โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์เป็น วิธี การโครมาโทกราฟีที่ใช้ในเคมีวิเคราะห์เพื่อแยกส่วนประกอบแต่ละชนิด ( สารวิเคราะห์ ) ของสารผสม สารผสมจะถูกลำเลียงโดยตัวทำละลาย (ตัวชะล้าง ) เพื่อสร้างเฟสเคลื่อนที่เฟสเคลื่อนที่จะเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคของแข็ง ( เฟสคงที่ ) ส่วนประกอบต่างๆจะดูดซับกับเฟสคงที่ในอัตราที่แตกต่างกัน ดังนั้นจึงผ่านออกจากคอลัมน์ในเวลาที่ต่างกัน ทำให้เกิดการแยกส่วนประกอบต่างๆ ออกจากกัน

เทคนิคนี้สามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้อย่างกว้างขวาง เนื่องจากสามารถใช้สารดูดซับที่แตกต่างกันหลายชนิด (เฟสปกติเฟสผกผันหรืออื่นๆ) ร่วมกับตัวทำละลายได้หลากหลายชนิด เทคนิคนี้สามารถใช้ได้ในระดับตั้งแต่ไมโครกรัมจนถึงกิโลกรัม ข้อดีหลักของโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์คือต้นทุนค่อนข้างต่ำ และสามารถเปลี่ยนเฟสคงที่ได้หลังการใช้งาน ซึ่งช่วยป้องกันการปนเปื้อนข้ามและการเสื่อมสภาพของเฟสคงที่เนื่องจากการนำกลับมาใช้ใหม่ เฟสเคลื่อนที่เคลื่อนที่โดยแรงโน้มถ่วง ก๊าซอัด หรือปั๊มแรงดัน (เช่นเดียวกับในโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง )

ก่อนทำการแยกสารด้วยคอลัมน์โครมาโทกราฟี โดยทั่วไปมักจะทำการแยกสารด้วยแผ่นบางโครมาโทกราฟีกับตัวอย่างปริมาณเล็กน้อยก่อน เพื่อดูว่าสารประกอบผสมจะมีพฤติกรรมอย่างไรเมื่อถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์โครมาโทกราฟี วิธีนี้ช่วยให้นักทดลองสามารถปรับส่วนผสมของเฟสเคลื่อนที่และเฟสคงที่ให้เหมาะสมกับตัวอย่างนั้นได้

คอลัมน์ถูกเตรียมโดยการบรรจุสารดูดซับที่เป็นของแข็งลงในหลอดแก้วหรือพลาสติกทรงกระบอก ขนาดของหลอดจะขึ้นอยู่กับปริมาณของสารประกอบที่ต้องการแยก ส่วนฐานของหลอดจะมีตัวกรองเพื่อยึดสารดูดซับที่เป็นของแข็งไว้ ​​ตัวกรองอาจเป็นจุกที่ทำจากฝ้ายหรือใยแก้วหรือแผ่นกรองแก้วอาจมีการต่ออ่างเก็บตัวทำละลายไว้ที่ด้านบนของคอลัมน์

โดยทั่วไปแล้ว การเตรียมคอลัมน์จะใช้สองวิธี ได้แก่วิธีแห้งและวิธีเปียกสำหรับวิธีแห้ง ขั้นแรกจะเติมผงเฟสคงที่แบบแห้งลงในคอลัมน์ จากนั้นจึงเติมเฟสเคลื่อนที่ แล้วไล่ผ่านคอลัมน์จนเปียกสนิท และหลังจากนี้จะไม่ปล่อยให้แห้งอีกต่อไป^{[ 1 ]}สำหรับวิธีเปียกจะเตรียมสารละลายข้น ของ ตัวชะล้างกับผงเฟสคงที่ แล้วค่อยๆ เทลงในคอลัมน์ ด้านบนของซิลิกาควรเรียบ และสามารถป้องกันด้านบนของซิลิกาได้ด้วยชั้นทราย ค่อยๆ ไล่ตัวชะล้างผ่านคอลัมน์เพื่อเคลื่อนสารอินทรีย์ไปข้างหน้า

ส่วนประกอบแต่ละชนิดจะถูกกักเก็บไว้ในเฟสคงที่แตกต่างกันและแยกออกจากกันในขณะที่เคลื่อนที่ด้วยความเร็วต่างกันผ่านคอลัมน์พร้อมกับตัวทำละลาย เมื่อถึงปลายคอลัมน์ ส่วนประกอบเหล่านั้นจะถูกชะออกมาทีละชนิด ตลอดกระบวนการโครมาโทกราฟี ตัวทำละลายจะถูกเก็บรวบรวมเป็นส่วนๆสามารถเก็บรวบรวมส่วนต่างๆ ได้โดยอัตโนมัติโดยใช้เครื่องเก็บส่วน ประสิทธิภาพของโครมาโทกราฟีสามารถเพิ่มขึ้นได้โดยการใช้คอลัมน์หลายๆ คอลัมน์พร้อมกัน ในกรณีนี้จะใช้เครื่องเก็บส่วนแบบหลายกระแส สามารถตรวจสอบองค์ประกอบของตัวทำละลายที่ไหลออกมาได้ และวิเคราะห์แต่ละส่วนเพื่อหาสารประกอบที่ละลายอยู่ เช่น โดยโครมาโทกราฟีเชิงวิเคราะห์ สเปกตรัมการดูดกลืนแสงยูวีหรือการเรืองแสงสามารถมองเห็นสารประกอบที่มีสี (หรือสารประกอบเรืองแสงโดยใช้หลอดยูวี) ผ่านผนังกระจกเป็นแถบเคลื่อนที่ได้

ในการโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์ คอลัมน์จะบรรจุอนุภาคของแข็ง ผงละเอียด หรือเจลไว้ภายใน ซึ่งเรียกว่าเฟสคงที่หรือ สาร ดูดซับโดยส่วนใหญ่มักทำจากซิลิกาเจลหรืออะลูมินาในอดีตเคยใช้ผง เซลลูโลส ด้วยเช่นกัน

มีเฟสคงที่ให้เลือกใช้หลากหลายประเภทสำหรับโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์หลายรูปแบบ ได้แก่โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยน ไอออน โค รมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน (RP) โครมาโทกราฟีแบบความสัมพันธ์หรือการดูดซับแบบเตียงขยาย (EBA) เฟสของแข็งอาจมีรูพรุนขนาดเล็กเพื่อเพิ่มพื้นผิว แต่ EBA ใช้เตียงแบบฟลูอิไดซ์

โดยทั่วไป ควรใช้เฟสคงที่มากกว่าส่วนผสมของสารวิเคราะห์มาก สำหรับโครมาโทกราฟีคอลัมน์ซิลิกาโดยเฉพาะ สำหรับมวลแห้ง ของ ส่วนผสมของสารวิเคราะห์แต่ละกรัม ควรใช้เฟสคงที่ 20 ถึง 100 กรัม การใช้ซิลิกามากขึ้นจะช่วยเพิ่มความสามารถในการแยกของโครมาโทกราฟี แต่ก็จะทำให้ช้าลงด้วย^{[ 2 ]}

เฟสเคลื่อนที่หรือตัวชะล้างคือตัวทำละลายหรือส่วนผสมของตัวทำละลายที่ใช้ในการเคลื่อนย้ายสารประกอบผ่านคอลัมน์

เกณฑ์หลักในการเลือกตัวทำละลายที่เหมาะสมนั้นเกี่ยวข้องกับค่าการคงตัว (retention factor ):

• ค่าแฟคเตอร์การคงตัวของสารประกอบที่สนใจควรอยู่ที่ประมาณ 0.2 - 0.3 เพื่อลดเวลาและปริมาณของตัวทำละลายที่ใช้ในการทำโครมาโทกราฟีให้น้อยที่สุด

• สารประกอบอื่นๆ ควรมีค่าแฟคเตอร์การคงตัวที่แตกต่างจากสารประกอบที่สนใจอย่างมาก

ในการเลือกตัวทำละลายที่ดี จำเป็นต้องทำการทดสอบเบื้องต้นในขนาดเล็กหลายครั้ง โดยมักใช้เทคนิคโครมาโทกราฟีแบบแผ่นบาง (TLC) ที่มีเฟสคงที่เดียวกัน และใช้ตัวทำละลายที่มีขั้วต่างกัน จนกว่าจะพบระบบตัวทำละลายที่เหมาะสม

ตัวทำละลายเฟสเคลื่อนที่ทั่วไป เรียงตามลำดับขั้วที่เพิ่มขึ้น ได้แก่เฮกเซนไดคลอโรมีเทนเอทิลอะซิเตต อะซิโตนและเมทานอล [ ^{3 ] ระบบ}ตัวทำละลายทั่วไปคือส่วนผสมของเฮกเซนและเอทิลอะซิเตต สัดส่วนจะถูกปรับเพื่อให้สารประกอบเป้าหมายมีปัจจัยการคงตัวอยู่ที่ 0.2 - 0.3

ตรงกันข้ามกับความเข้าใจผิดทั่วไป เมทานอลเพียงอย่างเดียวสามารถใช้เป็นตัวทำละลายสำหรับสารประกอบที่มีขั้วสูงได้ และไม่ละลายซิลิกาเจล

อัตราการไหลของตัวทำละลายสามารถปรับให้เหมาะสมได้ อัตราการไหลที่สูงขึ้นจะช่วยลดเวลาที่ใช้ในการทำงานของคอลัมน์ ซึ่งจะช่วยลดการแพร่กระจายและเพิ่มประสิทธิภาพในการแยกสาร อย่างไรก็ตาม หากอัตราการไหลสูงเกินไป สารวิเคราะห์จะไม่สามารถปรับสมดุลระหว่างเฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ได้ (ดูสมการของ Van Deemter )

เพื่อเพิ่มอัตราการไหลของคอลัมน์โครมาโทกราฟีแบบไหลตามแรงโน้มถ่วง สามารถเพิ่มความสูงของคอลัมน์ตัวทำละลายใหม่เหนือส่วนบนของเฟสคงที่ หรือลดการควบคุมการแตะ นอกจากนี้ยังสามารถเพิ่มได้โดยใช้ปั๊มหรือใช้ก๊าซอัด (เช่น อากาศไนโตรเจนหรืออาร์กอน ) เพื่อดันตัวทำละลายผ่านคอลัมน์ (คอลัมน์โครมาโทกราฟีแบบแฟลช) ^{[ 4 ] [ 5 ]}

โดยทั่วไปขนาดอนุภาคของเฟสคงที่ในโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์แฟลชจะละเอียดกว่าในโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์แรงโน้มถ่วง ตัวอย่างเช่น ซิลิกาเจลเกรดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในเทคนิคแรกคือเมช 230 – 400 (40 – 63 μm) ในขณะที่เทคนิคหลังมักต้องการซิลิกาเจลเมช 70 – 230 (63 – 200 μm) ^{[ 6 ]}

การแยกสารด้วยคอลัมน์โครมาโทกราฟีใช้เวลานาน ผู้ผลิตหลายราย เช่น Biotage, Buchi, Interchim และ Teledyne Isco ได้พัฒนาระบบโครมาโทกราฟีแบบแฟลชอัตโนมัติ ซึ่งช่วยลดการมีส่วนร่วมของมนุษย์ในกระบวนการทำให้บริสุทธิ์

ระบบดังกล่าวโดยทั่วไปเรียกว่า โครมาโทกราฟีของเหลวความดันต่ำ (LPLC) ระบบเหล่านี้ประกอบด้วยส่วนประกอบที่ปกติพบใน ระบบ โครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูง (HPLC) ที่มีราคาแพงกว่า เช่น ปั๊มไล่ระดับความดัน พอร์ตฉีดตัวอย่าง เครื่องตรวจจับรังสียูวี และตัวเก็บเศษส่วนเพื่อเก็บตัวทำละลาย แต่ทำงานที่ความดันต่ำกว่า (โดยปกติ 350–525 kPa หรือ 50.8–76.1 psi) โดยทั่วไป ระบบอัตโนมัติเหล่านี้สามารถแยกตัวอย่างได้ตั้งแต่ไม่กี่มิลลิกรัมไปจนถึงระดับอุตสาหกรรมหลายกิโลกรัม และมีราคาถูกกว่าและเร็วกว่าการฉีดตัวอย่างหลายครั้งในระบบ HPLC แบบเตรียมการ

ความละเอียด (หรือความสามารถในการแยกสารผสม) ของระบบ LPLC นั้นต่ำกว่า เนื่องจากวัสดุบรรจุในคอลัมน์ HPLC มีขนาดเล็กกว่ามาก โดยทั่วไปเพียง 5 ไมโครเมตร ซึ่งจะเพิ่มพื้นที่ผิวของเฟสคงที่สำหรับการทำปฏิกิริยา และให้การแยกที่ดีกว่า อย่างไรก็ตาม วัสดุบรรจุขนาดเล็กทำให้เกิดแรงดันย้อนกลับสูง จึงเรียกว่า "โครมาโทกราฟีของเหลวแรงดันสูง"

โดยทั่วไป คอลัมน์ LPLC จะบรรจุด้วยซิลิกาที่มีความหนาประมาณ 50 ไมโครเมตร ซึ่งช่วยลดแรงดันย้อนกลับและความละเอียด แต่ก็ทำให้ไม่จำเป็นต้องใช้ปั๊มแรงดันสูงราคาแพงอีกต่อไป ปัจจุบันผู้ผลิตเริ่มหันมาใช้ระบบโครมาโทกราฟีแบบแฟลชที่มีแรงดันสูงขึ้น ซึ่งทำงานที่แรงดันสูงกว่า 1 MPa (150 psi) และเรียกระบบนี้ว่า "โครมาโทกราฟีของเหลวแรงดันปานกลาง" (MPLC)

โดยทั่วไป การโครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์จะใช้ปั๊มแบบลูกสูบ (peristaltic pump) โดยมีบัฟเฟอร์และสารละลายตัวอย่างไหลผ่านด้านบนของคอลัมน์ สารละลายและบัฟเฟอร์จะไหลผ่านคอลัมน์ โดยมีตัวเก็บเศษส่วน (fraction collector) อยู่ที่ปลายคอลัมน์เพื่อเก็บตัวอย่างที่ถูกชะออกมา ก่อนการเก็บเศษส่วน ตัวอย่างที่ถูกชะออกจากคอลัมน์จะผ่านเครื่องตรวจจับ เช่นสเปกโทรโฟโตมิเตอร์หรือแมสสเปกโทรเมตรีเพื่อหาความเข้มข้นของตัวอย่างที่แยกได้ในสารละลายผสม

ตัวอย่างเช่น หากคุณต้องการแยกโปรตีนสองชนิดที่มีความสามารถในการจับกับคอลัมน์ต่างกันออกจากตัวอย่างสารละลาย เครื่องตรวจวัดที่เหมาะสมคือเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ที่ใช้ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร ยิ่งความเข้มข้นของโปรตีนที่ผ่านสารละลายที่ถูกชะล้างผ่านคอลัมน์สูงเท่าใด ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นนั้นก็จะยิ่งสูงขึ้นเท่านั้น

เนื่องจากการแยกสารด้วยคอลัมน์โครมาโทกราฟีมีการไหลของสารละลายที่ถูกชะออกมาอย่างต่อเนื่องผ่านตัวตรวจจับด้วยความเข้มข้นที่เปลี่ยนแปลงไป ตัวตรวจจับจึงต้องบันทึกความเข้มข้นของตัวอย่างที่ถูกชะออกมาในช่วงเวลาต่างๆ กราฟแสดงความเข้มข้นของตัวอย่างเทียบกับเวลาเรียกว่า โครมาโทแกรม

เป้าหมายสูงสุดของโครมาโทกราฟีคือการแยกส่วนประกอบต่างๆ ออกจากสารละลายผสม ความละเอียดแสดงถึงระดับการแยกส่วนประกอบออกจากสารละลายผสม ยิ่งความละเอียดของโครมาโทแกรมสูงเท่าไร การแยกตัวอย่างที่คอลัมน์ให้ได้ก็จะยิ่งดีขึ้นเท่านั้น ข้อมูลนี้เป็นวิธีที่ดีในการพิจารณาคุณสมบัติการแยกของคอลัมน์สำหรับตัวอย่างนั้นๆ ความละเอียดสามารถคำนวณได้จากโครมาโทแกรม

เส้นโค้งแต่ละเส้นในแผนภาพแสดงถึงโปรไฟล์ความเข้มข้นของการชะล้างตัวอย่างที่แตกต่างกันเมื่อเวลาผ่านไป โดยขึ้นอยู่กับความสัมพันธ์กับเรซินในคอลัมน์ ในการคำนวณความละเอียด จำเป็นต้องทราบเวลาการคงอยู่และความกว้างของเส้นโค้ง

เวลาคงตัว (Retention time) คือเวลาตั้งแต่เริ่มตรวจจับสัญญาณโดยตัวตรวจจับจนถึงจุดสูงสุดของกราฟความเข้มข้นของการชะล้างของแต่ละตัวอย่างที่แตกต่างกัน

ความกว้างของเส้นโค้ง คือ ความกว้างของเส้นโค้งแสดงความเข้มข้นของตัวอย่างต่างๆ ในโครมาโทแกรม ในหน่วยของเวลา

วิธีการคำนวณความละเอียดของโครมาโตแกรมแบบง่ายคือการใช้แบบจำลองเพลท^{[ 7 ]}แบบจำลองเพลทถือว่าคอลัมน์สามารถแบ่งออกเป็นส่วนหรือเพลทจำนวนหนึ่ง และสามารถคำนวณสมดุลมวลสำหรับแต่ละเพลทได้ วิธีนี้ประมาณเส้นโค้งโครมาโตแกรมทั่วไปเป็น เส้นโค้ง การกระจายแบบเกาส์เซียนด้วยวิธีนี้ ความกว้างของเส้นโค้งจะถูกประมาณเป็น 4 เท่าของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของเส้นโค้ง 4σ เวลาการคงอยู่คือเวลาตั้งแต่เริ่มตรวจจับสัญญาณจนถึงเวลาของความสูงสูงสุดของเส้นโค้งเกาส์เซียน

จากตัวแปรในรูปด้านบน สามารถคำนวณความละเอียด จำนวนแผ่น และความสูงของแผ่นในแบบจำลองเสาได้

มติที่ ${\textstyle R_{s}=2{\frac {t_{RB}-t_{RA}}{w_{A}+w_{B}}}}$

t _RB = เวลาการคงอยู่ของสารละลาย B

t _RA = เวลาการคงอยู่ของสารละลาย A

w _B = ความกว้างของเส้นโค้งเกาส์เซียนของตัวถูกละลาย B

w _A = ความกว้างของเส้นโค้งเกาส์เซียนของตัวถูกละลาย A

หมายเลขทะเบียนรถ. ${\displaystyle N=(4t_{R}/w)^{2}}$

ความสูงของแผ่นโดยที่คือความยาวของคอลัมน์^{[ 7 ]}${\displaystyle H=L/N}$${\displaystyle L}$

สำหรับคอลัมน์ดูดซับ เรซินในคอลัมน์ (เฟสคงที่) ประกอบด้วยไมโครบีดส์ อนุภาคขนาดเล็กกว่า เช่น โปรตีน คาร์โบไฮเดรต ไอออนโลหะ หรือสารประกอบเคมีอื่นๆ จะถูกเชื่อมต่อเข้ากับไมโครบีดส์ โดยแต่ละอนุภาคที่จับกับไมโครบีดส์นั้น สามารถสันนิษฐานได้ว่าจะจับกับตัวอย่างสารละลายที่ส่งผ่านคอลัมน์ที่ต้องการทำให้บริสุทธิ์หรือแยกสารในอัตราส่วน 1:1

การจับกันระหว่างโมเลกุลเป้าหมายที่จะแยกออกจากโมเลกุลที่จับกับเม็ดบีดในคอลัมน์สามารถจำลองได้โดยใช้ปฏิกิริยาสมดุล อย่างง่าย K _eq = [CS]/([C][S]) โดยที่ K _eqคือค่าคงที่สมดุล [C] และ [S] คือความเข้มข้นของโมเลกุลเป้าหมายและโมเลกุลที่จับกับเรซินในคอลัมน์ตามลำดับ [CS] คือความเข้มข้นของสารเชิงซ้อนของโมเลกุลเป้าหมายที่จับกับเรซินในคอลัมน์^{[ 7 ]}

โดยใช้สิ่งนี้เป็นพื้นฐาน สามารถใช้ไอโซเทอร์มที่แตกต่างกันสามแบบเพื่ออธิบายพลวัตการจับตัวของคอลัมน์โครมาโทกราฟี ได้แก่ แบบเชิงเส้น แบบแลงมัวร์ และแบบฟรอยด์ลิช

เส้นไอโซเทอร์มเชิงเส้นเกิดขึ้นเมื่อความเข้มข้นของสารละลายที่ต้องการทำให้บริสุทธิ์มีค่าน้อยมากเมื่อเทียบกับโมเลกุลที่จับกับสารละลาย ดังนั้นสมดุลจึงสามารถกำหนดได้ดังนี้:

[CS] = K _eq [C]

สำหรับการใช้งานในระดับอุตสาหกรรม ต้องคำนึงถึงจำนวนโมเลกุลที่จับกับเม็ดเรซินในคอลัมน์ทั้งหมดด้วย เนื่องจากต้องพิจารณาถึงตำแหน่งที่ว่างอยู่ สมการไอโซเทอร์มของ Langmuirและสมการไอโซเทอร์มของ Freundlichมีประโยชน์ในการอธิบายสมดุลนี้ สมการไอโซเทอร์มของ Langmuir มีดังนี้:

[CS] = (K _eq S _tot [C])/(1 + K _eq [C]) โดยที่ S _totคือจำนวนโมเลกุลที่จับกับลูกปัดทั้งหมด

เส้นไอโซเทอร์มของ Freundlich กำหนดโดย:

[CS] = K _eq [C] ^1/n

ไอโซเทอร์มของ Freundlich ใช้เมื่อคอลัมน์สามารถจับกับตัวอย่างที่แตกต่างกันจำนวนมากในสารละลายที่ต้องการทำให้บริสุทธิ์ เนื่องจากตัวอย่างที่แตกต่างกันจำนวนมากมีค่าคงที่การจับกับลูกปัดที่แตกต่างกัน จึงมีค่า Keq ที่แตกต่างกันจำนวนมาก ดังนั้น ไอ _โซเทอร์มของ Langmuir จึงไม่ใช่แบบจำลองที่ดีสำหรับการจับในกรณีนี้^{[ 7 ]}

• โครมาโทกราฟีของเหลวโปรตีนความเร็วสูง (FPLC) – การแยกโปรตีนโดยใช้โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์
• โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) – โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์โดยใช้แรงดันสูง

• คู่มือการแยกสารด้วยวิธี Flash Column Chromatography (pdf)
• โครมาโทกราฟีแบบไหลตามรัศมี