กลับไปหน้าบทความ

อ่าน 12 นาที

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ (หรือที่รู้จักกันทั่วไปว่าชิปดีเอ็นเอหรือไบโอชิป ) คือชุดของจุดดีเอ็นเอ ขนาดเล็กมากที่ติดอยู่บนพื้นผิวแข็ง นักวิทยาศาสตร์ใช้ ไมโครอาร์เรย์ ดีเอ็นเอ เพื่อวัด..

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ

วิธีการใช้ไมโครอาร์เรย์สำหรับการตรวจหาจีโนไทป์วิดีโอนี้แสดงกระบวนการสกัดจีโนไทป์จากตัวอย่างน้ำลายมนุษย์โดยใช้ไมโครอาร์เรย์ การตรวจหาจีโนไทป์เป็นประโยชน์หลักของการใช้ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ แต่ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ก็สามารถนำไปใช้เพื่อวัตถุประสงค์อื่น ๆ ได้เช่นกัน เช่น การวัดการแสดงออกของยีนและเครื่องหมายทางเอพิเจเนติกส์

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ (หรือที่รู้จักกันทั่วไปว่าชิปดีเอ็นเอหรือไบโอชิป ) คือชุดของจุดดีเอ็นเอ ขนาดเล็กมากที่ติดอยู่บนพื้นผิวแข็ง นักวิทยาศาสตร์ใช้ ไมโครอาร์เรย์ ดีเอ็นเอ เพื่อวัด ระดับ การแสดงออกของยีนจำนวนมากพร้อมกัน หรือเพื่อระบุจีโนไทป์ของหลายบริเวณในจีโนม จุดดีเอ็นเอแต่ละจุดประกอบด้วยพิโคโมล (10 −12 โมล ) ของลำดับดีเอ็นเอเฉพาะที่เรียกว่าโพรบ (หรือรีพอร์เตอร์หรือโอลิโก ) โพรบเหล่านี้อาจเป็นส่วนสั้น ๆ ของยีนหรือองค์ประกอบดีเอ็นเออื่น ๆ ที่ใช้ในการไฮบริดกับ ตัวอย่าง ซีดีเอ็นเอหรือซีอาร์เอ็นเอ (เรียกอีกอย่างว่า RNA แอนติเซนส์) (เรียกว่าเป้าหมาย ) ภายใต้สภาวะที่มีความเข้มงวดสูง การไฮบริดระหว่างโพรบและเป้าหมายมักจะถูกตรวจจับและวัดปริมาณโดยการตรวจจับเป้าหมายที่ติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์เงิน หรือ เคมี เรืองแสงเพื่อกำหนดความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของลำดับกรดนิวคลีอิกในเป้าหมาย อาร์เรย์กรดนิวคลีอิกดั้งเดิมเป็นอาร์เรย์ขนาดใหญ่ประมาณ 9 ซม. × 12 ซม. และการวิเคราะห์ภาพด้วยคอมพิวเตอร์ครั้งแรกได้รับการตีพิมพ์ในปี 1981 [ 1 ]คิดค้นโดยPatrick O. Brownตัวอย่างการประยุกต์ใช้คือในอาร์เรย์ SNP สำหรับโพลีมอร์ฟิซึมในโรคหัวใจและหลอดเลือด มะเร็ง เชื้อโรค และการวิเคราะห์ GWAS นอกจากนี้ยังใช้สำหรับการระบุความแปรผันของโครงสร้างและการวัดการแสดงออกของยีน

หลักการ

การจับคู่ของเป้าหมายกับโพรบ

หลักการสำคัญของไมโครอาร์เรย์คือการไฮบริดไดเซชันระหว่างสายดีเอ็นเอสองสาย ซึ่งเป็นคุณสมบัติของ ลำดับกรดนิวคลีอิก ที่เสริมกันในการจับคู่กันอย่างจำเพาะเจาะจงโดยการสร้างพันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบสของนิวคลีโอไทด์ที่เสริมกัน จำนวนคู่เบสที่เสริมกันจำนวนมากในลำดับนิวคลีโอไทด์หมายถึง พันธะ ที่ไม่ใช่โคเวเลนต์ ที่แน่นกว่า ระหว่างสองสาย หลังจากล้างลำดับพันธะที่ไม่จำเพาะออกไปแล้ว จะมีเพียงสายที่จับคู่กันอย่างแข็งแรงเท่านั้นที่จะยังคงไฮบริดไดซ์อยู่ ลำดับเป้าหมายที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์ซึ่งจับกับลำดับโพรบจะสร้างสัญญาณที่ขึ้นอยู่กับสภาวะการไฮบริดไดเซชัน (เช่น อุณหภูมิ) และการล้างหลังการไฮบริดไดเซชัน ความแรงโดยรวมของสัญญาณจากจุด (คุณลักษณะ) ขึ้นอยู่กับปริมาณของตัวอย่างเป้าหมายที่จับกับโพรบที่มีอยู่บนจุดนั้น ไมโครอาร์เรย์ใช้การวัดปริมาณแบบสัมพัทธ์ซึ่งความเข้มของคุณลักษณะหนึ่งจะถูกเปรียบเทียบกับความเข้มของคุณลักษณะเดียวกันภายใต้สภาวะที่แตกต่างกัน และเอกลักษณ์ของคุณลักษณะนั้นทราบได้จากตำแหน่งของมัน

ขั้นตอนที่จำเป็นในการทดลองไมโครอาร์เรย์

การใช้งานและประเภท

ชิป Affymetrix สองชิ้นชิ้นที่ตรงกันแสดงอยู่ด้านล่างซ้ายเพื่อเปรียบเทียบขนาด

มีอาร์เรย์หลายประเภท และความแตกต่างที่สำคัญที่สุดคือ อาร์เรย์เหล่านั้นจัดเรียงอยู่บนพื้นผิวหรือบนลูกปัดที่มีรหัส:

  • อาร์เรย์แบบโซลิดเฟสแบบดั้งเดิมคือชุดของ "จุด" ขนาดเล็กที่เป็นระเบียบ เรียกว่า "ฟีเจอร์" แต่ละฟีเจอร์มีโพรบที่เหมือนกันและเฉพาะเจาะจงหลายพันตัวติดอยู่กับพื้นผิวแข็ง เช่นแก้ว พลาสติกหรือซิลิคอนไบโอชิป (ที่รู้จักกันทั่วไปในชื่อชิปจีโนมชิปดีเอ็นเอหรืออาร์เรย์ยีน ) ฟีเจอร์เหล่านี้หลายพันตัวสามารถวางในตำแหน่งที่ทราบบนไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอเดียวได้
  • ชุดลูกปัดทางเลือกนี้เป็นชุดของลูกปัดโพลีสไตรีนขนาดเล็กมาก แต่ละลูกปัดมีโพรบเฉพาะและอัตราส่วนของสีย้อมสองชนิดขึ้นไป ซึ่งจะไม่รบกวนสีย้อมเรืองแสงที่ใช้กับลำดับเป้าหมาย

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอสามารถใช้ตรวจจับดีเอ็นเอ (เช่น ในการผสมแบบเปรียบเทียบจีโนม ) หรือตรวจจับอาร์เอ็นเอ (ส่วนใหญ่เป็นซีดีเอ็นเอหลังจากการถอดรหัสย้อนกลับ ) ซึ่งอาจจะถูกแปลเป็นโปรตีนหรือไม่ก็ได้ กระบวนการวัดการแสดงออกของยีนผ่านซีดีเอ็นเอเรียกว่าการวิเคราะห์การแสดงออกหรือการ สร้างโปรไฟล์การแสดงออก

แอปพลิเคชันต่างๆ ได้แก่:

แอปพลิเคชันหรือเทคโนโลยี เรื่องย่อ
การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในการทดลอง การสร้างโปรไฟล์การแสดงออกของ mRNAหรือยีน จะมีการตรวจสอบระดับ การแสดงออกของยีนหลายพันยีนพร้อมกัน เพื่อศึกษาผลกระทบของการรักษาโรคและระยะพัฒนาการบางอย่างต่อการแสดงออกของยีน ตัวอย่างเช่น การสร้างโปรไฟล์การแสดงออกของยีนโดยใช้ไมโครอาร์เรย์สามารถใช้เพื่อระบุยีนที่มีการแสดงออกเปลี่ยนแปลงไปตามเชื้อโรคหรือสิ่งมีชีวิตอื่นๆ โดยการเปรียบเทียบการแสดงออกของยีนในเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อกับเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่ไม่ติดเชื้อ[ 2 ]
การผสมพันธุ์จีโนมเชิงเปรียบเทียบการประเมินเนื้อหาจีโนมในเซลล์ต่างๆ หรือสิ่งมีชีวิตที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด ตามที่ Patrick Brown , Jonathan Pollack, Ash Alizadehและเพื่อนร่วมงานที่Stanfordได้อธิบายไว้แต่เดิม[ 3 ] [ 4 ]
ยีนไอดี ไมโครอาร์เรย์ขนาดเล็กใช้ตรวจสอบรหัสประจำตัวของสิ่งมีชีวิตในอาหารและอาหารสัตว์ (เช่นGMO [1] ) ไมโคพลาสมาในวัฒนธรรมเซลล์ หรือเชื้อโรคเพื่อตรวจหาโรค โดยส่วนใหญ่จะรวม เทคโนโลยี PCRและไมโครอาร์เรย์ เข้าด้วยกัน
การตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกันบนชิปลำดับดีเอ็นเอที่จับกับโปรตีนเฉพาะสามารถแยกได้โดยการทำอิมมูโนพรีซิปิเทชันของโปรตีนนั้น ( ChIP ) จากนั้นชิ้นส่วนเหล่านี้สามารถนำไปไฮบริดกับไมโครอาร์เรย์ (เช่นไทล์อาร์เรย์ ) ซึ่งช่วยให้สามารถกำหนดความหนาแน่นของตำแหน่งการจับของโปรตีนทั่วทั้งจีโนมได้ ตัวอย่างโปรตีนที่ใช้ใน การทำ อิมมูโนพรีซิปิเทชันได้แก่ การดัดแปลงฮิสโตน ( H3K27me3 , H3K4me2, H3K9me3 เป็นต้น) โปรตีนกลุ่มโพลีคอมบ์ (PRC2:Suz12, PRC1:YY1) และโปรตีนกลุ่มไตรทอแรกซ์ (Ash1) เพื่อศึกษาภูมิทัศน์ทางเอพิเจเนติกส์หรืออาร์เอ็นเอพอลิเมอเรส IIเพื่อ ศึกษาภูมิทัศน์การถอดรหัส
ดามไอดีในทำนองเดียวกันกับChIPบริเวณจีโนมที่โปรตีนที่สนใจจับอยู่สามารถแยกออกมาและนำมาใช้ตรวจสอบไมโครอาร์เรย์เพื่อกำหนดการครอบครองตำแหน่งการจับได้ แต่แตกต่างจาก ChIP ตรงที่ DamID ไม่จำเป็นต้องใช้แอนติบอดี แต่ใช้การเติมหมู่เมทิลของอะดีนีนใกล้กับตำแหน่งการจับของโปรตีนเพื่อขยายบริเวณเหล่านั้นอย่างเลือกสรร โดยการแสดงออกของโปรตีนที่สนใจในปริมาณเล็กน้อยที่เชื่อมต่อกับเอนไซม์อะดีนีนเมทิลทรานสเฟอเรสของ แบคทีเรียในดีเอ็นเอ
การตรวจจับ SNPการระบุโพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยวในหมู่แอลลีลภายในหรือระหว่างประชากร[ 5 ]การประยุกต์ใช้ไมโครอาร์เรย์หลายอย่างใช้ประโยชน์จากการตรวจจับ SNP รวมถึง การกำหนด จีโนไทป์ การวิเคราะห์ ทางนิติวิทยาศาสตร์การวัดความเสี่ยงต่อโรค การระบุตัวยาที่เหมาะสม การประเมิน การกลายพันธุ์ ของเซลล์สืบพันธุ์ในบุคคลหรือการ กลายพันธุ์ของเซลล์ ร่างกายในมะเร็ง การประเมินการสูญเสียเฮเทอโรไซโกซิตีหรือการวิเคราะห์ การเชื่อมโยงทางพันธุกรรม
การตรวจ จับการตัดต่อทางเลือกการออกแบบ อาร์เรย์เชื่อมต่อเอ็กซอนใช้โพรบที่จำเพาะต่อตำแหน่งการเชื่อมต่อที่คาดการณ์ไว้หรือที่อาจเกิดขึ้นได้ของเอ็กซอน ที่ทำนายไว้ สำหรับยีน มีความหนาแน่นหรือความครอบคลุมระดับปานกลางระหว่างอาร์เรย์การแสดงออกของยีนทั่วไป (มี 1-3 โพรบต่อยีน) และอาร์เรย์การเรียงตัวของจีโนม (มีหลายร้อยหรือหลายพันโพรบต่อยีน) ใช้ในการตรวจสอบการแสดงออกของรูปแบบการเชื่อมต่อทางเลือกของยีนอาร์เรย์เอ็กซอนมีการออกแบบที่แตกต่างออกไป โดยใช้โพรบที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับเอ็กซอนแต่ละตัวสำหรับยีนที่ทราบหรือคาดการณ์ไว้ และสามารถใช้ในการตรวจจับไอโซฟอร์มการเชื่อมต่อที่แตกต่างกันได้
ไมโครอาร์เรย์ ยีนฟิวชั่ นไมโครอาร์เรย์ยีนลูกผสมสามารถตรวจจับทรานสคริปต์ลูกผสมได้เช่นจากตัวอย่างมะเร็ง หลักการเบื้องหลังคือการต่อยอดจาก ไมโครอาร์เรย์ การตัดต่อทางเลือกกลยุทธ์การออกแบบโอลิโกทำให้สามารถวัดจุดเชื่อมต่อทรานสคริปต์ไคเมอริกควบคู่ไปกับการวัดแต่ละเอ็กซอนของคู่ผสมแต่ละตัวได้
อาร์เรย์กระเบื้องอาร์เรย์ไทล์จีโนมประกอบด้วยโพรบที่ซ้อนทับกันซึ่งออกแบบมาเพื่อแสดงถึงบริเวณจีโนมที่สนใจอย่างหนาแน่น บางครั้งอาจมีขนาดใหญ่เท่ากับโครโมโซมของมนุษย์ทั้งหมด จุดประสงค์คือเพื่อตรวจจับการแสดงออกของทรานสคริปต์หรือรูปแบบการตัดต่อทางเลือกที่อาจไม่เคยทราบหรือคาดการณ์มาก่อน
ไมโครอาร์เรย์ B-DNA สองสาย ไมโครอาร์เรย์ B-DNA สองสายแบบมือขวาสามารถใช้ในการระบุลักษณะของยาและสารชีวภาพใหม่ๆ ที่สามารถนำมาใช้ในการจับกับบริเวณเฉพาะของ DNA สองสายที่ตรึงอยู่กับที่และสมบูรณ์ วิธีนี้สามารถใช้เพื่อยับยั้งการแสดงออกของยีนได้[ 6 ] [ 7 ]นอกจากนี้ยังช่วยให้สามารถระบุลักษณะโครงสร้างภายใต้สภาวะแวดล้อมต่างๆ ได้อีกด้วย
ไมโครอาร์เรย์ Z-DNA สองสาย ไมโครอาร์เรย์ Z-DNA แบบสองสายมือซ้ายสามารถใช้เพื่อระบุลำดับสั้น ๆ ของโครงสร้าง Z-DNA ทางเลือกที่ตั้งอยู่ภายในส่วนยาวของยีน B-DNA มือขวา (เช่น การเพิ่มประสิทธิภาพการถอดรหัส การรวมตัวใหม่ การแก้ไข RNA) [ 6 ] [ 7 ]ไมโครอาร์เรย์ยังช่วยให้สามารถกำหนดลักษณะโครงสร้างของพวกมันภายใต้สภาวะแวดล้อมที่แตกต่างกันได้
ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอหลายสาย (ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอแบบไตรเพล็กซ์และไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอแบบควอดรูเพล็กซ์) ไมโครอาร์เรย์ DNA และ RNA หลายสายสามารถใช้เพื่อระบุยาใหม่ที่จับกับลำดับกรดนิวคลีอิกหลายสายเหล่านี้ แนวทางนี้สามารถใช้เพื่อค้นพบยาและสารชีวภาพใหม่ที่มีความสามารถในการยับยั้งการแสดงออกของยีน[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]ไมโครอาร์เรย์เหล่านี้ยังช่วยให้สามารถกำหนดลักษณะโครงสร้างภายใต้สภาวะแวดล้อมที่แตกต่างกันได้

อาร์เรย์เฉพาะที่ปรับให้เหมาะกับพืช บางชนิด กำลังได้รับความนิยมมากขึ้นเรื่อยๆ ใน การประยุกต์ใช้ การผสมพันธุ์ระดับโมเลกุลในอนาคตอาจใช้อาร์เรย์เหล่านี้เพื่อคัดกรองต้นกล้าในระยะเริ่มต้นเพื่อลดจำนวนต้นกล้าที่ไม่จำเป็นที่นำมาทดลองในการผสมพันธุ์[ 10 ]

การผลิต

ไมโครอาร์เรย์สามารถผลิตได้หลายวิธี ขึ้นอยู่กับจำนวนโพรบที่กำลังตรวจสอบ ต้นทุน ข้อกำหนดในการปรับแต่ง และประเภทของคำถามทางวิทยาศาสตร์ที่ต้องการค้นหา อาร์เรย์จากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์อาจมีโพรบเพียง 10 ตัว หรือมากถึง 5 ล้านตัวหรือมากกว่านั้น ในระดับไมโครเมตร

อาร์เรย์ แบบจุดเทียบกับอาร์เรย์ที่สังเคราะห์ในแหล่งกำเนิด

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอที่กำลังพิมพ์โดยหุ่นยนต์มหาวิทยาลัยเดลาแวร์

ไมโครอาร์เรย์สามารถผลิตได้โดยใช้เทคโนโลยีที่หลากหลาย รวมถึงการพิมพ์ด้วยเข็มปลายแหลมลงบนแผ่นกระจกโฟโตลิโทกราฟีโดยใช้หน้ากากที่ทำไว้ล่วงหน้า โฟโตลิโทกราฟีโดยใช้อุปกรณ์ไมโครมิเรอร์แบบไดนามิก การพิมพ์อิงค์เจ็ท[ 11 ] [ 12 ]หรืออิเล็กโทรเคมีบนอาร์เรย์ไมโครอิเล็กโทรด

ในไมโครอาร์เรย์แบบจุดโพรบจะเป็นโอลิโกนิวคลีโอไทด์ ซีดีเอ็นเอหรือชิ้นส่วนเล็กๆ ของ ผลิตภัณฑ์ PCRที่สอดคล้อง กับ เอ็มอาร์เอ็นเอโพรบจะถูกสังเคราะห์ขึ้นก่อนที่จะนำไปวางบนพื้นผิวอาร์เรย์ แล้วจึง "จุด" ลงบนกระจก วิธีการทั่วไปคือการใช้เข็มหรือหมุดขนาดเล็กจำนวนมากที่ควบคุมโดยแขนหุ่นยนต์ ซึ่งจะจุ่มลงในหลุมที่มีโพรบดีเอ็นเอ แล้วจึงวางโพรบแต่ละตัวในตำแหน่งที่กำหนดบนพื้นผิวอาร์เรย์ "ตาราง" ของโพรบที่ได้จะแสดงถึงโปรไฟล์กรดนิวคลีอิกของโพรบที่เตรียมไว้ และพร้อมที่จะรับ "เป้าหมาย" ซีดีเอ็นเอหรือซีอาร์เอ็นเอที่เสริมกันซึ่งได้มาจากตัวอย่างทดลองหรือตัวอย่างทางคลินิก เทคนิคนี้ถูกใช้โดยนักวิทยาศาสตร์วิจัยทั่วโลกเพื่อผลิตไมโครอาร์เรย์แบบพิมพ์ "ภายใน" ในห้องปฏิบัติการของตนเอง อาร์เรย์เหล่านี้สามารถปรับแต่งได้อย่างง่ายดายสำหรับแต่ละการทดลอง เนื่องจากนักวิจัยสามารถเลือกโพรบและตำแหน่งการพิมพ์บนอาร์เรย์ สังเคราะห์โพรบในห้องปฏิบัติการของตนเอง (หรือสถานที่ที่ร่วมมือ) และจุดลงบนอาร์เรย์ได้ จากนั้นพวกเขาสามารถสร้างตัวอย่างที่มีฉลากของตนเองสำหรับการไฮบริดไดเซชัน ไฮบริดไดเซชันตัวอย่างกับอาร์เรย์ และสุดท้ายสแกนอาร์เรย์ด้วยอุปกรณ์ของตนเอง วิธีนี้ทำให้ได้ไมโครอาร์เรย์ที่มีต้นทุนค่อนข้างต่ำซึ่งสามารถปรับแต่งได้สำหรับการศึกษาแต่ละครั้ง และหลีกเลี่ยงค่าใช้จ่ายในการซื้ออาร์เรย์เชิงพาณิชย์ที่มีราคาแพงกว่าซึ่งอาจมีจำนวนยีนมากมายที่นักวิจัยไม่สนใจ มีเอกสารเผยแพร่ที่ระบุว่าไมโครอาร์เรย์แบบจุดภายในองค์กรอาจไม่ให้ความไวในระดับเดียวกันเมื่อเทียบกับอาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์เชิงพาณิชย์[ 13 ]อาจเนื่องมาจากขนาดชุดเล็กและประสิทธิภาพการพิมพ์ที่ลดลงเมื่อเทียบกับการผลิตอาร์เรย์โอลิโกในระดับอุตสาหกรรม

ในไมโครอาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ โพรบคือลำดับสั้นๆ ที่ออกแบบมาเพื่อให้ตรงกับส่วนต่างๆ ของลำดับของกรอบการอ่านแบบ เปิดที่ทราบหรือคาดการณ์ไว้ แม้ว่าโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์มักจะใช้ในไมโครอาร์เรย์แบบ "จุด" แต่คำว่า "อาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์" มักหมายถึงเทคนิคการผลิตเฉพาะอย่างหนึ่ง อาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ผลิตขึ้นโดยการพิมพ์ลำดับโอลิโกนิวคลีโอไทด์สั้นๆ ที่ออกแบบมาเพื่อแสดงถึงยีนเดี่ยวหรือกลุ่มของยีนที่มีการตัดต่อแบบแปรผัน โดยการสังเคราะห์ลำดับนี้โดยตรงบนพื้นผิวของอาร์เรย์แทนที่จะวางลำดับที่สมบูรณ์ ลำดับอาจยาวกว่า (โพรบ 60 เมอร์ เช่น การออกแบบของ Agilent ) หรือสั้นกว่า (โพรบ 25 เมอร์ ที่ผลิตโดยAffymetrix ) ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ที่ต้องการ โพรบที่ยาวกว่าจะมีความจำเพาะต่อยีนเป้าหมายแต่ละตัวมากกว่า โพรบที่สั้นกว่าอาจถูกวางในความหนาแน่นที่สูงกว่าทั่วทั้งอาร์เรย์และมีต้นทุนการผลิตที่ถูกกว่า เทคนิคหนึ่งที่ใช้ในการผลิตอาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ ได้แก่การสังเคราะห์โฟโตลิโทกราฟี (Affymetrix) บนพื้นผิวซิลิกา โดยใช้แสงและสารปิดบังที่ไวต่อแสงเพื่อ "สร้าง" ลำดับนิวคลีโอไทด์ทีละตัวทั่วทั้งอาร์เรย์ [ 14 ]โพรบที่เหมาะสมแต่ละตัวจะถูก "เปิดเผย" อย่างเลือกสรรก่อนที่จะแช่อาร์เรย์ในสารละลายของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว จากนั้นปฏิกิริยาการปิดบังจะเกิดขึ้น และชุดโพรบถัดไปจะถูกเปิดเผยเพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการสัมผัสกับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกัน หลังจากทำซ้ำหลายครั้ง ลำดับของโพรบทุกตัวจะถูกสร้างขึ้นอย่างสมบูรณ์ เมื่อไม่นานมานี้ การสังเคราะห์อาร์เรย์แบบไร้หน้ากากจาก NimbleGen Systems ได้รวมความยืดหยุ่นเข้ากับจำนวนโพรบจำนวนมาก[ 15 ]

การตรวจจับแบบสองช่องสัญญาณเทียบกับการตรวจจับแบบช่องสัญญาณเดียว

แผนภาพแสดง การทดลองไมโครอาร์เรย์สองสีทั่วไป

โดยทั่วไปแล้ว ไมโครอาร์เรย์สองสีหรือไมโครอาร์เรย์สองช่องจะถูกไฮบริดกับ cDNA ที่เตรียมจากตัวอย่างสองตัวอย่างที่จะนำมาเปรียบเทียบ (เช่น เนื้อเยื่อที่เป็นโรคเทียบกับเนื้อเยื่อที่แข็งแรง) และติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์สอง ชนิดที่แตกต่างกัน [ 16 ] สีย้อม เรืองแสงที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการติดฉลาก cDNA ได้แก่Cy 3 ซึ่งมีความยาวคลื่นการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ 570 นาโนเมตร (ตรงกับส่วนสีเขียวของสเปกตรัมแสง) และCy 5 ซึ่งมีความยาวคลื่นการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ 670 นาโนเมตร (ตรงกับส่วนสีแดงของสเปกตรัมแสง) ตัวอย่าง cDNA ที่ติดฉลาก Cy ทั้งสองตัวอย่างจะถูกผสมและไฮบริดกับไมโครอาร์เรย์เดียว จากนั้นจึงสแกนในเครื่องสแกนไมโครอาร์เรย์เพื่อแสดงภาพฟลูออเรสเซนต์ของฟลูออโรฟอร์ทั้งสองหลังจากกระตุ้นด้วย ลำแสง เลเซอร์ที่มีความยาวคลื่นที่กำหนด ความเข้มสัมพัทธ์ของฟลูออโรฟอร์แต่ละตัวอาจถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ตามอัตราส่วนเพื่อระบุยีนที่ถูกควบคุมขึ้นและควบคุมลง[ 17 ]

ไมโครอาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์มักมีโพรบควบคุมที่ออกแบบมาเพื่อจับคู่กับRNA spike-insระดับการจับคู่ระหว่าง spike-ins และโพรบควบคุมจะถูกนำมาใช้ในการปรับค่าการวัดการจับคู่สำหรับโพรบเป้าหมาย แม้ว่าในบางกรณีอาจสามารถกำหนดระดับการแสดงออกของยีนแบบสัมบูรณ์ได้ในอาร์เรย์สองสี แต่ความแตกต่างสัมพัทธ์ในการแสดงออกระหว่างจุดต่างๆ ภายในตัวอย่างและระหว่างตัวอย่างนั้นเป็นวิธีการวิเคราะห์ข้อมูล ที่นิยมใช้ สำหรับระบบสองสี ตัวอย่างผู้ให้บริการไมโครอาร์เรย์ดังกล่าว ได้แก่Agilentกับแพลตฟอร์ม Dual-Mode, Eppendorfกับแพลตฟอร์ม DualChip สำหรับ การติดฉลาก Silverquant แบบวัดสี และ TeleChem International กับ Arrayit

ในไมโครอาร์เรย์แบบช่องสัญญาณเดียวหรือไมโครอาร์เรย์แบบสีเดียวอาร์เรย์จะให้ข้อมูลความเข้มสำหรับแต่ละโพรบหรือชุดโพรบ ซึ่งบ่งชี้ระดับการไฮบริดไดเซชันสัมพัทธ์กับเป้าหมายที่ติดฉลาก อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเหล่านี้ไม่ได้บ่งชี้ระดับความอุดมสมบูรณ์ของยีนอย่างแท้จริง แต่บ่งชี้ถึงความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์เมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างหรือสภาวะอื่นๆ เมื่อทำการทดลองเดียวกัน โมเลกุล RNA แต่ละโมเลกุลจะพบกับอคติเฉพาะโปรโตคอลและชุดการผลิตในระหว่างขั้นตอนการขยาย การติดฉลาก และการไฮบริดไดเซชันของการทดลอง ทำให้การเปรียบเทียบระหว่างยีนในไมโครอาร์เรย์เดียวกันไม่ให้ข้อมูลที่เป็นประโยชน์ การเปรียบเทียบสองสภาวะสำหรับยีนเดียวกันต้องใช้การไฮบริดไดเซชันแบบสีเดียวสองครั้งแยกกัน ระบบไมโครอาร์เรย์แบบช่องสัญญาณเดียวที่เป็นที่นิยม ได้แก่ Affymetrix "Gene Chip", Illumina "Bead Chip", อาร์เรย์แบบช่องสัญญาณเดียวของ Agilent, อาร์เรย์ "CodeLink" ของ Applied Microarrays และ Eppendorf "DualChip & Silverquant" ข้อดีอย่างหนึ่งของระบบย้อมสีเดียวคือ ตัวอย่างที่ผิดปกติจะไม่ส่งผลกระทบต่อข้อมูลดิบที่ได้จากตัวอย่างอื่นๆ เนื่องจากชิปอาร์เรย์แต่ละชิ้นสัมผัสกับตัวอย่างเพียงตัวอย่างเดียวเท่านั้น (ตรงข้ามกับระบบสองสี ซึ่งตัวอย่างคุณภาพต่ำเพียงตัวอย่างเดียวอาจส่งผลกระทบอย่างมากต่อความแม่นยำของข้อมูลโดยรวม แม้ว่าตัวอย่างอื่นๆ จะมีคุณภาพสูงก็ตาม) ข้อดีอีกประการหนึ่งคือ ข้อมูลสามารถเปรียบเทียบได้ง่ายขึ้นระหว่างอาร์เรย์จากการทดลองต่างๆ ตราบใดที่ได้คำนึงถึงผลกระทบจากชุดการทดลองแล้ว

ในบางสถานการณ์ ไมโครอาร์เรย์แบบช่องสัญญาณเดียวอาจเป็นทางเลือกเดียว สมมติว่าจำเป็นต้องเปรียบเทียบตัวอย่าง จำนวนการทดลองที่จำเป็นหากใช้ไมโครอาร์เรย์แบบสองช่องสัญญาณจะเพิ่มขึ้นจนไม่สามารถทำได้จริง เว้นแต่จะใช้ตัวอย่างหนึ่งเป็นตัวอ้างอิง

จำนวนตัวอย่าง ไมโครอาร์เรย์ช่องเดียว ไมโครอาร์เรย์สองช่องสัญญาณ

ไมโครอาร์เรย์สองช่องสัญญาณ (พร้อมตัวอ้างอิง)

1 1 1 1
2 2 1 1
3 3 3 2
4 4 6 3

โปรโตคอลทั่วไป

ตัวอย่างระดับการประยุกต์ใช้ไมโครอาร์เรย์ภายในสิ่งมีชีวิต ยีนจะถูกถอดรหัสและตัดต่อเพื่อสร้าง mRNA ที่สมบูรณ์ (สีแดง) mRNA จะถูกสกัดจากสิ่งมีชีวิต และใช้เอนไซม์รีเวอร์สทรานสคริปเทสในการคัดลอก mRNA ให้เป็น ds-cDNA ที่เสถียร (สีน้ำเงิน) ในไมโครอาร์เรย์ ds-cDNA จะถูกทำให้แตกเป็นชิ้นเล็ก ๆ และติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (สีส้ม) ชิ้นส่วนที่ติดฉลากจะจับกับอาร์เรย์ของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่เสริมกัน และการวัดความเข้มของสารเรืองแสงทั่วทั้งอาร์เรย์จะบ่งชี้ถึงความอุดมสมบูรณ์ของชุดลำดับที่กำหนดไว้ล่วงหน้า โดยทั่วไปแล้วลำดับเหล่านี้จะถูกเลือกมาโดยเฉพาะเพื่อรายงานเกี่ยวกับยีนที่สนใจภายในจีโนมของสิ่งมีชีวิต[ 18 ]

นี่คือตัวอย่างของการทดลองไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอซึ่งมีรายละเอียดเฉพาะกรณีเพื่ออธิบายการทดลองไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอให้ดียิ่งขึ้น พร้อมทั้งระบุการปรับเปลี่ยนสำหรับการทดลองอาร์เอ็นเอหรือการทดลองทางเลือกอื่นๆ

  1. ตัวอย่างทั้งสองที่จะนำมาเปรียบเทียบกัน (การเปรียบเทียบแบบจับคู่) เป็นตัวอย่างที่ปลูก/ได้มา ในตัวอย่างนี้คือ ตัวอย่างที่ได้รับการบำบัด ( กรณีศึกษา ) และตัวอย่างที่ไม่ได้รับการบำบัด ( กลุ่มควบคุม )
  2. กรดนิวคลีอิกที่สนใจจะถูกทำให้บริสุทธิ์: ซึ่งอาจเป็นRNAสำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน , DNAสำหรับการเปรียบเทียบไฮบริดไดเซชันหรือ DNA/RNA ที่จับกับโปรตีน เฉพาะ ซึ่งถูก แยกด้วยวิธีอิมมูโนพรีซิ ปิเทชัน ( ChIP-on-chip ) สำหรับ การศึกษา ทางด้านเอพิเจเนติกส์หรือการควบคุม ในตัวอย่างนี้ RNA ทั้งหมดจะถูกแยกออกมา (ทั้งจากนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม ) โดย วิธี การสกัดด้วยกัวนิดิเนียมไทโอไซยาเนต-ฟีนอล-คลอโรฟอร์ม (เช่นTrizol ) ซึ่งสามารถแยก RNA ส่วนใหญ่ได้ (ในขณะที่วิธีการใช้คอลัมน์จะมีค่าตัดที่ 200 นิวคลีโอไทด์) และหากทำอย่างถูกต้องจะมีคุณภาพที่ดีกว่า
  3. นำ RNA ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์แล้วมาวิเคราะห์คุณภาพ (โดยวิธีอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบแคปิลลารี ) และปริมาณ (เช่น โดยใช้เครื่องสเปกโทรเมตรNanoDropหรือ NanoPhotometer ) หากวัสดุมีคุณภาพที่ยอมรับได้และมีปริมาณเพียงพอ (เช่น มากกว่า 1 ไมโครกรัมแม้ว่าปริมาณที่ต้องการจะแตกต่างกันไปตามแพลตฟอร์มไมโครอาร์เรย์) ก็สามารถดำเนินการทดลองต่อไปได้
  4. ผลิตภัณฑ์ที่ติดฉลากจะถูกสร้างขึ้นผ่านกระบวนการถอดรหัสย้อนกลับ (reverse transcription ) และตามด้วยการขยายสัญญาณด้วยวิธีPCR (หากจำเป็น) RNA จะถูกถอดรหัสย้อนกลับโดยใช้ไพรเมอร์ polyT (ซึ่งขยายสัญญาณเฉพาะmRNA เท่านั้น ) หรือไพรเมอร์แบบสุ่ม (ซึ่งขยายสัญญาณ RNA ทั้งหมด ส่วนใหญ่เป็นrRNA ) ไมโครอาร์เรย์ miRNAจะเชื่อมต่อโอลิโกนิวคลีโอไทด์เข้ากับ RNA ขนาดเล็กที่บริสุทธิ์แล้ว (แยกได้ด้วยเครื่องแยกส่วน) จากนั้นจึงทำการถอดรหัสย้อนกลับและขยายสัญญาณ
    • ฉลากจะถูกเพิ่มเข้าไปในระหว่างขั้นตอนการถอดรหัสย้อนกลับ หรือหลังจากการขยายสัญญาณหากมีการดำเนินการ การติดฉลาก แบบมีทิศทางขึ้นอยู่กับไมโครอาร์เรย์ ตัวอย่างเช่น หากเพิ่มฉลากพร้อมกับส่วนผสม RT cDNAจะเป็นแบบแอนติเซนส์ และโพรบไมโครอาร์เรย์จะเป็นแบบเซนส์ ยกเว้นในกรณีของตัวควบคุมเชิงลบ
    • โดยทั่วไปฉลากจะเป็นแบบเรืองแสงมีเพียงเครื่องเดียวเท่านั้นที่ใช้ฉลากกัมมันตรังสี
    • การติดฉลากสามารถทำได้โดยตรง (ไม่ได้ใช้) หรือโดยอ้อม (ต้องมีขั้นตอนการเชื่อมต่อ) สำหรับอาร์เรย์สองช่องสัญญาณ ขั้นตอนการเชื่อมต่อจะเกิดขึ้นก่อนการไฮบริดไดเซชัน โดยใช้อะมิโน อัล ลิลยูริ ดีน ไตรฟอสเฟต (อะมิโนอัลลิล-UTP หรือ aaUTP) และ สีย้อมที่ทำปฏิกิริยากับหมู่อะมิโน ของ NHS (เช่นสีย้อมไซยานีน ) สำหรับอาร์เรย์ช่องสัญญาณเดียว ขั้นตอนการเชื่อมต่อจะเกิดขึ้นหลังจากการไฮบริดไดเซชัน โดยใช้ไบโอตินและสเตรปตาไวดีนที่ติดฉลากนิ วคลีโอ ไทด์ที่ดัดแปลงแล้ว (โดยปกติในอัตราส่วน 1 aaUTP : 4 TTP ( ไทมิดีนไตรฟอสเฟต )) จะถูกเติมโดยเอนไซม์ในอัตราส่วนต่ำต่อนิวคลีโอไทด์ปกติ โดยทั่วไปจะได้ 1 ตัวทุกๆ 60 เบส จากนั้น aaDNA จะถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์ (โดยใช้สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต เนื่องจากTrisมีหมู่เอมีน) หมู่อะมิโนอัลลิลเป็นหมู่เอมีนบนตัวเชื่อมยาวที่ติดอยู่กับนิวคลีโอเบส ซึ่งทำปฏิกิริยากับสีย้อมที่ทำปฏิกิริยาได้
      • สามารถทำการทดลองซ้ำในรูปแบบที่เรียกว่า "การสลับสี" (dye flip) เพื่อควบคุมสิ่งแปลกปลอมที่ เกิดจากสีย้อม ในการทดลองแบบสองช่องสัญญาณได้ สำหรับการสลับสี จะใช้สไลด์แผ่นที่สอง โดยสลับฉลาก (ตัวอย่างที่ติดฉลากด้วย Cy3 ในสไลด์แผ่นแรก จะติดฉลากด้วย Cy5 และในทางกลับกัน) ในตัวอย่างนี้มีอะมิโนอัลลิล -UTP อยู่ในส่วนผสมที่ผ่านการถอดรหัสย้อนกลับ
  5. จากนั้นตัวอย่างที่ติดฉลากจะถูกผสมกับ สารละลาย ไฮบริดไดเซชันสูตร เฉพาะ ซึ่งอาจประกอบด้วยSDS , SSC , เดกซ์แทรนซัลเฟต , สารปิดกั้น (เช่นCot-1 DNA , DNA จากอสุจิปลาแซลมอน, DNA จากต่อมไทมัสของลูกวัว, PolyAหรือ PolyT), สารละลายของเดนฮาร์ดต์หรือฟอร์มามี
  6. ส่วนผสมจะถูกทำให้เสียสภาพและเติมลงในรูเล็กๆ ของไมโครอาร์เรย์ จากนั้นจึงปิดผนึกรูและทำการผสมไมโครอาร์เรย์ โดยอาจทำในเตาอบไฮบริด ซึ่งไมโครอาร์เรย์จะถูกผสมโดยการหมุน หรือในเครื่องผสม ซึ่งไมโครอาร์เรย์จะถูกผสมโดยแรงดันสลับกันที่รูเล็กๆ
  7. หลังจากทำการไฮบริดไดเซชันข้ามคืนแล้ว จะทำการกำจัดสารที่จับตัวกันแบบไม่จำเพาะออกไปทั้งหมด (โดยใช้ SDS และ SSC)
  8. ไมโครอาร์เรย์จะถูกทำให้แห้งและสแกนด้วยเครื่องที่ใช้เลเซอร์กระตุ้นสีย้อมและวัดระดับการปล่อยแสงด้วยตัวตรวจจับ
  9. ภาพถูกแบ่งเป็นตารางโดยใช้แม่แบบ และค่าความเข้มของแต่ละองค์ประกอบ (ซึ่งประกอบด้วยพิกเซลหลายพิกเซล) จะถูกวัดปริมาณ
  10. ข้อมูลดิบได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐานแล้ว วิธีการปรับให้เป็นมาตรฐานที่ง่ายที่สุดคือการลบความเข้มของพื้นหลังและปรับขนาดเพื่อให้ความเข้มรวมของคุณลักษณะของทั้งสองช่องสัญญาณเท่ากัน หรือใช้ความเข้มของยีนอ้างอิงในการคำนวณค่า tสำหรับความเข้มทั้งหมด วิธีการที่ซับซ้อนกว่านั้น ได้แก่อัตราส่วน z , การถดถอยแบบ loess และ lowessและ RMA (การวิเคราะห์มัลติชิปที่ทนทาน) สำหรับชิป Affymetrix (ชิปซิลิคอนแบบช่องสัญญาณเดียว โอลิโกนิวคลี โอไทด์สั้นที่สังเคราะห์ ในแหล่งกำเนิด )

ไมโครอาร์เรย์และชีวสารสนเทศ

ค่าการแสดงออกของยีนจากผลการทดลองไมโครอาร์เรย์สามารถแสดงในรูปแบบแผนที่ความร้อนเพื่อแสดงผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ข้อมูลได้

การเกิดขึ้นของการทดลองไมโครอาร์เรย์ราคาไม่แพงทำให้เกิดความท้าทายทางชีวสารสนเทศเฉพาะหลายประการ: [ 19 ]ระดับการทำซ้ำหลายระดับในการออกแบบการทดลอง ( การออกแบบการทดลอง ); จำนวนแพลตฟอร์มและกลุ่มอิสระและรูปแบบข้อมูล ( การกำหนดมาตรฐาน ); การประมวลผลทางสถิติของข้อมูล ( การวิเคราะห์ข้อมูล ); การแมปโพรบแต่ละตัวกับทราน สคริปต์ mRNAที่วัด ( คำอธิบายประกอบ ); ปริมาณข้อมูลมหาศาลและความสามารถในการแบ่งปัน ( คลังข้อมูล )

การออกแบบการทดลอง

เนื่องจากความซับซ้อนทางชีววิทยาของการแสดงออกของยีน การพิจารณาการออกแบบการทดลองที่กล่าวถึงใน บทความเกี่ยวกับ การวิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของยีนจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง หากต้องการสรุปผลจากข้อมูลอย่างถูกต้องทั้งทางสถิติและทางชีววิทยา

มีองค์ประกอบหลักสามประการที่ต้องพิจารณาเมื่อออกแบบการทดลองไมโครอาร์เรย์ ประการแรก การทำซ้ำตัวอย่างทางชีวภาพเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสรุปผลจากการทดลอง ประการที่สอง การทำซ้ำทางเทคนิค (เช่น ตัวอย่าง RNA สองตัวอย่างที่ได้จากแต่ละหน่วยการทดลอง) อาจช่วยในการหาปริมาณความแม่นยำ การทำซ้ำทางชีวภาพรวมถึงการสกัด RNA ที่เป็นอิสระ การทำซ้ำทางเทคนิคอาจเป็นสองส่วนของการสกัดเดียวกัน ประการที่สาม จุดของโคลน cDNA หรือโอลิโกนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวจะปรากฏเป็นการทำซ้ำ (อย่างน้อยสองเท่า) บนสไลด์ไมโครอาร์เรย์ เพื่อให้ได้การวัดความแม่นยำทางเทคนิคในการไฮบริดไดเซชันแต่ละครั้ง สิ่งสำคัญคือต้องมีการหารือเกี่ยวกับข้อมูลเกี่ยวกับการเตรียมและการจัดการตัวอย่าง เพื่อช่วยระบุหน่วยอิสระในการทดลองและเพื่อหลีกเลี่ยงการประมาณค่าความสำคัญทางสถิติที่สูงเกินจริง[ 20 ]

การกำหนดมาตรฐาน

การแลกเปลี่ยนข้อมูลไมโครอาร์เรย์ทำได้ยากเนื่องจากขาดมาตรฐานในการผลิตแพลตฟอร์ม โปรโตคอลการทดสอบ และวิธีการวิเคราะห์ ซึ่งก่อให้เกิด ปัญหา ด้านการทำงานร่วมกันใน สาขา ชีวสารสนเทศ โครงการ โอเพนซอร์สระดับรากหญ้า ต่างๆกำลังพยายามอำนวยความสะดวกในการแลกเปลี่ยนและวิเคราะห์ข้อมูลที่ได้จากชิปที่ไม่ใช่กรรมสิทธิ์เฉพาะ:

ตัวอย่างเช่น รายการตรวจสอบ "ข้อมูลขั้นต่ำเกี่ยวกับการทดลองไมโครอาร์เรย์" ( MIAME ) ช่วยกำหนดระดับรายละเอียดที่ควรมีอยู่ และวารสาร หลายฉบับกำลังนำไปใช้ เป็นข้อกำหนดสำหรับการส่งบทความที่รวมผลลัพธ์ไมโครอาร์เรย์ แต่ MIAME ไม่ได้อธิบายรูปแบบของข้อมูล ดังนั้นแม้ว่าหลายรูปแบบจะสามารถรองรับข้อกำหนดของ MIAME ได้ แต่ในปี 2007 ยังไม่มีรูปแบบใดที่อนุญาตให้ตรวจสอบความสอดคล้องทางความหมายได้อย่างสมบูรณ์ โครงการ "MicroArray Quality Control (MAQC) Project" กำลังดำเนินการโดยสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา แห่งสหรัฐอเมริกา (FDA) เพื่อพัฒนารูปแบบมาตรฐานและตัวชี้วัดการควบคุมคุณภาพ ซึ่งในที่สุดจะอนุญาตให้ใช้ข้อมูลไมโครอาร์เรย์ในการค้นพบยา การปฏิบัติทางคลินิก และการตัดสินใจด้านกฎระเบียบ[ 21 ]สมาคมMGEDได้พัฒนารูปแบบมาตรฐานสำหรับการนำเสนอผลลัพธ์การทดลองการแสดงออกของยีนและคำอธิบายประกอบที่เกี่ยวข้อง

การวิเคราะห์ข้อมูล

นักวิทยาศาสตร์ จากศูนย์วิจัยพิษวิทยาแห่งชาติตรวจสอบข้อมูลไมโครอาร์เรย์

ชุดข้อมูลไมโครอาร์เรย์มักมีขนาดใหญ่มาก และความแม่นยำในการวิเคราะห์ได้รับอิทธิพลจากตัวแปรหลายตัว ความท้าทาย ทางสถิติได้แก่ การคำนึงถึงผลกระทบของสัญญาณรบกวนพื้นหลังและการปรับค่าข้อมูลให้เหมาะสม วิธีการปรับค่าอาจเหมาะสมกับแพลตฟอร์มเฉพาะ และในกรณีของแพลตฟอร์มเชิงพาณิชย์ การวิเคราะห์อาจเป็นกรรมสิทธิ์[ 22 ]อัลกอริทึมที่ส่งผลต่อการวิเคราะห์ทางสถิติ ได้แก่:

  • การวิเคราะห์ภาพ: การสร้างตาราง, การระบุจุดในภาพที่สแกน (อัลกอริธึมการแบ่งส่วน), การลบหรือทำเครื่องหมายคุณลักษณะที่มีคุณภาพต่ำและความเข้มต่ำ (เรียกว่าการติดธง )
  • การประมวลผลข้อมูล: การลบพื้นหลัง (โดยอิงจากพื้นหลังทั่วโลกหรือเฉพาะที่), การกำหนดความเข้มของจุดและอัตราส่วนความเข้ม, การแสดงภาพข้อมูล (เช่น ดูแผนภูมิ MA ), และการแปลงลอการิทึมของอัตราส่วน, การทำให้เป็นมาตรฐานทั่วโลกหรือเฉพาะที่ของอัตราส่วนความเข้ม และการแบ่งส่วนเป็นภูมิภาคจำนวนสำเนาที่แตกต่างกันโดยใช้อัลกอริธึมการตรวจจับขั้นตอน[ 23 ]
  • การวิเคราะห์การค้นพบกลุ่ม: แนวทางการวิเคราะห์นี้ บางครั้งเรียกว่าการจำแนกประเภทแบบไม่ใช้การกำกับดูแล หรือการค้นพบความรู้ พยายามระบุว่าไมโครอาร์เรย์ (วัตถุ ผู้ป่วย หนู ฯลฯ) หรือยีนรวมกลุ่มกันเป็นกลุ่มหรือไม่ การระบุกลุ่มของวัตถุ (ไมโครอาร์เรย์หรือยีน) ที่มีอยู่ตามธรรมชาติซึ่งรวมกลุ่มกัน จะช่วยให้สามารถค้นพบกลุ่มใหม่ๆ ที่ไม่เคยทราบมาก่อนได้ ในระหว่างการวิเคราะห์การค้นพบความรู้ สามารถใช้เทคนิคการจำแนกประเภทแบบไม่ใช้การกำกับดูแลต่างๆ กับข้อมูลไมโครอาร์เรย์ DNA เพื่อระบุกลุ่ม (คลาส) ใหม่ของอาร์เรย์[ 24 ]แนวทางประเภทนี้ไม่ได้ขับเคลื่อนด้วยสมมติฐาน แต่ขึ้นอยู่กับการจดจำรูปแบบแบบวนซ้ำหรือวิธีการเรียนรู้ทางสถิติเพื่อค้นหาจำนวนกลุ่มที่ "เหมาะสมที่สุด" ในข้อมูล ตัวอย่างของวิธีการวิเคราะห์แบบไม่ใช้การกำกับดูแล ได้แก่ แผนที่จัดระเบียบตนเอง ก๊าซประสาท การวิเคราะห์กลุ่ม k-means [ 25 ]การวิเคราะห์กลุ่มแบบลำดับชั้น การจัดกลุ่มตามการประมวลผลสัญญาณจีโนม และการวิเคราะห์กลุ่มตามแบบจำลอง สำหรับบางวิธีเหล่านี้ ผู้ใช้ยังต้องกำหนดการวัดระยะทางระหว่างคู่ของวัตถุด้วย แม้ว่าโดยทั่วไปจะใช้สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของ Pearson แต่ก็มีการเสนอและประเมินมาตรวัดอื่นๆ อีกหลายอย่างในเอกสาร[ 26 ]ข้อมูลอินพุตที่ใช้ในการวิเคราะห์การค้นพบคลาสโดยทั่วไปจะอิงตามรายการยีนที่มีข้อมูลสูง (สัญญาณรบกวนต่ำ) โดยพิจารณาจากค่าสัมประสิทธิ์ความแปรผันต่ำหรือค่าเอนโทรปีของ Shannon สูง เป็นต้น การกำหนดจำนวนคลัสเตอร์ที่น่าจะเป็นไปได้มากที่สุดหรือเหมาะสมที่สุดที่ได้จากการวิเคราะห์แบบไม่กำกับดูแลเรียกว่าความถูกต้องของคลัสเตอร์ เมตริกที่ใช้กันทั่วไปสำหรับความถูกต้องของคลัสเตอร์ ได้แก่ ดัชนี Silhouette, ดัชนี Davies-Bouldin [ 27 ]ดัชนี Dunn หรือสถิติ ของ Hubert
  • การวิเคราะห์การทำนายคลาส: แนวทางนี้เรียกว่าการจำแนกประเภทแบบมีผู้กำกับดูแล ซึ่งเป็นพื้นฐานสำหรับการพัฒนารูปแบบการทำนายที่สามารถป้อนวัตถุทดสอบที่ไม่รู้จักในอนาคตเข้าไปเพื่อทำนายการเป็นสมาชิกคลาสที่น่าจะเป็นไปได้มากที่สุดของวัตถุทดสอบ การวิเคราะห์แบบมีผู้กำกับดูแล[ 24 ]สำหรับการทำนายคลาสเกี่ยวข้องกับการใช้เทคนิคต่างๆ เช่น การถดถอยเชิงเส้น เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด k ตัว การหาปริมาณเวกเตอร์การเรียนรู้ การวิเคราะห์ต้นไม้ตัดสินใจ ป่าสุ่ม เบย์แบบไร้เดียงสา การถดถอยโลจิสติก การถดถอยเคอร์เนล เครือข่ายประสาทเทียม เครื่องเวกเตอร์สนับสนุนส่วนผสมของผู้เชี่ยวชาญและก๊าซประสาทแบบมีผู้กำกับดูแล นอกจากนี้ ยังมีการใช้วิธีการเมตาฮิวริสติกต่างๆ เช่นอัลกอริทึมทางพันธุกรรมการปรับตัวของเมทริกซ์ความแปรปรวนร่วม การเพิ่มประสิทธิภาพฝูงอนุภาคและการเพิ่มประสิทธิภาพอาณานิคมมดข้อมูลป้อนเข้าสำหรับการทำนายคลาสมักจะขึ้นอยู่กับรายการยีนที่กรองแล้วซึ่งสามารถทำนายคลาสได้ โดยกำหนดโดยใช้การทดสอบสมมติฐานแบบคลาสสิก (ส่วนถัดไป) ดัชนีความหลากหลายของ Gini หรือการได้รับข้อมูล (เอนโทรปี)
  • การวิเคราะห์ทางสถิติที่ขับเคลื่อนด้วยสมมติฐาน: การระบุการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติในการแสดงออกของยีนมักจะระบุโดยใช้การทดสอบ t , ANOVA , วิธี Bayesian [ 28 ] วิธี การทดสอบ Mann–Whitneyที่ปรับให้เหมาะกับชุดข้อมูลไมโครอาร์เรย์ ซึ่งคำนึงถึงการเปรียบเทียบหลายรายการ[ 29 ]หรือ การ วิเคราะห์คลัสเตอร์[ 30 ]วิธีการเหล่านี้ประเมินพลังทางสถิติโดยพิจารณาจากความแปรปรวนที่มีอยู่ในข้อมูลและจำนวนการทำซ้ำของการทดลอง และสามารถช่วยลดข้อผิดพลาดประเภทที่ 1 และประเภทที่ 2ในการวิเคราะห์ได้[ 31 ]
  • การลดมิติ: นักวิเคราะห์มักจะลดจำนวนมิติ (ยีน) ก่อนการวิเคราะห์ข้อมูล[ 24 ]ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับวิธีการเชิงเส้น เช่น การวิเคราะห์ส่วนประกอบหลัก (PCA) หรือการเรียนรู้แมนิโฟลด์แบบไม่เชิงเส้น (การเรียนรู้เมตริกระยะทาง) โดยใช้ PCA เคอร์เนล แผนที่การแพร่กระจาย แผนที่ไอเกนลาปลาเซียน การฝังเชิงเส้นเฉพาะที่ การฉายภาพที่รักษาไว้เฉพาะที่ และการทำแผนที่ของแซมมอน
  • วิธีการตามเครือข่าย: วิธีการทางสถิติที่คำนึงถึงโครงสร้างพื้นฐานของเครือข่ายยีน ซึ่งแสดงถึงปฏิสัมพันธ์หรือการพึ่งพาซึ่งกันและกันระหว่างผลิตภัณฑ์ยีน[ 32 ]การวิเคราะห์เครือข่ายการแสดงออกร่วมของยีนแบบถ่วงน้ำหนักถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อระบุโมดูลการแสดงออกร่วมและยีนศูนย์กลางภายในโมดูล โมดูลอาจสอดคล้องกับชนิดของเซลล์หรือวิถีการทำงาน ยีนศูนย์กลางภายในโมดูลที่มีการเชื่อมต่อสูงจะแสดงถึงโมดูลที่เกี่ยวข้องได้ดีที่สุด

ข้อมูลไมโครอาร์เรย์อาจต้องมีการประมวลผลเพิ่มเติมเพื่อลดมิติของข้อมูลเพื่อช่วยให้เข้าใจและวิเคราะห์ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น[ 33 ] วิธีการอื่นๆ อนุญาตให้วิเคราะห์ข้อมูลที่ประกอบด้วยตัวอย่างทางชีวภาพหรือ ทางเทคนิคจำนวนน้อยตัวอย่างเช่น การทดสอบ Local Pooled Error (LPE) จะรวมค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของยีนที่มีระดับการแสดงออกคล้ายกันเพื่อชดเชยการทำซ้ำที่ไม่เพียงพอ[ 34 ]

คำอธิบายประกอบ

ความสัมพันธ์ระหว่างโพรบกับmRNAที่คาดว่าจะตรวจจับนั้นไม่ใช่เรื่องเล็กน้อย[ 35 ] mRNA บางชนิดอาจเกิดการไฮบริดข้ามกับโพรบในอาร์เรย์ที่ควรจะตรวจจับ mRNA อื่น นอกจากนี้ mRNA อาจประสบกับอคติในการขยายสัญญาณที่ขึ้นอยู่กับลำดับหรือโมเลกุล ประการที่สาม โพรบที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับ mRNA ของยีนเฉพาะอาจอาศัย ข้อมูล EST จีโนม ที่เชื่อมโยงกับยีนนั้นอย่างไม่ถูกต้อง

คลังข้อมูล

พบว่าข้อมูลไมโครอาร์เรย์มีประโยชน์มากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับชุดข้อมูลอื่นๆ ที่คล้ายคลึงกัน ปริมาณข้อมูลมหาศาล รูปแบบเฉพาะ (เช่นMIAME ) และความพยายามในการจัดการข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับชุดข้อมูลเหล่านี้ ทำให้จำเป็นต้องใช้ฐานข้อมูลเฉพาะทางในการจัดเก็บข้อมูล โซลูชันคลังข้อมูลแบบโอเพนซอร์สจำนวนมาก เช่นInterMineและBioMartได้ถูกสร้างขึ้นเพื่อวัตถุประสงค์เฉพาะในการบูรณาการชุดข้อมูลทางชีววิทยาที่หลากหลาย และยังสนับสนุนการวิเคราะห์อีกด้วย

เทคโนโลยีทางเลือก

ความก้าวหน้าในการจัดลำดับแบบขนานจำนวนมากได้นำไปสู่การพัฒนา เทคโนโลยี RNA-Seqซึ่งช่วยให้สามารถใช้แนวทางแบบช็อตกันของทรานสคริปโตมทั้งหมดเพื่อระบุลักษณะและวัดปริมาณการแสดงออกของยีน ได้ [ 36 ] [ 37 ]แตกต่างจากไมโครอาร์เรย์ซึ่งจำเป็นต้องมีจีโนมและทรานสคริปโตมอ้างอิงก่อนที่จะออกแบบไมโครอาร์เรย์ได้ RNA-Seq ยังสามารถใช้กับสิ่งมีชีวิตต้นแบบใหม่ที่ยังไม่ได้จัดลำดับจีโนมได้อีกด้วย[ 37 ]

คำศัพท์เฉพาะ

  • อาร์เรย์หรือสไลด์คือชุดของคุณลักษณะ ที่จัดเรียง ในเชิงพื้นที่บนตารางสองมิติ โดยจัดเรียงเป็นคอลัมน์และแถว
  • บล็อกหรือซับอาร์เรย์ : กลุ่มของจุดพิมพ์ ซึ่งโดยทั่วไปจะสร้างขึ้นในรอบการพิมพ์เดียว หลายซับอาร์เรย์/บล็อกจะรวมกันเป็นอาร์เรย์
  • การทดลอง แบบกรณีศึกษา/กลุ่มควบคุม : รูปแบบการออกแบบการทดลองที่เหมาะสมเป็นพิเศษสำหรับระบบอาร์เรย์สองสี โดยที่สภาวะที่เลือกเป็นกลุ่มควบคุม (เช่น เนื้อเยื่อหรือสภาวะที่แข็งแรง) จะถูกเปรียบเทียบกับสภาวะที่เปลี่ยนแปลงไป (เช่น เนื้อเยื่อหรือสภาวะที่เป็นโรค)
  • ช่องสัญญาณ : ค่าการเรือง แสงที่บันทึกได้ในเครื่องสแกนสำหรับสารเรืองแสง แต่ละชนิด และอาจเป็นค่าอัลตราไวโอเลตได้ด้วย
  • การสลับสีย้อมหรือการกลับทิศทางการเรืองแสง : การติดฉลากแบบกลับกันของเป้าหมาย DNA ด้วยสีย้อมสองชนิดเพื่อชดเชยความลำเอียงของสีย้อมในการทดลอง
  • สแกนเนอร์ : อุปกรณ์ที่ใช้ในการตรวจจับและวัดปริมาณความเข้มของการเรืองแสงของจุดบนแผ่นสไลด์ไมโครอาร์เรย์ โดยการกระตุ้นฟลูออโรฟอร์อย่างเลือกสรรด้วยเลเซอร์และวัดการเรืองแสงด้วยระบบโฟโตมัลติพลายเออร์ แบบ ฟิลเตอร์ (ออปติก)
  • จุดหรือส่วนประกอบ : บริเวณเล็กๆ บนสไลด์อาร์เรย์ที่ประกอบด้วยตัวอย่างดีเอ็นเอเฉพาะในปริมาณพิโคโมล
  • สำหรับคำศัพท์อื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง โปรดดูที่:

ดูเพิ่มเติม

  • ภาพเคลื่อนไหวไมโครอาร์เรย์ 1Lec.com
  • บทความเบื้องต้นเกี่ยวกับชีววิทยาในวารสาร PLoS: การวิเคราะห์ไมโครอาร์เรย์
  • ภาพรวมของเทคโนโลยีไมโครอาร์เรย์
  • ArrayMining.net  – เว็บเซิร์ฟเวอร์ฟรีสำหรับการวิเคราะห์ไมโครอาร์เรย์ออนไลน์
  • ไมโครอาร์เรย์ – ทำงานอย่างไร?
  • บทความวิจารณ์ในวารสาร PNAS: การค้นพบหลักการของธรรมชาติจากการสร้างแบบจำลองทางคณิตศาสตร์ของข้อมูลไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ
  • การทดลองเสมือนจริงด้วยไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ
ดึงข้อมูลมาจาก " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=DNA_microarray&oldid=1335531483 "

สรุปเนื้อหา

ข้อมูลสำคัญจากบทความ

ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับ ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ (หรือที่รู้จักกันทั่วไปว่าชิปดีเอ็นเอหรือไบโอชิป ) คือชุดของจุดดีเอ็นเอ ขนาดเล็กมากที่ติดอยู่บนพื้นผิวแข็ง นักวิทยาศาสตร์ใช้ ไมโครอาร์เรย์ ดีเอ็นเอ เพื่อวัด..

หลักการ

หลักการสำคัญของไมโครอาร์เรย์คือการไฮบริดไดเซชันระหว่างสายดีเอ็นเอสองสาย ซึ่งเป็นคุณสมบัติของ ลำดับกรดนิวคลีอิก ที่เสริมกัน ในการจับคู่กันอย่างจำเพาะเจาะจงโดยการสร้าง พันธะไฮโดรเจน ระหว่าง คู่เบสของนิวคลี โอไทด์ที่เสริมกัน...

การใช้งานและประเภท

มีอาร์เรย์หลายประเภท และความแตกต่างที่สำคัญที่สุดคือ อาร์เรย์เหล่านั้นจัดเรียงอยู่บนพื้นผิวหรือบนลูกปัดที่มีรหัส:

การผลิต

ไมโครอาร์เรย์สามารถผลิตได้หลายวิธี ขึ้นอยู่กับจำนวนโพรบที่กำลังตรวจสอบ ต้นทุน ข้อกำหนดในการปรับแต่ง และประเภทของคำถามทางวิทยาศาสตร์ที่ต้องการค้นหา อาร์เรย์จากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์อาจมีโพรบเพียง 10 ตัว หรือมากถึง 5 ล้านตัวหรือมากกว่านั้น ในระดับไมโครเมตร