สเปกโทรโฟโตเมตรีเป็นสาขาหนึ่งของสเปกโทรสโกปีแม่เหล็กไฟฟ้าที่เกี่ยวข้องกับการวัดเชิงปริมาณของคุณสมบัติการสะท้อนหรือการส่งผ่านของวัสดุตามฟังก์ชันของความยาวคลื่น^{[ 2 ]}สเปกโทรโฟโตเมตรีใช้โฟโตมิเตอร์ที่เรียกว่าสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ ซึ่งสามารถวัดความเข้มของลำแสงที่ความยาวคลื่นต่างๆ ได้ แม้ว่าสเปกโทรโฟโตเมตรีจะถูกนำมาใช้กับรังสีอัลตราไวโอเลต แสงที่มองเห็นได้และ รังสี อินฟราเรด เป็นส่วนใหญ่ แต่สเปกโทรโฟโตมิเตอร์สมัยใหม่สามารถตรวจสอบ สเปกตรัมแม่เหล็กไฟฟ้าได้หลากหลายช่วงรวมถึงรังสีเอกซ์รังสีอัลตราไวโอเลตแสงที่มองเห็นได้รังสีอินฟราเรดหรือคลื่น ไมโครเวฟ

สเปกโทรโฟโตเมตรีเป็นเครื่องมือที่อาศัยการวิเคราะห์เชิงปริมาณของโมเลกุลโดยพิจารณาจากปริมาณแสงที่สารประกอบสีดูดซับ คุณสมบัติที่สำคัญของสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ ได้แก่ แบนด์วิดท์สเปกตรัม (ช่วงสีที่สามารถส่งผ่านตัวอย่างทดสอบได้) เปอร์เซ็นต์การส่งผ่านของตัวอย่าง ช่วงลอการิทึมของการดูดซับของตัวอย่าง และบางครั้งอาจมีการวัดเปอร์เซ็นต์การสะท้อนแสงด้วย

เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์มักใช้สำหรับการวัดการส่งผ่านหรือการสะท้อนแสงของสารละลาย ของแข็งโปร่งใสหรือทึบแสง เช่น กระจกขัดเงา หรือก๊าซ แม้ว่าสารชีวเคมีหลายชนิดจะมีสี กล่าวคือ ดูดซับแสงที่มองเห็นได้ และสามารถวัดได้ด้วยวิธีการวัดสี แต่สารชีวเคมีที่ไม่มีสีก็มักจะสามารถเปลี่ยนเป็นสารประกอบที่มีสีซึ่งเหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาการสร้างสีโครโมเจนิคเพื่อให้ได้สารประกอบที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ด้วยวิธีการวัดสี^{[ 3 ] : 65} อย่างไรก็ตาม ยังสามารถออกแบบให้วัดการแพร่กระจายในช่วงแสงใดๆ ที่ระบุไว้ ซึ่งโดยทั่วไปจะครอบคลุมประมาณ 200–2500 นาโนเมตร โดยใช้การควบคุมและการสอบเทียบ ที่แตกต่างกัน ^{[ 2 ]}ภายในช่วงแสงเหล่านี้ จำเป็นต้องมีการสอบเทียบเครื่องโดยใช้มาตรฐานที่แตกต่างกันไปตามประเภท ขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นของการกำหนดทางโฟโตเมตริก^{[ 4 ]}

ตัวอย่างหนึ่งของการทดลองที่ใช้สเปกโทรโฟโตเมตรีคือการหาค่าคงที่สมดุลของสารละลาย ปฏิกิริยาเคมีบางอย่างในสารละลายอาจเกิดขึ้นได้ทั้งในทิศทางไปข้างหน้าและย้อนกลับ โดยสารตั้งต้นจะกลายเป็นผลิตภัณฑ์ และผลิตภัณฑ์จะสลายตัวกลับไปเป็นสารตั้งต้น ณ จุดหนึ่ง ปฏิกิริยาเคมีนี้จะถึงจุดสมดุลที่เรียกว่าจุดสมดุล ในการหาความเข้มข้นของสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์ ณ จุดนี้ สามารถทดสอบการส่งผ่านแสงของสารละลายโดยใช้สเปกโทรโฟโตเมตรี ปริมาณแสงที่ผ่านสารละลายจะบ่งบอกถึงความเข้มข้นของสารเคมีบางชนิดที่ไม่ยอมให้แสงผ่านได้

การดูดกลืนแสงเกิดจากการปฏิสัมพันธ์ของแสงกับโหมดอิเล็กตรอนและโหมดการสั่นของโมเลกุล โมเลกุลแต่ละชนิดมีชุดระดับพลังงานเฉพาะตัวที่เกี่ยวข้องกับองค์ประกอบของพันธะเคมีและนิวเคลียส ดังนั้นจึงจะดูดกลืนแสงที่มีความยาวคลื่นหรือพลังงานเฉพาะ ส่งผลให้มีคุณสมบัติสเปกตรัมที่เป็นเอกลักษณ์^{[ 5 ]}ซึ่งขึ้นอยู่กับองค์ประกอบที่เฉพาะเจาะจงและแตกต่างกัน

การใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ครอบคลุมสาขาวิทยาศาสตร์ต่างๆ เช่นฟิสิกส์วิทยาศาสตร์วัสดุเคมีชีวเคมีวิศวกรรมเคมีและชีววิทยาโมเลกุล[ ^{6 ]}มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมต่างๆ รวมถึงเซมิคอนดักเตอร์ การผลิตเลเซอร์และออปติก การพิมพ์ และการตรวจสอบทางนิติวิทยาศาสตร์ ตลอดจนในห้องปฏิบัติการสำหรับการศึกษาสารเคมี สเปกโตรโฟโตเมตรีมักใช้ในการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ การหาความเข้มข้นของโปรตีน การหาค่าคงที่จลนศาสตร์ของเอนไซม์ และการวัดปฏิกิริยาการจับของลิแกนด์^[ 3 ^{] : 65ใน} ที่สุด สเปกโตรโฟโตมิเตอร์สามารถกำหนดได้ ขึ้นอยู่กับการควบคุมหรือการสอบเทียบ ว่ามีสารใดอยู่ในเป้าหมายและมีปริมาณเท่าใดอย่างแม่นยำ โดยการคำนวณความยาวคลื่นที่สังเกตได้

ในทางดาราศาสตร์คำว่า spectrophotometry หมายถึงการวัดสเปกตรัมของวัตถุบนท้องฟ้าโดยที่ มาตราส่วน ฟลักซ์ของสเปกตรัมจะถูกปรับเทียบตามฟังก์ชันของความยาวคลื่นโดยปกติจะเปรียบเทียบกับการสังเกตดาวมาตรฐาน spectrophotometric และแก้ไขสำหรับการดูดกลืนแสงโดยชั้นบรรยากาศของโลก^{[ 7 ]}

เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ ถูกคิดค้นโดยอาร์โนลด์ โอ. เบ็คแมนในปี 1940 โดยความช่วยเหลือจากเพื่อนร่วมงานของเขาที่บริษัท National Technical Laboratories ซึ่งก่อตั้งขึ้นในปี 1935 และต่อมาได้กลายเป็นบริษัท Beckman Instrument Company และในที่สุดก็ คือ Beckman Coulterเครื่องนี้ถูกสร้างขึ้นเพื่อแก้ปัญหาเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์รุ่นก่อนๆ ที่ไม่สามารถดูดซับรังสีอัลตราไวโอเลตได้อย่างถูกต้อง เขาเริ่มต้นด้วยการคิดค้นรุ่น Model A ซึ่งใช้ปริซึมแก้วในการดูดซับแสง UV แต่พบว่าไม่ได้ผลลัพธ์ที่น่าพอใจ ดังนั้นในรุ่น Model B จึงมีการเปลี่ยนจากปริซึมแก้วเป็นปริซึมควอตซ์ ซึ่งทำให้ได้ผลการดูดซับที่ดีขึ้น จากนั้นจึงได้พัฒนา Model C ขึ้นมา โดยมีการปรับความละเอียดของความยาวคลื่น และผลิตออกมาสามรุ่น รุ่นสุดท้ายและได้รับความนิยมมากที่สุดคือ Model D ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในชื่อสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ DUซึ่งประกอบด้วยตัวเครื่อง หลอดไฮโดรเจนที่มีรังสีอัลตราไวโอเลตต่อเนื่อง และโมโนโครมาเตอร์ที่ดีกว่า^{[ 8 ]}ผลิตขึ้นตั้งแต่ปี พ.ศ. 2484 ถึง พ.ศ. 2519 โดยราคาในปี พ.ศ. 2484 คือ 723 ดอลลาร์สหรัฐ (อุปกรณ์เสริมสำหรับรังสีอัลตราไวโอเลตระยะไกลเป็นตัวเลือกที่มีค่าใช้จ่ายเพิ่มเติม) ตามคำกล่าวของ บรูซ เมอร์ริฟิลด์ผู้ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมี ว่า"น่าจะเป็นเครื่องมือที่สำคัญที่สุดเท่าที่เคยพัฒนาขึ้นมาเพื่อความก้าวหน้าของวิทยาศาสตร์ชีวภาพ" ^{[ 9 ]}

เมื่อเลิกผลิตในปี 1976 ^{[ 10 ]} Hewlett-Packardได้สร้างเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบไดโอดอาร์เรย์เครื่องแรกที่วางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ในปี 1979 ซึ่งรู้จักกันในชื่อ HP 8450A ^{[ 11 ]}เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบไดโอดอาร์เรย์แตกต่างจากเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ดั้งเดิมที่สร้างโดย Beckman เนื่องจากเป็นเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบลำแสงเดี่ยวที่ควบคุมด้วยไมโครโปรเซสเซอร์เครื่องแรกที่สามารถสแกนความยาวคลื่นหลายช่วงพร้อมกันได้ในเวลาไม่กี่วินาที โดยจะฉายแสงหลายสีไปยังตัวอย่าง ซึ่งตัวอย่างจะดูดซับแสงขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของมัน จากนั้นแสงจะถูกส่งกลับโดยตะแกรงของอาร์เรย์โฟโตไดโอด ซึ่งจะตรวจจับช่วงความยาวคลื่นของสเปกตรัม^{[ 12 ]}นับตั้งแต่นั้นมา การสร้างและการนำอุปกรณ์สเปกโตรโฟโตเมตรีไปใช้ก็เพิ่มขึ้นอย่างมาก

อุปกรณ์มีสองประเภทหลัก ได้แก่ แบบลำแสงเดี่ยวและแบบลำแสงคู่ สเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบลำแสงคู่^{[ 13 ]}เปรียบเทียบความเข้มของแสงระหว่างเส้นทางแสงสองเส้นทาง เส้นทางหนึ่งมีตัวอย่างอ้างอิง และอีกเส้นทางหนึ่งมีตัวอย่างทดสอบ สเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบลำแสงเดี่ยวจะวัดความเข้มของแสงสัมพัทธ์ของลำแสงก่อนและหลังการใส่ตัวอย่างทดสอบ แม้ว่าการวัดเปรียบเทียบจากเครื่องมือแบบลำแสงคู่จะง่ายกว่าและเสถียรกว่า แต่เครื่องมือแบบลำแสงเดี่ยวสามารถมีช่วงไดนามิกที่กว้างกว่า และมีโครงสร้างทางแสงที่เรียบง่ายกว่าและกะทัดรัดกว่า นอกจากนี้ เครื่องมือเฉพาะทางบางชนิด เช่น สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ติดตั้งบนกล้องจุลทรรศน์หรือกล้องโทรทรรศน์ เป็นเครื่องมือแบบลำแสงเดี่ยวเนื่องจากความสะดวกในการใช้งาน

ในอดีต เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ใช้โมโนโครมาเตอร์ที่มีตะแกรงเลี้ยวเบนเพื่อสร้างสเปกตรัมสำหรับการวิเคราะห์ ตะแกรงเลี้ยวเบนอาจเคลื่อนที่ได้หรืออยู่กับที่ หากใช้ตัวตรวจจับเดี่ยว เช่นหลอดโฟโตมัลติพลาย เออร์ หรือโฟโตไดโอดตะแกรงเลี้ยวเบนสามารถสแกนได้ทีละขั้น (สเปกโทรโฟโตมิเตอร์แบบสแกน) เพื่อให้ตัวตรวจจับสามารถวัดความเข้มของแสงที่แต่ละความยาวคลื่น (ซึ่งจะสอดคล้องกับแต่ละ "ขั้น") นอกจากนี้ยังสามารถใช้อาร์เรย์ของตัวตรวจจับ (สเปกโทรโฟโตมิเตอร์แบบอาร์เรย์) เช่นอุปกรณ์รับภาพประจุไฟฟ้า (CCD) หรืออาร์เรย์โฟโตไดโอด (PDA) ในระบบดังกล่าว ตะแกรงเลี้ยวเบนจะอยู่กับที่ และความเข้มของแสงแต่ละความยาวคลื่นจะถูกวัดโดยตัวตรวจจับที่แตกต่างกันในอาร์เรย์ ยิ่งไปกว่านั้น สเปกโทรโฟโตมิเตอร์อินฟราเรดช่วงกลางที่ทันสมัยส่วนใหญ่ใช้ เทคนิค การแปลงฟูริเยร์เพื่อรับข้อมูลสเปกตรัม เทคนิคนี้เรียกว่าสเปกโทรสโกปีอินฟราเรดแบบแปลงฟูริเยร์

ในการวัดการส่งผ่านแสง เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์จะเปรียบเทียบสัดส่วนของแสงที่ผ่านสารละลายอ้างอิงและสารละลายทดสอบในเชิงปริมาณ จากนั้นจะเปรียบเทียบความเข้มของสัญญาณทั้งสองทางอิเล็กทรอนิกส์และคำนวณเปอร์เซ็นต์การส่งผ่านแสงของตัวอย่างเมื่อเทียบกับมาตรฐานอ้างอิง สำหรับการวัดการสะท้อนแสง เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์จะเปรียบเทียบสัดส่วนของแสงที่สะท้อนจากตัวอย่างอ้างอิงและตัวอย่างทดสอบในเชิงปริมาณ แสงจากหลอดไฟจะผ่านโมโนโครมาเตอร์ ซึ่งจะทำให้แสงเกิดการเลี้ยวเบนเป็น "รุ้ง" ของความยาวคลื่นผ่านปริซึมที่หมุนได้ และส่งออกแถบความถี่แคบๆ ของสเปกตรัมที่เลี้ยวเบนนี้ผ่านช่องแคบเชิงกลที่ด้านส่งออกของโมโนโครมาเตอร์ แถบความถี่เหล่านี้จะส่งผ่านตัวอย่างทดสอบ จากนั้นความหนาแน่นของฟลักซ์โฟตอน (โดยปกติคือวัตต์ต่อตารางเมตร) ของแสงที่ส่งผ่านหรือสะท้อนจะถูกวัดด้วยโฟโตไดโอด CCD หรือเซ็นเซอร์แสง อื่นๆ ค่าการส่งผ่านหรือการสะท้อนแสงสำหรับแต่ละความยาวคลื่นของตัวอย่างทดสอบจะถูกนำไปเปรียบเทียบกับค่าการส่งผ่านหรือการสะท้อนแสงจากตัวอย่างอ้างอิง เครื่องมือส่วนใหญ่จะใช้ฟังก์ชันลอการิทึมกับอัตราส่วนการส่งผ่านเชิงเส้นเพื่อคำนวณ "การดูดกลืนแสง" ของตัวอย่าง ซึ่งเป็นค่าที่แปรผันตรงกับ "ความเข้มข้น" ของสารเคมีที่กำลังวัด

โดยสรุป ลำดับเหตุการณ์ในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบสแกนมีดังนี้:

1. แสงจากแหล่งกำเนิดแสงส่องเข้าไปในโมโนโครมาเตอร์ เกิดการเลี้ยวเบนจนเกิดเป็นสีรุ้ง และแยกออกเป็นสองลำแสง จากนั้นจึงส่องผ่านตัวอย่างและสารละลายอ้างอิง
2. คลื่นแสงที่ตกกระทบส่วนหนึ่งจะทะลุผ่านหรือสะท้อนจากตัวอย่างและวัสดุอ้างอิง
3. แสงที่เกิดขึ้นจะตกกระทบ อุปกรณ์ ตรวจจับแสงซึ่งจะเปรียบเทียบความเข้มสัมพัทธ์ของลำแสงทั้งสอง
4. วงจรไฟฟ้าจะแปลงกระแสไฟฟ้าสัมพัทธ์ให้เป็นเปอร์เซ็นต์การส่งผ่านเชิงเส้น หรือค่าการดูดกลืนแสง หรือค่าความเข้มข้น

ในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบอาร์เรย์ ลำดับจะเป็นดังนี้: ^{[ 14 ]}

1. แหล่งกำเนิดแสงส่องเข้าไปในตัวอย่างและรวมแสงให้ผ่านช่องแคบ
2. แสงที่ส่องผ่านจะหักเหเป็นสีรุ้งด้วยตะแกรงสะท้อนแสง
3. แสงที่เกิดขึ้นจะตกกระทบอุปกรณ์ตรวจจับแสง ซึ่งจะเปรียบเทียบความเข้มของลำแสง
4. วงจรอิเล็กทรอนิกส์จะแปลงกระแสไฟฟ้าสัมพัทธ์ให้เป็นเปอร์เซ็นต์การส่งผ่านเชิงเส้น และ/หรือค่าการดูดกลืน/ความเข้มข้น

เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์รุ่นเก่าจำนวนมากต้องได้รับการสอบเทียบด้วยกระบวนการที่เรียกว่า "การปรับค่าศูนย์" เพื่อปรับสมดุลกระแสเอาต์พุตศูนย์ของลำแสงทั้งสองที่ตัวตรวจจับ การส่งผ่านของสารอ้างอิงจะถูกตั้งค่าเป็นค่าพื้นฐาน (ข้อมูล) ดังนั้นการส่งผ่านของสารอื่นๆ ทั้งหมดจะถูกบันทึกโดยสัมพันธ์กับสาร "ศูนย์" เริ่มต้น จากนั้นเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์จะแปลงอัตราส่วนการส่งผ่านเป็น 'การดูดกลืนแสง' ซึ่งเป็นความเข้มข้นของส่วนประกอบเฉพาะของตัวอย่างทดสอบโดยสัมพันธ์กับสารเริ่มต้น^{[ 6 ]}

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์บางประเภทที่พบได้ทั่วไป ได้แก่: ^{[ 15 ]}

• เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-Vis : วัดการดูดกลืนแสงในช่วงยูวีและช่วงแสงที่มองเห็นได้ (200-800 นาโนเมตร) ใช้สำหรับการหาปริมาณสารประกอบอนินทรีย์และอินทรีย์หลายชนิด
• เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์อินฟราเรด : วัดการดูดกลืนแสงอินฟราเรด ทำให้สามารถระบุพันธะเคมีและหมู่ฟังก์ชันได้
• เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์แบบดูดกลืนแสงอะตอม (AAS) : ใช้หลักการดูดกลืนแสงของอะตอมสารวิเคราะห์ที่ระเหยเป็นไอเพื่อหาความเข้มข้นของโลหะและโลหะกึ่งโลหะ
• เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบฟลูออเรสเซนซ์ : วัดความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนซ์ที่ปล่อยออกมาจากตัวอย่างหลังจากได้รับการกระตุ้น ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีฟลูออเรสเซนซ์ตามธรรมชาติหรือที่ถูกเหนี่ยวนำได้อย่างแม่นยำสูง
• เครื่องวัดสี : เครื่องวัดสเปกตรัมแบบง่ายที่ใช้ในการวัดการดูดกลืนแสงสำหรับการวิเคราะห์และทดสอบทางสี

สเปกโทรโฟโตเมตรีเป็นเทคนิคสำคัญที่ใช้ในการทดลองทางชีวเคมีหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับการแยก DNA, RNA และโปรตีน จลนศาสตร์ของเอนไซม์ และการวิเคราะห์ทางชีวเคมี^{[ 16 ]}เนื่องจากตัวอย่างในการใช้งานเหล่านี้หาได้ยากในปริมาณมาก จึงเหมาะอย่างยิ่งที่จะวิเคราะห์ด้วยเทคนิคที่ไม่ทำลายนี้ นอกจากนี้ ยังสามารถประหยัดตัวอย่างที่มีค่าได้โดยใช้แพลตฟอร์มปริมาตรเล็ก ซึ่งต้องการตัวอย่างเพียง 1 ไมโครลิตรสำหรับการวิเคราะห์ที่สมบูรณ์^{[ 17 ]} คำอธิบายโดยย่อของขั้นตอนสเปกโทรโฟโตเมตรี ได้แก่ การเปรียบเทียบการดูดกลืนแสงของตัวอย่างเปล่าที่ไม่มีสารประกอบสีกับตัวอย่างที่มีสารประกอบสี การให้สีนี้สามารถทำได้โดยใช้สีย้อม เช่น สีย้อม Coomassie Brilliant Blue G-250 ที่วัดที่ 595 นาโนเมตร หรือโดยปฏิกิริยาของเอนไซม์ เช่น ระหว่าง β-galactosidase และ ONPG (ทำให้ตัวอย่างเป็นสีเหลือง) ที่วัดที่ 420 นาโนเมตร^{[ 3 ] : 21–119} เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ใช้ในการวัดสารประกอบที่มีสีในช่วงแสงที่มองเห็นได้ (ระหว่าง 350 นาโนเมตรถึง 800 นาโนเมตร) ^{[ 3 ] : 65} ดังนั้นจึงสามารถใช้เพื่อค้นหาข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับสารที่กำลังศึกษา ในการทดลองทางชีวเคมี จะเลือกคุณสมบัติทางเคมีและ/หรือทางกายภาพ และขั้นตอนที่ใช้จะเฉพาะเจาะจงกับคุณสมบัตินั้นเพื่อหาข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับตัวอย่าง เช่น ปริมาณ ความบริสุทธิ์ กิจกรรมของเอนไซม์ เป็นต้น การวัดด้วยสเปกโตรโฟโตเมตรีสามารถใช้สำหรับเทคนิคหลายอย่าง เช่น การหาค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นที่เหมาะสมที่สุดของตัวอย่าง การหาค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของตัวอย่างที่ไม่ทราบค่า และการหาค่า pKa ของตัวอย่างต่างๆ^{[ 3 ] : 21–119} การวัดด้วยสเปกโตรโฟโตเมตรียังเป็นกระบวนการที่มีประโยชน์สำหรับการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์^{[ 18 ]}และยังสามารถใช้เป็นวิธีการสร้างการทดสอบทางแสงของสารประกอบได้อีกด้วย ข้อมูลสเปกโทรโฟโตเมตริกยังสามารถใช้ร่วมกับสมการ Beer–Lambert เพื่อกำหนดความสัมพันธ์ต่างๆ ระหว่างการส่งผ่านและความเข้มข้น และการดูดกลืนและความเข้มข้นได้อีกด้วย^{[ 3 ] : 21–119} เนื่องจากเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์วัดความยาวคลื่นของสารประกอบผ่านสี จึงสามารถเติมสารที่จับกับสีย้อมเพื่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงสีและสามารถวัดได้^{[ 19 ]}${\textstyle A=-\log _{10}T=\เอปไซลอน cl=OD}$สามารถทราบความเข้มข้นของส่วนผสมสององค์ประกอบได้โดยใช้สเปกตรัมการดูดกลืนแสงของสารละลายมาตรฐานของแต่ละองค์ประกอบ ในการทำเช่นนี้ จำเป็นต้องทราบค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงของส่วนผสมนี้ที่ความยาวคลื่นสองค่า และค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงของสารละลายที่มีน้ำหนักที่ทราบขององค์ประกอบทั้งสอง^{[ 20 ]}นอกเหนือจากแบบจำลองกฎของ Beer-Lambert แบบดั้งเดิมแล้ว ยังสามารถใช้สเปกโทรสโกปีแบบไม่ใช้ฉลากโดยใช้คิวเวตต์ ซึ่งเพิ่มตัวกรองแสงในเส้นทางของแสง ทำให้สเปกโทรโฟโตมิเตอร์สามารถวัดปริมาณความเข้มข้น ขนาด และดัชนีหักเหของตัวอย่างตามกฎของ Hand ^{[ 21 ]}สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ได้รับการพัฒนาและปรับปรุงมาหลายทศวรรษและมีการใช้งานอย่างแพร่หลายในหมู่นักเคมี นอกจากนี้ สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ยังเชี่ยวชาญในการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น UV หรือแสงที่มองเห็นได้^{[ 3 ] : 21–119} ถือว่าเป็นเครื่องมือที่มีความแม่นยำสูง มีความไวสูง และแม่นยำอย่างยิ่ง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการกำหนดการเปลี่ยนแปลงสี^{[ 22 ]}วิธีนี้ยังสะดวกต่อการใช้งานในการทดลองในห้องปฏิบัติการ เนื่องจากเป็นกระบวนการที่ราคาไม่แพงและค่อนข้างง่าย

เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ส่วนใหญ่ใช้ใน ย่าน UVและ ย่านแสง ที่มองเห็นได้และเครื่องมือบางชนิดยังทำงานใน ย่าน อินฟราเรด ใกล้ได้ อีกด้วย ความเข้มข้นของโปรตีนสามารถประมาณได้โดยการวัดค่า OD ที่ 280 นาโนเมตร เนื่องจากมีทริปโตเฟน ไทโรซีน และฟีนิลอะลานีน วิธีนี้ไม่แม่นยำมากนัก เนื่องจากองค์ประกอบของโปรตีนแตกต่างกันอย่างมาก และโปรตีนที่ไม่มีกรดอะมิโนเหล่านี้จะไม่มีการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ 280 นาโนเมตร การปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกก็อาจรบกวนได้เช่นกัน วิธีนี้ต้องใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่สามารถวัดในย่าน UV โดยใช้คิวเวตต์ควอตซ์^{[ 3 ] : 135}

สเปกโทรสโกปีอัลตราไวโอเลต-วิสิเบิล (UV-vis) เกี่ยวข้องกับระดับพลังงานที่กระตุ้นการเปลี่ยนผ่านทางอิเล็กตรอน การดูดกลืนแสง UV-vis จะกระตุ้นโมเลกุลที่อยู่ในสถานะพื้นฐานให้ไปสู่สถานะที่ถูกกระตุ้น^{[ 5 ]}

การวัดสเปกตรัมในช่วงคลื่นแสงที่มองเห็นได้ 400–700 นาโนเมตร ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายใน วิทยาศาสตร์ การวัดสี เป็นที่ทราบกันดีว่าการวัดนี้ได้ผลดีที่สุดในช่วงค่า OD 0.2–0.8 ผู้ผลิตหมึกพิมพ์ บริษัทพิมพ์ ผู้จำหน่ายสิ่งทอ และอีกมากมาย ต่างต้องการข้อมูลที่ได้จากการวัดสี โดยจะทำการวัดค่าในช่วงคลื่นแสงที่มองเห็นได้ทุกๆ 5–20 นาโนเมตร และสร้าง เส้นโค้ง การสะท้อนแสงสเปกตรัมหรือกระแสข้อมูลสำหรับการนำเสนอในรูปแบบต่างๆ เส้นโค้งเหล่านี้สามารถใช้ทดสอบสีชุดใหม่เพื่อตรวจสอบว่าตรงตามข้อกำหนดหรือไม่ เช่น มาตรฐานการพิมพ์ ISO

เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบดั้งเดิมในช่วงคลื่นแสงที่มองเห็นได้ไม่สามารถตรวจจับได้ว่าสารให้สีหรือวัสดุพื้นฐานมีคุณสมบัติเรืองแสงหรือไม่ ซึ่งอาจทำให้ยากต่อการจัดการปัญหาเรื่องสี เช่น หากหมึกพิมพ์อย่างน้อยหนึ่งชนิดมีคุณสมบัติเรืองแสง ในกรณีที่สารให้สีมีคุณสมบัติเรืองแสง จะใช้ เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบเรืองแสงสองสเปกตรัม เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ในช่วงคลื่นแสงที่มองเห็นได้มีสองแบบหลัก คือ d/8 (ทรงกลม) และ 0/45 ชื่อเรียกมาจากรูปทรงเรขาคณิตของแหล่งกำเนิดแสง ผู้สังเกต และภายในห้องวัด นักวิทยาศาสตร์ใช้เครื่องมือนี้ในการวัดปริมาณสารประกอบในตัวอย่าง หากสารประกอบมีความเข้มข้นมากขึ้น ตัวอย่างจะดูดซับแสงได้มากขึ้น ภายในช่วงความเข้มข้นแคบๆกฎของเบียร์-แลมเบิร์ตจะใช้ได้ และค่าการดูดซับแสงระหว่างตัวอย่างจะแปรผันตามความเข้มข้นแบบเชิงเส้น ในกรณีของการวัดการพิมพ์ มักใช้การตั้งค่าสองแบบ คือ แบบไม่มี/มีตัวกรองรังสียูวี เพื่อควบคุมผลกระทบของสารเพิ่มความสว่างรังสียูวีในกระดาษได้ดียิ่งขึ้น

โดยปกติแล้วจะเตรียมตัวอย่างในคิวเวตต์ซึ่งอาจทำจากแก้วพลาสติก(สำหรับช่วงสเปกตรัมแสงที่มองเห็นได้) หรือควอตซ์ ( สำหรับช่วงสเปกตรัมรังสีอัลตราไวโอเลตระยะไกล) ขึ้นอยู่กับช่วงสเปกตรัมที่สนใจ การใช้งานบางอย่างต้องการการวัดปริมาตรน้อย ซึ่งสามารถทำได้ด้วยแพลตฟอร์มปริมาตรขนาดเล็ก

• การประมาณความเข้มข้นของคาร์บอนอินทรีย์ที่ละลายในน้ำ
• ค่าการดูดกลืนรังสีอัลตราไวโอเลตจำเพาะสำหรับการวัดความเป็นอะโรมาติก
• การทดสอบของไบอัลเพื่อหาความเข้มข้นของเพนโทส

ดังที่อธิบายไว้ในส่วนการใช้งาน สเปกโตรโฟโตเมตรีสามารถใช้ได้ทั้งในการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณของ DNA, RNA และโปรตีน การวิเคราะห์เชิงคุณภาพสามารถใช้ได้ และใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ในการบันทึกสเปกตรัมของสารประกอบโดยการสแกนช่วงความยาวคลื่นกว้างเพื่อกำหนดคุณสมบัติการดูดกลืนแสง (ความเข้มของสี) ของสารประกอบที่แต่ละความยาวคลื่น^{[ 5 ]}การทดลองหนึ่งที่สามารถแสดงให้เห็นถึงการใช้งานต่างๆ ของสเปกโตรโฟโตเมตรีที่มองเห็นได้คือการแยก β-galactosidase ออกจากส่วนผสมของโปรตีนต่างๆ โดยส่วนใหญ่แล้ว สเปกโตรโฟโตเมตรีจะเหมาะสมที่สุดในการช่วยวัดปริมาณการทำให้บริสุทธิ์ของตัวอย่างเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมด โดยการใช้โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี สามารถแยก β-galactosidase และทดสอบได้โดยการทำปฏิกิริยาตัวอย่างที่เก็บรวบรวมกับOrtho-Nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) และตรวจสอบว่าตัวอย่างเปลี่ยนเป็นสีเหลืองหรือไม่^{[ 3 ] : 21–119} หลังจากการทดสอบตัวอย่างที่ 420 นาโนเมตรสำหรับการโต้ตอบเฉพาะกับ ONPG และที่ 595 สำหรับการทดสอบ Bradford ปริมาณการทำให้บริสุทธิ์สามารถประเมินได้ในเชิงปริมาณ^{[ 3 ] : 21–119} นอกจากนี้ การวัดด้วยสเปกโทรโฟโตเมตรียังสามารถใช้ร่วมกับเทคนิคอื่นๆ เช่น อิเล็กโทรโฟเรซิส SDS-Page เพื่อทำให้บริสุทธิ์และแยกตัวอย่างโปรตีนต่างๆ ได้

เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ที่ออกแบบมาสำหรับช่วงอินฟราเรดนั้นค่อนข้างแตกต่างกัน เนื่องจากข้อกำหนดทางเทคนิคในการวัดในช่วงนั้น ปัจจัยสำคัญประการหนึ่งคือประเภทของโฟโตเซนเซอร์ที่มีให้เลือกใช้สำหรับช่วงสเปกตรัมต่างๆ แต่การวัดอินฟราเรดก็เป็นเรื่องท้าทายเช่นกัน เพราะแทบทุกสิ่งทุกอย่างปล่อยรังสีอินฟราเรดออกมาในรูปของรังสีความร้อน โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ความยาวคลื่นเกินกว่าประมาณ 5 ไมโครเมตร

อีกหนึ่งปัญหาคือ วัสดุหลายชนิด เช่น แก้วและพลาสติก ดูดซับรังสีอินฟราเรด ทำให้ไม่เหมาะสมที่จะใช้เป็นตัวกลางทางแสง วัสดุทางแสงที่เหมาะสมคือเกลือซึ่งไม่ดูดซับรังสีมากนัก ตัวอย่างสำหรับการวัดด้วยสเปกโทรโฟโตเมตรีอินฟราเรดอาจทาลงบนตัวอย่างระหว่างแผ่นโพแทสเซียมโบรไมด์ สองแผ่น หรือบดผสมกับโพแทสเซียมโบรไมด์แล้วอัดเป็นเม็ด ในกรณีที่ต้องวัดสารละลายในน้ำ จะใช้ ซิลเวอร์คลอไรด์ ที่ไม่ละลายน้ำ ในการสร้างเซลล์

เครื่องวัดสเปกตรัมรังสี (Spectroradiometer ) ซึ่งทำงานคล้ายกับเครื่องวัดสเปกตรัมแสงในช่วงคลื่นแสงที่มองเห็นได้ ถูกออกแบบมาเพื่อวัดความหนาแน่นสเปกตรัมของแหล่งกำเนิดแสง การใช้งานอาจรวมถึงการประเมินและจัดหมวดหมู่แสงสว่างเพื่อการขายโดยผู้ผลิต หรือเพื่อให้ลูกค้าตรวจสอบว่าหลอดไฟที่พวกเขาตัดสินใจซื้อนั้นตรงตามข้อกำหนดหรือไม่ ส่วนประกอบ:

1. แหล่งกำเนิดแสงส่องลงบนหรือส่องผ่านตัวอย่าง
2. ตัวอย่างนั้นสามารถส่งผ่านหรือสะท้อนแสงได้
3. ตัวตรวจจับจะวัดปริมาณแสงที่สะท้อนหรือส่องผ่านตัวอย่าง
4. จากนั้นตัวตรวจจับจะแปลงปริมาณแสงที่ตัวอย่างส่งผ่านหรือสะท้อนออกมาเป็นตัวเลข

สำหรับผู้ที่เกี่ยวข้องในสาขากราฟิก สีคือคุณสมบัติของพื้นผิวของวัตถุที่กำหนดภายใต้แสงสว่างหรือแหล่งกำเนิดแสงที่กำหนด^{[ 23 ]}เพื่อให้ได้สีหรือการออกแบบเดียวกัน สีของตัวอย่างจะต้องได้รับการวัด^{[ 23 ]}นี่คือจุดที่เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์เข้ามามีบทบาท

มีการใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ประเภทต่างๆ สำหรับเทคโนโลยีการพิมพ์ที่แตกต่างกัน เครื่องพิมพ์ ออฟเซ็ต ใช้ สเปก โตรโฟโตมิเตอร์แบบพกพา และ แบบ สแกนวงปิด^{[ 24 ]} เครื่องพิมพ์ เฟ ล็กโซ เครื่องพิมพ์ โรโตกราเวียร์ เครื่องพิมพ์สกรีนและ เครื่องพิมพ์ ดิจิทัลใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบพกพาและแบบอินไลน์^{[ 24 ]}

ดวงตาของมนุษย์ รวมถึงสมอง อาจมีปัญหาในการรับรู้/การมองเห็นสี [ ^{25 ] บาง}คนอาจมีอาการตาบอดสีในขณะที่บางคนจะสังเกตเห็นว่าดวงตาของพวกเขาล้าและมองเห็นสีได้ไม่ดีเท่าที่ควรเมื่อเวลาผ่านไป^{[ 25 ]}  

เพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ สามารถใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ในการวัดเป้าหมายสีและควบคุมแถบสีได้^{[ 25 ]}ในอุตสาหกรรมการพิมพ์ สเปกโตรโฟโตมิเตอร์มี 3 ประเภท ได้แก่ แบบพกพา แบบพกพาพร้อมจอแสดงผลข้อมูล และแบบอัตโนมัติ^{[ 25 ]}  

อุปกรณ์อีกชนิดหนึ่งคือสเปกโตรเดนซิโตมิเตอร์ ซึ่งสามารถคำนวณค่าความหนาแน่นจากค่าสเปกตรัมได้^{[ 26 ]}ตามคำจำกัดความ สเปกโตรเดนซิโตมิเตอร์คือ "เครื่องวัดความหนาแน่นแบบใช้สเปกตรัมที่รวมฟังก์ชันของสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ เครื่องวัดสี และเครื่องวัดความหนาแน่นเข้าด้วยกัน" ^{[ 27 ]}

• สเปกโตรโฟโตเมตรีการดูดกลืนอะตอม
• สเปกโทรสโกปีการปล่อยอะตอม
• สเปกโทรสโกปีการปล่อยอะตอมของพลาสมาแบบเหนี่ยวนำ
• สเปกโทรเมตรีมวลพลาสมาแบบเหนี่ยวนำ
• แอลโบซ
• ไมโครสเปกโตรโฟโตเมตรี
• สเปกโทรสโกปีความลาดชัน
• การวัดสเปกตรัมรังสี

วิกิมีเดียคอมมอนส์มีสื่อที่เกี่ยวข้องกับสเปกโทรโฟโตเมตรี

• คู่มือการวัดสเปกตรัม (Spectrophotometry Handbook) ถูกเก็บถาวรเมื่อวันที่ 5 ธันวาคม 2008 ที่Wayback Machine