14 ]}

การคัดกรองตัวยับยั้งใช้เพื่อระบุการกลายพันธุ์ตัวยับยั้งที่บรรเทาหรือย้อนกลับฟีโนไทป์ของการกลายพันธุ์ดั้งเดิม ในกระบวนการที่เรียกว่าความมีชีวิตแบบสังเคราะห์ [ ^{15 ] การ}กลายพันธุ์ตัวยับยั้งสามารถอธิบายได้ว่าเป็นการกลายพันธุ์ครั้งที่สองที่ตำแหน่งบนโครโมโซมที่แตกต่างจากการกลายพันธุ์ที่กำลังศึกษา ซึ่งยับยั้งฟีโนไทป์ของการกลายพันธุ์ดั้งเดิม^{[ 16 ]}หากการกลายพันธุ์อยู่ในยีนเดียวกันกับการกลายพันธุ์ดั้งเดิม จะเรียกว่าการยับยั้งภายในยีนในขณะที่การกลายพันธุ์ที่อยู่ในยีนที่แตกต่างกันจะเรียกว่าการยับยั้งภายนอกยีนหรือการยับยั้งระหว่างยีน [ ^{1 ] การ}กลายพันธุ์ตัวยับยั้งมีประโยชน์อย่างยิ่งในการกำหนดหน้าที่ของวิถีทางชีวเคมีภายในเซลล์และความสัมพันธ์ระหว่างวิถีทางชีวเคมีต่างๆ

การคัดกรองที่ไวต่ออุณหภูมิเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิเพื่อเพิ่มลักษณะกลายพันธุ์ ประชากรที่เลี้ยงในอุณหภูมิต่ำจะมีลักษณะปกติ อย่างไรก็ตาม การกลายพันธุ์ในยีนเฉพาะจะทำให้มันไม่เสถียรในอุณหภูมิที่สูงขึ้น ตัวอย่างเช่น การคัดกรองความไวต่ออุณหภูมิในแมลงวันผลไม้ อาจเกี่ยวข้องกับการเพิ่มอุณหภูมิในกรงจนกระทั่งแมลงวันบางตัวหมดสติ จากนั้นจึงเปิดประตูเพื่อให้ตัวอื่นๆ หนีออกไป แต่ละตัวที่ถูกคัดเลือกในการคัดกรองมีแนวโน้มที่จะมียีนเวอร์ชันที่ผิดปกติซึ่งเกี่ยวข้องกับลักษณะที่สนใจ ข้อดีของอัลลีลที่พบในการคัดกรองประเภทนี้คือ ลักษณะกลายพันธุ์เป็นแบบมีเงื่อนไขและสามารถกระตุ้นได้โดยการเพิ่มอุณหภูมิเท่านั้นการกลายพันธุ์แบบไม่มีฟังก์ชันในยีนดังกล่าวอาจเป็นอันตรายถึงชีวิตต่อตัวอ่อน และตัวกลายพันธุ์ดังกล่าวจะถูกมองข้ามไปในการคัดกรองพื้นฐาน การคัดกรองที่ไวต่ออุณหภูมิที่มีชื่อเสียงได้ดำเนินการโดยอิสระโดยLee HartwellและPaul Nurseเพื่อระบุตัวกลายพันธุ์ที่บกพร่องในวงจรเซลล์ในS. cerevisiaeและS. pombeตามลำดับ

การคัดกรองด้วย RNA interference (RNAi)เป็นการคัดกรองทางพันธุศาสตร์แบบไปข้างหน้าโดยใช้เทคนิคทางพันธุศาสตร์แบบย้อนกลับ คล้ายกับการคัดกรองทางพันธุศาสตร์แบบคลาสสิกในอดีต ความสำเร็จของการสำรวจ RNAi ขนาดใหญ่ขึ้นอยู่กับการพัฒนาการทดสอบฟีโนไทป์และการตีความอย่างระมัดระวัง^{[ 9 ]}ในDrosophila RNAi ถูกนำมาใช้ในเซลล์เพาะเลี้ยงหรือในร่างกายเพื่อตรวจสอบหน้าที่ของยีนและเพื่อส่งผลต่อการทำงานของยีนเดี่ยวในระดับจีโนม RNAi ถูกใช้เพื่อปิดการแสดงออกของยีนใน Drosophila โดยการฉีด dsRNA เข้าไปในตัวอ่อนระยะแรก และรบกวน ยีน Frizzledและ Frizzled2 ทำให้เกิดข้อบกพร่องในการสร้างรูปแบบของตัวอ่อนที่เลียนแบบการสูญเสียการทำงานของ wingless ^{[ 17 ]}

CRISPR/Casส่วนใหญ่ใช้สำหรับการคัดกรองทางพันธุกรรมแบบย้อนกลับ CRISPR มีความสามารถในการสร้างคลังการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมที่แม่นยำหลายพันรายการ และสามารถระบุเนื้องอกใหม่ได้ เช่นเดียวกับการตรวจสอบเนื้องอกเก่าในการวิจัยมะเร็ง คลังCRISPR-Cas9 knockout (GeCKO) ระดับจีโนมที่กำหนดเป้าหมายยีน 18,080 ยีนด้วยลำดับไกด์ที่ไม่ซ้ำกัน 64,751 ลำดับ ระบุยีนที่จำเป็นต่อความอยู่รอดของเซลล์ในมะเร็ง ระบบ CRISPR–Cas9 ของแบคทีเรีย สำหรับการสร้างการกลายพันธุ์ทั้งแบบสูญเสียการทำงาน (LOF) และแบบเพิ่มการทำงาน (GOF) ในออร์แกนอยด์ลำไส้ของมนุษย์ที่ไม่ได้รับการเปลี่ยนแปลง เพื่อแสดงแบบจำลองของมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก (CRC)นอกจากนี้ยังสามารถใช้เพื่อศึกษาผลที่ตามมาของการกลายพันธุ์ในร่างกายโดยการแก้ไขจีโนมโดยตรงในเซลล์ร่างกาย^{[ 10 ]}

ตาม แนวทาง พันธุศาสตร์แบบดั้งเดิมนักวิจัยจะระบุตำแหน่ง (ทำแผนที่) ยีนบนโครโมโซมโดยการผสมข้ามพันธุ์กับสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะ ผิดปกติอื่นๆ และเก็บสถิติเกี่ยวกับความถี่ในการถ่ายทอดลักษณะทั้งสองร่วมกัน นักพันธุศาสตร์แบบดั้งเดิมจะใช้ลักษณะทางฟีโนไทป์เพื่อทำแผนที่อัลลีล กลายพันธุ์ใหม่ ด้วยการเกิดขึ้นของลำดับจีโนมสำหรับระบบแบบจำลอง เช่นDrosophila melanogaster , Arabidopsis thalianaและC. elegans ทำให้มีการระบุโพลีมอ ร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNPs) จำนวนมากที่สามารถใช้เป็นลักษณะสำหรับการทำแผนที่ได้ ที่จริงแล้ว การคัดกรองแบบไฮเดลเบิร์กซึ่งช่วยให้สามารถทดสอบตัวกลายพันธุ์จำนวนมากได้ และพัฒนาขึ้นในปี 1980 โดยNüsslein-VolhardและWieschausได้ปูทางให้กับนักวิทยาศาสตร์ในอนาคตในสาขานี้^{[ 4 ]} SNP เป็นลักษณะที่นิยมสำหรับการทำแผนที่ เนื่องจากมีความถี่สูงมาก ประมาณหนึ่งความแตกต่างต่อ 1,000 คู่เบส ระหว่างสิ่งมีชีวิตสายพันธุ์ต่างๆ สารก่อกลายพันธุ์ เช่น การแทรก DNA แบบสุ่มโดยการแปลงสภาพหรือทรานสโพซอน ที่ทำงานอยู่ ก็สามารถใช้สร้างกลายพันธุ์ใหม่ได้เช่นกัน เทคนิคเหล่านี้มีข้อดีคือการติดแท็กอัลลีลใหม่ด้วยเครื่องหมายโมเลกุล (DNA) ที่รู้จัก ซึ่งสามารถอำนวยความสะดวกในการระบุยีนได้อย่างรวดเร็ว^{[ 8 ]}

การโคลนนิ่งตามตำแหน่ง (Positional cloning) เป็นวิธีการระบุยีนที่ระบุยีนสำหรับลักษณะเฉพาะโดยอาศัยเพียงตำแหน่งโดยประมาณบนโครโมโซม (แต่ไม่ใช่หน้าที่การทำงาน) ซึ่งเรียกว่าบริเวณเป้าหมาย (candidate region ) ในขั้นต้น บริเวณเป้าหมายสามารถกำหนดได้โดยใช้เทคนิคต่างๆ เช่นการวิเคราะห์การเชื่อมโยง (linkage analysis ) จากนั้นจึงใช้การโคลนนิ่งตามตำแหน่งเพื่อจำกัดบริเวณเป้าหมายให้แคบลงจนกว่าจะพบยีนและการกลายพันธุ์ของยีนนั้น การโคลนนิ่งตามตำแหน่งโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับการแยกส่วนของดีเอ็นเอที่ทับซ้อนกันบางส่วนจากคลังจีโนมเพื่อดำเนินการไปตามโครโมโซมจนถึงยีนที่เฉพาะเจาะจง ในระหว่างกระบวนการโคลนนิ่งตามตำแหน่ง จำเป็นต้องตรวจสอบว่าส่วนของดีเอ็นเอที่กำลังพิจารณาอยู่นั้นเป็นส่วนหนึ่งของยีนหรือไม่

การทดสอบที่ใช้เพื่อวัตถุประสงค์นี้ ได้แก่ การผสมข้ามสายพันธุ์ การระบุเกาะ CpG ที่ไม่มีการเมทิลเลชั่ นการดักจับเอ็กซอน การเลือก cDNAโดยตรงการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอด้วยคอมพิวเตอร์ การตรวจคัดกรองการกลายพันธุ์ในผู้ป่วย และการทดสอบการแสดงออกของยีน สำหรับจีโนมที่ทราบบริเวณของโพลีมอร์ฟิซึมทางพันธุกรรมการโคลนนิ่งตามตำแหน่งเกี่ยวข้องกับการระบุโพลีมอร์ฟิซึมที่อยู่ล้อมรอบการกลายพันธุ์ กระบวนการนี้ต้องใช้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่รู้จักใกล้ที่สุดมาทำการโคลนนิ่งและจัดลำดับอย่างต่อเนื่อง โดยเข้าใกล้แอลลีลกลายพันธุ์มากขึ้นในแต่ละโคลนใหม่ กระบวนการนี้สร้างแผนที่คอนติกของโลคัสและเรียกว่าการเดินโครโมโซมด้วยความสำเร็จของโครงการจัดลำดับจีโนม เช่นโครงการจีโนมมนุษย์การโคลนนิ่งตามตำแหน่งสมัยใหม่สามารถใช้คอนติกสำเร็จรูปจากฐานข้อมูลลำดับจีโนมได้โดยตรง

สำหรับโคลน DNA ใหม่แต่ละตัว จะมีการระบุและทดสอบความแปรผันทางพันธุกรรมในประชากรสำหรับการทำแผนที่ โดยเปรียบเทียบความถี่ของ การเกิดการรวมตัวใหม่กับฟีโนไทป์กลายพันธุ์ เมื่อโคลน DNA อยู่ที่หรือใกล้กับอัลลีลกลายพันธุ์ ความถี่ของการเกิดการรวมตัวใหม่ควรจะใกล้เคียงกับศูนย์ หากการเดินสำรวจโครโมโซมดำเนินไปผ่านอัลลีลกลายพันธุ์ ความแปรผันทางพันธุกรรมใหม่จะเริ่มแสดงความถี่ของการเกิดการรวมตัวใหม่ที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับฟีโนไทป์กลายพันธุ์ ขึ้นอยู่กับขนาดของประชากรสำหรับการทำแผนที่ อัลลีลกลายพันธุ์สามารถจำกัดให้แคบลงเหลือเพียงบริเวณเล็กๆ (<30 กิโลเบส) จากนั้นจึงจำเป็นต้องเปรียบเทียบลำดับระหว่าง DNA ชนิดปกติและ DNA กลายพันธุ์ในบริเวณนั้น เพื่อระบุตำแหน่งของการกลายพันธุ์ ของ DNA ที่ทำให้เกิดความแตกต่างของฟีโนไทป์

เทคนิคการโคลนนิ่งตามตำแหน่งสมัยใหม่สามารถดึงข้อมูลจากโครงการลำดับจีโนมและข้อมูลที่มีอยู่ได้โดยตรงมากขึ้น โดยการวิเคราะห์ยีนในบริเวณเป้าหมาย จากนั้นจึงสามารถจัดลำดับความสำคัญของยีนที่อาจก่อให้เกิดโรคจากบริเวณเป้าหมาย ซึ่งอาจช่วยลดปริมาณงานที่เกี่ยวข้องได้ ยีนที่มีรูปแบบการแสดงออกสอดคล้องกับลักษณะของโรค แสดงให้เห็นถึงหน้าที่ (ที่คาดการณ์ไว้) ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะของโรค หรือมีความคล้ายคลึงกับยีนอื่นที่เชื่อมโยงกับลักษณะของโรค ล้วนเป็นยีนเป้าหมายที่มีลำดับความสำคัญ การประยุกต์ใช้เทคนิคการโคลนนิ่งตามตำแหน่งในลักษณะนี้เรียกอีกอย่างว่า การค้นพบยีนตามตำแหน่ง

การโคลนนิ่งตามตำแหน่งเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการแยกยีนที่ก่อให้เกิดโรคโดยไม่ลำเอียง และได้ถูกนำมาใช้ในการระบุยีนที่ก่อให้เกิดโรคกล้ามเนื้อเสื่อมดูเชนโรคฮันติงตันและโรคซิสติกไฟโบรซิสอย่างไรก็ตาม ความซับซ้อนในการวิเคราะห์จะเกิดขึ้นหากโรคนั้นมีความหลากหลายในตำแหน่งของยีน

• หลักการของการโคลนนิ่งยีนพืชโดยอาศัยแผนที่หรือตำแหน่ง
• บทความเด่นจาก Nature Reviews Genetics: ศิลปะและการออกแบบของการคัดกรองทางพันธุกรรม