การเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์สองมิติ (2D NMR)เป็นเทคนิคสเปกโทรสโกปีขั้นสูงที่พัฒนาต่อยอดจากความสามารถของ NMR หนึ่งมิติ (1D NMR) โดยการเพิ่มมิติความถี่เพิ่มเติม การขยายนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์โครงสร้างโมเลกุลได้อย่างครอบคลุมมากขึ้น^{[ 1 ]}ใน 2D NMR สัญญาณจะกระจายไปตามแกนความถี่สองแกน ทำให้ได้ความละเอียดและการแยกยอดที่ทับซ้อนกันที่ดีขึ้น ซึ่งเป็นประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการศึกษาโมเลกุลที่ซับซ้อน เทคนิคนี้ระบุความสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสต่างๆ ภายในโมเลกุล ช่วยให้สามารถกำหนดการเชื่อมต่อ ความใกล้ชิดเชิงพื้นที่ และปฏิสัมพันธ์แบบไดนามิกได้

NMR แบบ 2 มิติ ครอบคลุมการทดลองที่หลากหลาย^{[ 1 ]}รวมถึงCOSY (Correlation Spectroscopy), TOCSY (Total Correlation Spectroscopy), NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) และHSQC ( Heteronuclear Single Quantum Coherence ) เทคนิคเหล่านี้เป็นสิ่งจำเป็นในสาขาต่างๆ เช่น ชีววิทยาโครงสร้าง ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการกำหนดโครงสร้างโปรตีนและกรดนิวคลีอิก เคมีอินทรีย์ ซึ่งช่วยในการอธิบายโมเลกุลอินทรีย์ที่ซับซ้อน และวิทยาศาสตร์วัสดุ ซึ่งให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ของโมเลกุลในพอลิเมอร์และโครงสร้างโลหะอินทรีย์ NMR แบบ 2 มิติ ช่วยเพิ่มความชัดเจนของข้อมูลโครงสร้างโดยการแยกสัญญาณที่มักจะทับซ้อนกันในสเปกตรัม NMR แบบ 1 มิติของโมเลกุลที่ซับซ้อน^{[ 1 ]} NMR แบบ 2 มิติ สามารถให้ข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับโครงสร้างทางเคมีและการจัดเรียงสามมิติของโมเลกุลได้

การทดลองสองมิติครั้งแรก COSY ได้รับการเสนอโดยJean Jeenerศาสตราจารย์จาก Université Libre de Bruxelles ในปี 1971 การทดลองนี้ได้รับการดำเนินการโดย Walter P. Aue, Enrico Bartholdi และRichard R. Ernstซึ่งตีพิมพ์ผลงานของพวกเขาในปี 1976 ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

การทดลองแต่ละครั้งประกอบด้วยลำดับของ พัลส์ ความถี่วิทยุ (RF) โดยมีช่วงเวลาหน่วงระหว่างกัน จังหวะ ความถี่ และความเข้มของพัลส์เหล่านี้ทำให้การทดลอง NMR ที่แตกต่างกันแตกต่างกัน^{[ 5 ]} การทดลองแบบสองมิติเกือบทั้งหมดมีสี่ขั้นตอน ได้แก่ ช่วงเตรียมการ ซึ่งสร้างความสอดคล้องของสนามแม่เหล็กผ่านชุดพัลส์ RF ช่วงวิวัฒนาการ ซึ่งเป็นช่วงเวลาที่กำหนดไว้ซึ่งไม่มีการส่งพัลส์และอนุญาตให้สปินนิวเคลียร์หมุนได้อย่างอิสระ ช่วงผสม ซึ่งความสอดคล้องจะถูกจัดการโดยชุดพัลส์อีกชุดหนึ่งให้อยู่ในสถานะที่จะให้สัญญาณที่สังเกตได้ และช่วงตรวจจับ ซึ่ง สัญญาณ การสลายตัวของการเหนี่ยวนำอิสระจากตัวอย่างจะถูกสังเกตเป็นฟังก์ชันของเวลา ในลักษณะที่เหมือนกับ FT-NMR แบบหนึ่งมิติ^{[ 6 ]}

มิติทั้งสองของการทดลอง NMR สองมิติคือแกนความถี่สองแกนที่แสดงถึงการเปลี่ยนแปลงทางเคมี แกนความถี่แต่ละแกนจะสัมพันธ์กับตัวแปรเวลาหนึ่งในสองตัว ซึ่งก็คือความยาวของช่วงเวลาวิวัฒนาการ ( เวลาวิวัฒนาการ ) และเวลาที่ผ่านไปในช่วงเวลาการตรวจจับ ( เวลาการตรวจจับ ) โดยแต่ละตัวแปรจะถูกแปลงจากอนุกรมเวลาเป็นอนุกรมความถี่ผ่านการแปลงฟูริเยร์ สองมิติ ซึ่งอยู่ในโดเมนเวลาและขึ้นอยู่กับสัญญาณจากการทดลอง t1 ที่แตกต่างกันแต่ละครั้ง การทดลองสองมิติเพียงครั้งเดียวจะถูกสร้างขึ้นเป็นชุดของการทดลองหนึ่งมิติ โดยมีเวลาวิวัฒนาการเฉพาะที่แตกต่างกันในการทดลองที่ต่อเนื่องกัน และระยะเวลาทั้งหมดของช่วงเวลาการตรวจจับจะถูกบันทึกไว้ในการทดลองแต่ละครั้ง^{[ 6 ]}

ผลลัพธ์สุดท้ายคือแผนภูมิที่แสดงค่าความเข้มสำหรับตัวแปรความถี่แต่ละคู่ ความเข้มของยอดในสเปกตรัมสามารถแสดงได้โดยใช้มิติที่สาม โดยทั่วไปแล้ว ความเข้มจะแสดงด้วยเส้นชั้นความสูงหรือสีต่างๆ

ในวิธีการเหล่านี้ การถ่ายโอนสนามแม่เหล็กเกิดขึ้นระหว่างนิวเคลียสชนิดเดียวกัน ผ่านการเชื่อมต่อแบบ Jของนิวเคลียสที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะไม่เกินสองสามพันธะ

การทดลอง NMR สองมิติแบบแรกและเป็นที่นิยมมากที่สุดคือลำดับสเปกโทรสโกปีความสัมพันธ์โฮโมนิวเคลียร์ (COSY) ซึ่งใช้ในการระบุสปินที่เชื่อมโยงกัน ประกอบด้วยพัลส์ RF เดี่ยว (p1) ตามด้วยเวลาวิวัฒนาการเฉพาะ (t1) ตามด้วยพัลส์ที่สอง (p2) ตามด้วยช่วงเวลาการวัด (t2) ^{[ 7 ]}

การทดลอง Correlation Spectroscopy ทำงานโดยการหาความสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสที่เชื่อมต่อกันผ่านการเชื่อมต่อแบบสเกลาร์ หรือที่เรียกว่าJ-coupling [ ^{8 ] การ}เชื่อมต่อนี้คือปฏิสัมพันธ์ระหว่างสปินของนิวเคลียสที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะ โดยทั่วไปจะสังเกตได้ระหว่างนิวเคลียสที่อยู่ห่างกัน 2-3 พันธะ (เช่น โปรตอนข้างเคียง) ด้วยการตรวจจับปฏิสัมพันธ์เหล่านี้ COSY จึงให้ข้อมูลที่สำคัญเกี่ยวกับการเชื่อมต่อระหว่างอะตอมภายในโมเลกุล ทำให้เป็นเครื่องมือที่สำคัญสำหรับการอธิบายโครงสร้างในเคมีอินทรีย์

การทดลอง COSY สร้างสเปกตรัมสองมิติที่มีการเลื่อนทางเคมีตามแกน x (แนวนอน) และแกน y (แนวตั้ง) และเกี่ยวข้องกับขั้นตอนสำคัญหลายขั้นตอน^{[ 1 ]}ขั้นแรก ตัวอย่างจะถูกกระตุ้นโดยใช้พัลส์คลื่นความถี่วิทยุ (RF) หลายชุด ทำให้สปินของนิวเคลียสอยู่ในสถานะพลังงานที่สูงขึ้นหลังจากพัลส์ RF แรก ระบบจะวิวัฒนาการอย่างอิสระในช่วงเวลาที่เรียกว่า t ₁ซึ่งในระหว่างนั้นสปินจะหมุนวนด้วยความถี่ที่สอดคล้องกับการเลื่อนทางเคมี ความสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงเวลาวิวัฒนาการ (t ₁ ) ทีละน้อยเพื่อจับปฏิสัมพันธ์ทางอ้อม ชุดการทดลองนี้ แต่ละครั้งมีค่า t ₁ ที่แตกต่างกัน ทำให้สามารถตรวจจับการเลื่อนทางเคมีจากนิวเคลียสที่อาจไม่สามารถสังเกตได้โดยตรงในสเปกตรัมหนึ่งมิติ เมื่อ t ₁เพิ่มขึ้น จะเกิดจุดตัดในสเปกตรัม 2 มิติที่ได้ ซึ่งแสดงถึงปฏิสัมพันธ์ เช่น การจับคู่หรือความใกล้ชิดเชิงพื้นที่ระหว่างนิวเคลียส แนวทางนี้ช่วยในการระบุความเชื่อมโยงระหว่างอะตอม ทำให้เข้าใจโครงสร้างโมเลกุลได้ลึกซึ้งยิ่งขึ้น และช่วยในการตีความระบบที่ซับซ้อน

พีคไขว้เกิดจากปรากฏการณ์ที่เรียกว่าการถ่ายโอนสนามแม่เหล็กและการปรากฏของพีคไขว้บ่งชี้ว่านิวเคลียสสองตัวมีการจับคู่กัน โดยมีค่าการเลื่อนทางเคมีที่แตกต่างกันสองค่าซึ่งประกอบเป็นพิกัดของพีคไขว้ การจับคู่แต่ละครั้งจะให้พีคไขว้สมมาตรสองพีคอยู่เหนือและใต้แนวทแยง นั่นคือ พีคไขว้เกิดขึ้นเมื่อมีความสัมพันธ์ระหว่างสัญญาณของสเปกตรัมตามแกนทั้งสองที่ค่าเหล่านี้ วิธีการมองเห็นที่ง่ายในการระบุว่าพีคไขว้แสดงถึงการจับคู่ใดคือการหาพีคแนวทแยงที่อยู่เหนือหรือใต้พีคไขว้โดยตรง และพีคแนวทแยงอีกพีคที่อยู่ทางซ้ายหรือขวาของพีคไขว้โดยตรง นิวเคลียสที่แสดงโดยพีคแนวทแยงทั้งสองนั้นมีการจับคู่กัน^{[ 7 ]}

ถัดไป จะมีการส่งพัลส์ RF ครั้งที่สองเพื่อให้สนามแม่เหล็กถ่ายโอนระหว่างนิวเคลียสที่เชื่อมต่อกัน สัญญาณที่ได้จะถูกบันทึกอย่างต่อเนื่องในช่วงเวลาการตรวจจับ (t2 ₎หลังจากพัลส์ RF ครั้งที่สอง จากนั้นข้อมูลจะถูกประมวลผลผ่านการแปลงฟูริเยร์ตามแกน t1 _และ t2 _{ทำให้}เกิดสเปกตรัม 2 มิติ โดยมีจุดสูงสุดแสดงอยู่ตามแนวทแยงมุมและนอกแนวทแยงมุม

เมื่อตีความสเปกตรัม COSY พีคแนวทแยงจะสอดคล้องกับค่าการเลื่อนทางเคมีแบบ 1 มิติของนิวเคลียสแต่ละตัว คล้ายกับพีคมาตรฐานในสเปกตรัม NMR แบบ 1 มิติ คุณลักษณะสำคัญของสเปกตรัม COSY คือการมีอยู่ของพีคไขว้ดังแสดงในรูปที่ 1 ซึ่งบ่งชี้ถึงการจับคู่ระหว่างนิวเคลียสคู่หนึ่ง พีคไขว้เหล่านี้ให้ข้อมูลที่สำคัญเกี่ยวกับการเชื่อมต่อภายในโมเลกุล แสดงให้เห็นว่านิวเคลียสทั้งสองเชื่อมต่อกันด้วยพันธะจำนวนเล็กน้อย โดยปกติจะเป็นสองหรือสามพันธะ

COSY มีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อต้องจัดการกับโมเลกุลที่ซับซ้อน เช่น ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ เปปไทด์ และโปรตีน ซึ่งการทำความเข้าใจการเชื่อมต่อของนิวเคลียสต่างๆ ผ่านพันธะมีความสำคัญอย่างยิ่ง ในขณะที่ 1D NMR นั้นตรงไปตรงมาและเหมาะสำหรับการระบุคุณลักษณะโครงสร้างพื้นฐาน แต่ COSY ช่วยเพิ่มขีดความสามารถของ NMR โดยให้ข้อมูลเชิงลึกที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับการเชื่อมต่อของโมเลกุล

สเปกตรัมสองมิติที่ได้จากการทดลอง COSY แสดงความถี่สำหรับไอโซโทป เดี่ยว ซึ่งโดยทั่วไปคือไฮโดรเจน ( ^1H ) ตามแกนทั้งสอง (มีการคิดค้นเทคนิคสำหรับการสร้างสเปกตรัมความสัมพันธ์แบบเฮเทอโรนิวเคลียร์ ซึ่งแกนทั้งสองสอดคล้องกับไอโซโทปที่แตกต่างกัน เช่น^13Cและ1H ) ยอดแนวทแยงสอดคล้องกับยอดในการทดลอง 1D-NMR ในขณะที่ยอดไขว้แสดงถึงการจับคู่ระหว่างนิวเคลียสคู่ (เช่นเดียวกับการแยกมัลติเพล็ตที่แสดงถึงการจับ ^คู่ใน 1D-NMR) ^{[ 7 ]}

COSY-90 เป็นการทดลอง COSY ที่พบได้บ่อยที่สุด ใน COSY-90 พัลส์ p1 จะเอียงสปินนิวเคลียร์ไป 90° การทดลองCOSY-45 เป็นอีกหนึ่งการทดลองในตระกูล COSY ใน COSY-45 จะใช้พัลส์ 45° แทนพัลส์ 90° สำหรับพัลส์ที่สอง p2 ข้อดีของ COSY-45 คือยอดแนวทแยงมุมจะเด่นชัดน้อยกว่า ทำให้การจับคู่จุดตัดใกล้แนวทแยงมุมในโมเลกุลขนาดใหญ่ทำได้ง่ายขึ้น นอกจากนี้ ยังสามารถอธิบายเครื่องหมายสัมพัทธ์ของค่าคงที่การคัปปลิ้ง (ดูJ-coupling#Magnitude of J-coupling ) ได้จากสเปกตรัม COSY-45 ซึ่งไม่สามารถทำได้โดยใช้ COSY-90 ^{[ 9 ]} โดยรวมแล้ว COSY-45 ให้สเปกตรัมที่สะอาดกว่า ในขณะที่ COSY-90 มีความไวมากกว่า

เทคนิค COSY ที่เกี่ยวข้องอีกอย่างหนึ่งคือ COSY แบบกรองควอนตัมคู่ (DQF) COSY แบบ DQF ใช้การเลือกความสอดคล้อง เช่น การวนรอบเฟสหรือการไล่ระดับสนามแบบพัลส์ซึ่งทำให้เฉพาะสัญญาณจากความสอดคล้องควอนตัมคู่เท่านั้นที่จะให้สัญญาณที่สังเกตได้ ซึ่งมีผลทำให้ความเข้มของยอดแนวทแยงลดลงและเปลี่ยนรูปร่างเส้นจากรูปร่างเส้น "การกระจาย" ที่กว้างไปเป็นรูปร่างเส้น "การดูดกลืน" ที่คมชัดขึ้น นอกจากนี้ยังกำจัดยอดแนวทแยงจากนิวเคลียสที่ไม่จับคู่กัน ข้อดีทั้งหมดนี้คือให้สเปกตรัมที่สะอาดกว่าซึ่งป้องกันไม่ให้ยอดแนวทแยงบดบังยอดไขว้ซึ่งอ่อนกว่าในสเปกตรัม COSY ปกติ^{[ 10 ]}

การทดลอง TOCSY คล้ายกับการทดลอง COSY ตรงที่สังเกตเห็นพีคไขว้ของโปรตอนที่จับคู่กัน อย่างไรก็ตาม พีคไขว้ไม่ได้สังเกตเฉพาะนิวเคลียสที่จับคู่กันโดยตรงเท่านั้น แต่ยังสังเกตระหว่างนิวเคลียสที่เชื่อมต่อกันด้วยสายโซ่ของการจับคู่ด้วย ทำให้มีประโยชน์ในการระบุเครือข่ายการจับคู่สปินที่เชื่อมต่อกันขนาดใหญ่ ความสามารถนี้เกิดขึ้นได้จากการแทรกชุดพัลส์ซ้ำๆ ซึ่งทำให้เกิดการผสมแบบไอโซโทรปิกในช่วงเวลาการผสม เวลาการผสมแบบไอโซโทรปิกที่นานขึ้นทำให้โพลาไรเซชันกระจายออกไปผ่านพันธะจำนวนมากขึ้น^{[ 11 ]}

ในกรณีของโอลิโกแซ็กคาไรด์ หน่วยน้ำตาลแต่ละหน่วยเป็นระบบสปินที่แยกออกจากกัน ดังนั้นจึงสามารถแยกแยะโปรตอนทั้งหมดของหน่วยน้ำตาลเฉพาะได้ นอกจากนี้ยังมี TOCSY เวอร์ชัน 1 มิติ ซึ่งการฉายรังสีไปยังโปรตอนเพียงตัวเดียวจะทำให้สามารถเปิดเผยระบบสปินที่เหลือได้ ความก้าวหน้าล่าสุดในเทคนิคนี้รวมถึงการทดลอง TOCSY แบบ 1 มิติ-CSSF (ตัวกรองการเลือกการเปลี่ยนแปลงทางเคมี) ซึ่งให้สเปกตรัมที่มีคุณภาพสูงกว่าและช่วยให้สามารถสกัดค่าคงที่การเชื่อมต่อได้อย่างน่าเชื่อถือและนำไปใช้ในการกำหนดสเตอริโอเคมีได้

TOCSY บางครั้งเรียกว่า "สเปกโทรสโกปีฮาร์ทมันน์-ฮาห์นโฮโมโนเคลียร์" (HOHAHA) ^{[ 12 ]}

INADEQUATE ^{[ 13 ]}เป็นวิธีการที่มักใช้ในการค้นหา คู่ ¹³ C ระหว่างอะตอมคาร์บอนที่อยู่ติดกัน เนื่องจากความอุดมสมบูรณ์ตามธรรมชาติของ¹³ C มีเพียงประมาณ 1% เท่านั้น โมเลกุลที่กำลังศึกษาจะมี อะตอม ¹³ C สองอะตอมที่อยู่ใกล้เคียงกันซึ่งจำเป็นสำหรับสัญญาณในการทดลองนี้เพียงประมาณ 0.01% เท่านั้น อย่างไรก็ตาม วิธีการเลือกความสัมพันธ์ (คล้ายกับ DQF COSY) ถูกนำมาใช้เพื่อป้องกันสัญญาณจาก อะตอม ¹³ C เดี่ยว เพื่อให้ สามารถแยกสัญญาณ ¹³ C คู่ได้อย่างง่ายดาย นิวเคลียสแต่ละคู่ที่จับคู่กันจะให้ยอดคู่หนึ่งบนสเปกตรัม INADEQUATE ซึ่งทั้งสองมีพิกัดแนวตั้งเดียวกัน ซึ่งเป็นผลรวมของค่าการเลื่อนทางเคมีของนิวเคลียส พิกัดแนวนอนของแต่ละยอดคือค่าการเลื่อนทางเคมีสำหรับแต่ละนิวเคลียสแยกกัน^{[ 14 ]}

สเปกโทรสโกปีความสัมพันธ์เฮเทอโรนิวเคลียร์ให้สัญญาณโดยอาศัยการจับคู่ระหว่างนิวเคลียสสองประเภทที่แตกต่างกัน บ่อยครั้งที่นิวเคลียสทั้งสองคือโปรตอนและนิวเคลียสอื่น (เรียกว่า "เฮเทอโรนิวเคลียส") ด้วยเหตุผลทางประวัติศาสตร์ การทดลองที่บันทึกสเปกตรัมของโปรตอนแทนที่จะเป็นสเปกตรัมของเฮเทอโรนิวเคลียสในช่วงเวลาการตรวจจับเรียกว่าการทดลองแบบ "ผกผัน" เนื่องจากความอุดมสมบูรณ์ตามธรรมชาติที่ต่ำของเฮเทอโรนิวเคลียสส่วนใหญ่จะทำให้สเปกตรัมของโปรตอนถูกบดบังด้วยสัญญาณจากโมเลกุลที่ไม่มีเฮเทอโรนิวเคลียสที่ใช้งานอยู่ ทำให้ไม่สามารถใช้สังเกตสัญญาณที่ต้องการได้ ด้วยการเกิดขึ้นของเทคนิคในการระงับสัญญาณที่ไม่พึงประสงค์เหล่านี้ การทดลองความสัมพันธ์แบบผกผัน เช่น HSQC, HMQC และ HMBC จึงเป็นที่นิยมมากขึ้นในปัจจุบัน สเปกโทรสโกปีความสัมพันธ์เฮเทอโรนิวเคลียร์แบบ "ปกติ" ซึ่งบันทึกสเปกตรัมของเฮเทอโรนิวเคลียส เรียกว่า HETCOR ^{[ 15 ]}

Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) เป็นเทคนิค NMR แบบ 2 มิติที่ใช้สำหรับการตรวจจับปฏิสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสประเภทต่างๆ ที่แยกจากกันด้วยพันธะหนึ่งพันธะ โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตอน ( ^1H ) และเฮเทอโรนิวเคลียส เช่น คาร์บอน ( ^13C ) หรือไนโตรเจน ( ^15N ) ^{[ 17 ]}วิธีนี้ให้พีคหนึ่งพีคต่อคู่ของนิวเคลียสที่จับคู่กัน โดยพิกัดทั้งสองคือค่าการเลื่อนทางเคมีของอะตอมที่จับคู่กันทั้งสอง^{[ 18 ]}

วิธีการนี้มีบทบาทสำคัญในการหาโครงสร้าง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวิเคราะห์สารประกอบอินทรีย์ ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ และโมเลกุลชีวภาพ เช่น โปรตีนและกรดนิวคลีอิก HSQC ถูกออกแบบมาเพื่อตรวจจับความสัมพันธ์แบบพันธะเดี่ยวระหว่างโปรตอนและอะตอมต่างชนิดกัน ซึ่งให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการเชื่อมต่อของไฮโดรเจนและอะตอมต่างชนิดกันผ่านการถ่ายโอนสนามแม่เหล็ก

การทดลอง HSQC ประกอบด้วยขั้นตอนต่างๆ เพื่อสร้างสเปกตรัม NMR สองมิติ ขั้นแรก ตัวอย่างจะถูกกระตุ้นด้วยคลื่นความถี่วิทยุ (RF) ทำให้สปินของนิวเคลียสอยู่ในสถานะกระตุ้นและเตรียมพร้อมสำหรับการถ่ายโอนสนามแม่เหล็ก จากนั้นสนามแม่เหล็กจะถูกถ่ายโอนจากโปรตอนไปยังนิวเคลียสต่างชนิดผ่านการเชื่อมต่อแบบสเกลาร์หนึ่งพันธะ (J-coupling) เพื่อให้แน่ใจว่าเฉพาะนิวเคลียสที่เชื่อมต่อกันโดยตรงเท่านั้นที่มีส่วนร่วมในการถ่ายโอน ต่อมา ระบบจะเปลี่ยนแปลงไปในช่วงเวลาที่เรียกว่า t1 _และสนามแม่เหล็กจะถูกถ่ายโอนกลับจากนิวเคลียสต่างชนิดไปยังโปรตอน สัญญาณสุดท้ายจะถูกตรวจจับ ซึ่งเข้ารหัสข้อมูลทั้งของโปรตอนและนิวเคลียสต่างชนิด และจะทำการแปลงฟูริเยร์เพื่อสร้างสเปกตรัม 2 มิติที่เชื่อมโยงค่าการเลื่อนทางเคมีของโปรตอนและนิวเคลียสต่างชนิดกัน

HSQC ทำงานโดยการถ่ายโอนสนามแม่เหล็กจาก นิวเคลียส I (โดยปกติคือโปรตอน) ไปยัง นิวเคลียส S (โดยปกติคืออะตอมต่างชนิด) โดยใช้ ลำดับพัลส์ INEPTขั้นตอนแรกนี้ทำขึ้นเนื่องจากโปรตอนมีสนามแม่เหล็กสมดุลที่มากกว่า ดังนั้นขั้นตอนนี้จึงสร้างสัญญาณที่แรงกว่า จากนั้นสนามแม่เหล็กจะวิวัฒนาการและถูกถ่ายโอนกลับไปยัง นิวเคลียส Iเพื่อสังเกต สามารถใช้ขั้นตอน สปินเอคโค เพิ่มเติม เพื่อแยกสัญญาณ ทำให้สเปกตรัมง่ายขึ้นโดยการยุบมัลติเพล็ตให้เหลือเพียงยอดเดียว สัญญาณที่ไม่ต้องการซึ่งแยกออกจากกันจะถูกกำจัดออกโดยการทำการทดลองสองครั้งโดยกลับเฟสของพัลส์เฉพาะหนึ่งพัลส์ ซึ่งจะกลับเครื่องหมายของยอดที่ต้องการแต่ไม่กลับเครื่องหมายของยอดที่ไม่ต้องการ ดังนั้นการลบสเปกตรัมทั้งสองจะให้เฉพาะยอดที่ต้องการเท่านั้น^{[ 18 ]}

การตีความสเปกตรัม HSQC ขึ้นอยู่กับการสังเกตครอสพีค ซึ่งบ่งชี้ถึงพันธะโดยตรงระหว่างโปรตอนและคาร์บอนหรือไนโตรเจน ครอสพีคแต่ละอันสอดคล้องกับ คู่ ^1H - ^13Cหรือ^1H - ^15N ที่เฉพาะเจาะจง ซึ่งให้การกำหนดการเชื่อมต่อ 1H-X โดยตรง โดยที่ X คือเฮเทอโรนิวเคลียส^{[ 17 ]}เทคนิค HSQC มีข้อดีหลายประการ รวมถึงการมุ่งเน้นไปที่ความสัมพันธ์ของพันธะเดียว ความไวที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากการตรวจจับโปรตอนโดยตรง และการทำให้สเปกตรัมที่แออัดง่ายขึ้นโดยการแยกสัญญาณที่ทับซ้อนกันและช่วยในการวิเคราะห์โมเลกุลที่ซับซ้อน

สเปกโทรสโกปีความสัมพันธ์ควอนตัมหลายนิวเคลียสแบบเฮเทอโรนิวเคลียร์ (HMQC) ให้สเปกตรัมที่เหมือนกับ HSQC แต่ใช้วิธีการที่แตกต่างกัน ทั้งสองวิธีให้ผลลัพธ์ที่มีคุณภาพใกล้เคียงกันสำหรับโมเลกุลขนาดเล็กถึงขนาดกลาง แต่ HSQC ถือว่าเหนือกว่าสำหรับโมเลกุลขนาดใหญ่^{[ 18 ]}

HMBC ตรวจจับความสัมพันธ์แบบเฮเทอโรนิวเคลียร์ในช่วงที่ยาวกว่าประมาณ 2–4 พันธะ ความยากลำบากในการตรวจจับความสัมพันธ์แบบหลายพันธะคือลำดับ HSQC และ HMQC มีเวลาหน่วงเฉพาะระหว่างพัลส์ ซึ่งทำให้สามารถตรวจจับได้เฉพาะช่วงรอบค่าคงที่การเชื่อมต่อเฉพาะเท่านั้น นี่ไม่ใช่ปัญหาสำหรับวิธีการพันธะเดี่ยว เนื่องจากค่าคงที่การเชื่อมต่อมักจะอยู่ในช่วงแคบ แต่ค่าคงที่การเชื่อมต่อแบบหลายพันธะครอบคลุมช่วงที่กว้างกว่ามากและไม่สามารถจับได้ทั้งหมดในการทดลอง HSQC หรือ HMQC เพียงครั้งเดียว^{[ 19 ]}

ใน HMBC ความยากลำบากนี้ได้รับการแก้ไขโดยการละเว้นความล่าช้าหนึ่งในลำดับ HMQC ซึ่งจะเพิ่มช่วงของค่าคงที่การเชื่อมต่อที่สามารถตรวจจับได้ และยังช่วยลดการสูญเสียสัญญาณจากการผ่อนคลาย ข้อเสียคือจะทำให้ไม่สามารถแยกสเปกตรัมได้ และทำให้เกิดการบิดเบือนเฟสในสัญญาณ มีการดัดแปลงวิธี HMBC ซึ่งจะระงับสัญญาณพันธะเดี่ยว เหลือไว้เฉพาะสัญญาณพันธะหลายพันธะเท่านั้น^{[ 19 ]}

วิธีการเหล่านี้สร้างความสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสที่อยู่ใกล้กันทางกายภาพ โดยไม่คำนึงถึงว่าจะมีพันธะระหว่างกันหรือไม่ วิธีการเหล่านี้ใช้ปรากฏการณ์นิวเคลียร์โอเวอร์เฮาเซอร์ (NOE) ซึ่งอะตอมที่อยู่ใกล้เคียงกัน (ภายในระยะประมาณ 5 อังสตรอม) จะเกิดการผ่อนคลายแบบไขว้กันโดยกลไกที่เกี่ยวข้องกับการผ่อนคลายแบบสปิน-แลตติส

ใน NOESY การผ่อนคลายแบบไขว้ของนิวเคลียร์โอเวอร์เฮาเซอร์ระหว่างสปินนิวเคลียร์ในช่วงเวลาการผสมจะใช้เพื่อสร้างความสัมพันธ์ สเปกตรัมที่ได้จะคล้ายกับ COSY โดยมีพีคแนวทแยงและพีคไขว้ อย่างไรก็ตาม พีคไขว้จะเชื่อมต่อเรโซแนนซ์จากนิวเคลียสที่อยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่มากกว่านิวเคลียสที่เชื่อมต่อกันผ่านพันธะ สเปกตรัม NOESY ยังมีพีคแกน พิเศษ ซึ่งไม่ได้ให้ข้อมูลเพิ่มเติมและสามารถกำจัดได้โดยการทดลองอื่นโดยการกลับเฟสของพัลส์แรก^{[ 20 ]}

หนึ่งในแอปพลิเคชันของ NOESY คือการศึกษาโมเลกุลชีวภาพขนาดใหญ่ เช่น ในNMR ของโปรตีนซึ่งความสัมพันธ์ต่างๆ มักสามารถกำหนดได้โดยใช้การเดินตามลำดับ

การทดลอง NOESY สามารถทำได้ในรูปแบบหนึ่งมิติโดยการเลือกเรโซแนนซ์แต่ละตัวล่วงหน้า สเปกตรัมจะถูกอ่านโดยนิวเคลียสที่เลือกไว้ล่วงหน้าจะให้สัญญาณลบขนาดใหญ่ ในขณะที่นิวเคลียสข้างเคียงจะถูกระบุด้วยสัญญาณบวกที่อ่อนกว่า วิธีนี้จะแสดงเฉพาะยอดพีคที่มี NOE ที่วัดได้กับเรโซแนนซ์ที่สนใจ แต่ใช้เวลาน้อยกว่าการทดลองแบบสองมิติเต็มรูปแบบมาก นอกจากนี้ หากนิวเคลียสที่เลือกไว้ล่วงหน้าเปลี่ยนสภาพแวดล้อมภายในช่วงเวลาของการทดลอง อาจสังเกตเห็นสัญญาณลบหลายสัญญาณ ซึ่งให้ข้อมูลการแลกเปลี่ยนที่คล้ายกับวิธีการ EXSY (exchange spectroscopy) NMR

การทดลอง NOESY เป็นเครื่องมือสำคัญในการระบุสเตอริโอเคมีของโมเลกุลในตัวทำละลาย ในขณะที่ XRD ผลึกเดี่ยวใช้ในการระบุสเตอริโอเคมีของโมเลกุลในรูปของแข็ง

ใน HOESY เช่นเดียวกับ NOESY ใช้สำหรับการผ่อนคลายแบบไขว้ระหว่างสปินนิวเคลียร์ อย่างไรก็ตาม HOESY สามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับนิวเคลียสแอคทีฟ NMR อื่นๆ ในลักษณะที่เกี่ยวข้องกับตำแหน่งเชิงพื้นที่ ตัวอย่างเช่น นิวเคลียสใดๆ X{Y} หรือ X→Y เช่น¹ H→ ¹³ C, ¹⁹ F→ ¹³ C, ³¹ P→ ¹³ C หรือ⁷⁷ Se→ ¹³ C การทดลองมักจะสังเกต NOE จากโปรตอนบน X, X{ ¹ H} แต่ไม่จำเป็นต้องรวมโปรตอนด้วย^{[ 21 ]}

ROESY คล้ายกับ NOESY ยกเว้นสถานะเริ่มต้นที่แตกต่างกัน แทนที่จะสังเกตการผ่อนคลายแบบไขว้จากสถานะเริ่มต้นของ สนามแม่เหล็ก z สนาม แม่เหล็กสมดุลจะถูกหมุนไปที่ แกน xจากนั้นล็อคสปินด้วยสนามแม่เหล็กภายนอกเพื่อไม่ให้เกิดการหมุนวน วิธีนี้มีประโยชน์สำหรับโมเลกุลบางชนิดที่มีเวลาสัมพันธ์การหมุนอยู่ในช่วงที่ผลกระทบของนิวเคลียร์โอเวอร์เฮาเซอร์อ่อนเกินกว่าจะตรวจจับได้ โดยปกติจะเป็นโมเลกุลที่มีมวลโมเลกุลประมาณ 1000 ดาลตันเนื่องจาก ROESY มีความสัมพันธ์ที่แตกต่างกันระหว่างเวลาสัมพันธ์และค่าคงที่อัตราการผ่อนคลายแบบไขว้ ใน NOESY ค่าคงที่อัตราการผ่อนคลายแบบไขว้จะเปลี่ยนจากบวกเป็นลบเมื่อเวลาสัมพันธ์เพิ่มขึ้น ทำให้ได้ช่วงที่ค่าอยู่ใกล้ศูนย์ ในขณะที่ใน ROESY ค่าคงที่อัตราการผ่อนคลายแบบไขว้จะเป็นบวกเสมอ^{[ 22 ] [ 23 ]}

บางครั้ง ROESY เรียกว่า "การผ่อนคลายแบบไขว้ที่เหมาะสมสำหรับโมเลกุลขนาดเล็กที่จำลองโดยสปินที่ล็อกไว้" (CAMELSPIN) ^{[ 23 ]}

แตกต่างจากสเปกตรัมที่สัมพันธ์กัน สเปกตรัมที่แยกได้จะกระจายยอดในการทดลอง 1D-NMR ออกเป็นสองมิติโดยไม่เพิ่มยอดพิเศษใดๆ วิธีการเหล่านี้มักเรียกว่าสเปกโทรสโกปีแบบ J-resolved แต่บางครั้งก็เรียกว่าสเปกโทรสโกปีแบบแยกค่าเคมีชิฟต์หรือสเปกโทรสโกปีแบบ δ-resolved วิธีการเหล่านี้มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โมเลกุลที่สเปกตรัม 1D-NMR มีมัลติเพล็ตที่ทับซ้อนกัน เนื่องจากสเปกตรัมแบบ J-resolved จะเลื่อนมัลติเพล็ตจากนิวเคลียสแต่ละตัวในแนวตั้งด้วยปริมาณที่แตกต่างกัน ยอดแต่ละยอดในสเปกตรัม 2D จะมีพิกัดแนวนอนเดียวกันกับที่มีในสเปกตรัม 1D ที่ไม่ได้แยก แต่พิกัดแนวตั้งจะเป็นค่าเคมีชิฟต์ของยอดเดี่ยวที่นิวเคลียสมีในสเปกตรัม 1D ที่แยกแล้ว^{[ 24 ]}

สำหรับเวอร์ชันเฮเทอโรนิวเคลียร์ ลำดับพัลส์ที่ง่ายที่สุดที่ใช้เรียกว่าการทดลอง Müller–Kumar–Ernst (MKE) ซึ่งมีพัลส์ 90° เดียวสำหรับเฮเทอโรนิวเคลียร์ในช่วงเตรียมการ ไม่มีช่วงการผสม และใช้สัญญาณแยกส่วนกับโปรตอนในช่วงการตรวจจับ มีรูปแบบต่างๆ ของลำดับพัลส์นี้ซึ่งมีความไวและแม่นยำกว่า ซึ่งจัดอยู่ในหมวดหมู่ของวิธีการแยกส่วนแบบเกตและวิธีการพลิกสปินสเปกโทรสโกปีแบบโฮโมโนเคลียร์ J-resolved ใช้ลำดับพัลส์สปินเอคโค^{[ 24 ]}

สามารถทำการทดลองแบบ 3 มิติและ 4 มิติได้เช่นกัน บางครั้งโดยการใช้ลำดับพัลส์จากการทดลองแบบ 2 มิติสองหรือสามครั้งเรียงต่อกัน อย่างไรก็ตาม การทดลองแบบ 3 มิติที่ใช้กันทั่วไปส่วนใหญ่เป็นการทดลองแบบไตรเรโซแนน ซ์ ตัวอย่างเช่น การทดลอง HNCAและHNCOCAซึ่งมักใช้ในNMR ของโปรตีน

• การวิเคราะห์ความสัมพันธ์แบบสองมิติ