N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D ( NAPE-PLD ) เป็นเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาการปลดปล่อยN-acylethanolamine (NAE) จากN-acyl-phosphatidylethanolamine (NAPE) ซึ่งเป็นส่วนสำคัญของกระบวนการที่เปลี่ยนลิปิด ธรรมดา ให้เป็นสัญญาณทางเคมี เช่นอานันดาไมด์และโอเลออยล์เอทานอลา มี นในมนุษย์ โปรตีน NAPE-PLD ถูกเข้ารหัสโดยยีนNAPEPLD ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

NAPE-PLD เป็นเอนไซม์ที่มีกิจกรรม - ฟอสโฟลิเปสซึ่งทำหน้าที่กับฟอสโฟลิปิดที่พบในเยื่อหุ้มเซลล์ไม่ใช่ความคล้ายคลึงกันแต่เป็นผลลัพธ์ทางเคมีของกิจกรรมที่ทำให้มันถูกจัดอยู่ในกลุ่มฟอสโฟลิเปส Dกิจกรรมของเอนไซม์นี้ถูกค้นพบและระบุลักษณะในชุดการทดลอง ซึ่งนำไปสู่การตีพิมพ์แผนการทำให้บริสุทธิ์ทางชีวเคมีในปี 2547 ซึ่งทำให้สามารถจัดลำดับเปปไทด์ ได้ ^{[ 2 ]} นักวิจัยได้ บดหัวใจของหนู 150 ตัว ให้เป็นเนื้อเดียวกัน (บดละเอียด) และนำสารละลายดิบ ที่ได้ ไปตกตะกอนด้วยซูโครสที่ 105,000 xg เพื่อแยกเยื่อหุ้มเซลล์ออกจากส่วนที่เหลือของเซลล์ จากนั้น โปรตีนเมมเบรนแบบอินทิกรัลจะถูกละลายโดยใช้โอคทิลกลูโคไซด์ และนำไปผ่านกระบวนการ โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์สี่ขั้น ตอน (คอลัมน์แลกเปลี่ยนแคตไอออน HiTrap SP HP, คอลัมน์แลกเปลี่ยนแอนไอออน HiTrap Q, คอลัมน์ความสัมพันธ์ HiTrap Blue, คอลัมน์ไฮดรอกซีอะพาไทต์ Bio-Gel HTP) แต่ละขั้นตอนจะแยกโปรตีนเมมเบรนชนิดต่างๆ ลงในภาชนะบรรจุตัวอย่างที่แตกต่างกัน เมื่อโปรตีนถูกชะออกจากคอลัมน์ตามเวลา การวัดกิจกรรมของตัวอย่างในแต่ละภาชนะทำให้สามารถติดตามได้ว่าตัวอย่างใดได้รับเอนไซม์ที่ออกฤทธิ์ การวัดกิจกรรมของเอนไซม์ทำได้โดยโครมาโทกราฟีแบบแผ่นบางของสารตั้งต้น กัมมันตรังสี ที่ไวต่อกิจกรรมของเอนไซม์ NAPE-PLD: การแตกตัวของสารตั้งต้นส่งผลต่อตำแหน่งที่ปรากฏบนแผ่นเมื่อตรวจจับรังสีด้วยเครื่องวิเคราะห์ภาพทางชีวภาพ

ผลลัพธ์ของกระบวนการที่ครอบคลุมนี้ยังไม่ใช่โปรตีนบริสุทธิ์ แต่ได้แถบจำนวนจำกัดจากการวิเคราะห์ด้วยSDS-PAGEและพบว่า แถบขนาด 46 กิโลดาลตัน มีความสัมพันธ์กับความเข้มของกิจกรรมเอนไซม์ แถบนี้ถูกตัดออกจากเจลและย่อยด้วย ทริปซินจากนั้นเปปไทด์จากแถบนี้จะถูกแยกออกจากกันด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบย้อนกลับ เฟส ชิ้นส่วนที่ได้จะถูกวิเคราะห์ลำดับไมโครด้วย การย่อยสลายแบบ Edmanอัตโนมัติ^{[ 5 ]} สามชิ้นส่วนตรงกับไวเมนตินซึ่งเป็น โปรตีน เส้นใยระดับกลางขนาด 56 กิโลดาลตันที่เชื่อว่าเป็นสารปนเปื้อน และอีกสองชิ้นส่วนตรงกับโคลน cDNA ที่ระบุในภายหลังว่าเป็น NAPE-PLD

เมื่อได้รับเบาะแสนี้แล้ว การระบุตัวตนสามารถยืนยันได้ด้วยขั้นตอนที่ไม่ยุ่งยากกว่า: การแสดงออกเกินของ cDNA NAPE-PLD ที่คาดการณ์ไว้ในเซลล์ COS-7ทำให้เกิดกิจกรรมเอนไซม์ NAPE-PLD ที่แข็งแกร่ง ซึ่งลักษณะเฉพาะแสดงให้เห็นว่าคล้ายกับสารสกัดจากหัวใจดั้งเดิม^{[ 2 ]}

ลำดับcDNA ของ NAPEPLD ทำนายลำดับ กรดอะมิโน 396 ลำดับในทั้งหนูและหนูแรต ซึ่งมีความเหมือนกัน 89% และ 90% กับของมนุษย์^{[ 2 ]} พบว่า NAPE-PLD ไม่มีความคล้ายคลึงกับ ยีน ฟอสโฟลิเปส D ที่รู้จัก แต่สามารถจัดประเภทตามความคล้ายคลึงให้อยู่ในตระกูลซิงค์เมทัลโลไฮโดร เลส ของโครงสร้างเบต้า-แลคตาเมสได้โดยเฉพาะอย่างยิ่ง พบว่ามีโมทีฟที่อนุรักษ์ไว้อย่างสูงH X( E / H )X D ( C / R / S / H ) X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D )X _30–70 Hซึ่งโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับ การจับ สังกะสีและ ปฏิกิริยา ไฮโดรไลซิสในโปรตีนกลุ่มนี้ ทำให้ผู้เขียนเสนอว่ากิจกรรมควรมีความสัมพันธ์กับปริมาณสังกะสี

เมื่อทดสอบ NAPE-PLD ที่สร้างขึ้นใหม่ ในเซลล์ COS ในหลอดทดลองพบว่ามีกิจกรรมที่คล้ายคลึงกันต่อ สารตั้งต้นที่มีการติดฉลากด้วย รังสี หลายชนิด ได้แก่ N-palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine และ N-stearoylphosphatidylethanolamine โดยทั้งหมดทำปฏิกิริยาด้วยค่าK _mระหว่าง 2–4 ไมโครโมลาร์และค่าV _maxระหว่าง 73 ถึง 101 นาโนโมลต่อมิลลิกรัมต่อนาที ตามที่คำนวณได้จากกราฟLineweaver–Burk ^{[ 2 ]} (สารเหล่านี้สร้าง N- palmitoylethanolamine , anandamide , N- oleoylethanolamineและ N-stearoylethanolamine ตามลำดับ) เอนไซม์ยังทำปฏิกิริยากับ N-palmitoyl-lyso-phosphatidylethanolamine และ N-arachidonoyl-lyso-phosphatidylethanolamine ด้วยค่า K _m ที่คล้ายกัน แต่มีค่า V _{max น้อยกว่าหนึ่งในสามถึงหนึ่งในสี่ กิจกรรมเหล่านี้สอดคล้องกับการสังเกตว่าเนื้อเยื่อหลายชนิดผลิต} N - acylethanolaminesหลายชนิด

อย่างไรก็ตาม NAPE-PLD ไม่มีความสามารถในการผลิตกรดฟอสฟาติดิก ที่ตรวจจับได้ จากฟอสฟาติดิลโคลีนหรือ ฟอสฟาติดิ ลเอทานอลามี น ดังเช่นที่เอนไซม์ ฟอสโฟลิเปส Dอื่นๆ เร่งปฏิกิริยา นอกจากนี้ยังขาดกิจกรรมการถ่ายโอนฟอสฟาติดิลของฟอสโฟลิเปส D ซึ่งช่วยให้เกิดการสร้างฟอสฟาติดิลแอลกอฮอล์แทนที่จะเป็นกรดฟอสฟาติดิกในสภาวะที่มีเอทานอลหรือบิวทานอล

เอนไซม์นี้ทำหน้าที่เป็นขั้นตอนที่สองของเส้นทางชีวเคมีที่เริ่มต้นด้วยการสร้างN-acylphosphatidylethanolamineโดยการถ่ายโอนกลุ่มอะซิลจาก ตำแหน่ง sn -1 ของกลีเซอโรฟอสโฟลิ ปิด ไปยังกลุ่มอะมิโน ของฟอสฟาติ ดิลเอทานอลามีน [ ^{2 ] ใน}ขณะที่ NAPE-PLD มีส่วนช่วยในการสังเคราะห์ NAE หลายชนิดในระบบประสาทส่วนกลาง ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม แต่ยังไม่ชัดเจนว่าเอนไซม์นี้มีส่วนรับผิดชอบต่อการสร้างเอนโดแคนนาบินอยด์อนั นดาไมด์หรือไม่ เนื่องจากมีรายงานว่า หนูที่ขาด NAPE-PLD มีระดับอนันดาไมด์เท่ากับหนูปกติหรือมีระดับลดลงมาก^{[ 6 ]}

N -acylethanolaminesที่ปล่อยออกมาจากเอนไซม์นี้จะกลายเป็นสารตั้งต้นที่มีศักยภาพสำหรับfatty acid amide hydrolase (FAAH) ซึ่งจะไฮโดรไลซ์กรดไขมันอิสระจากเอทานอลอะมีน ความบกพร่องในเอนไซม์นี้อาจทำให้ผลิตภัณฑ์ NAPE-PLD เช่น อานันดาไมด์ สะสมจนมีระดับสูงกว่าปกติถึง 15 เท่า^{[ 7 ]}

เอนไซม์เมมเบรนนี้ก่อตัวเป็นโฮโมไดเมอร์โดยแยกออกจากกันบางส่วนด้วยช่องภายในกว้างประมาณ 9 Å ^{[ 8 ]} โครงสร้างโปรตีน เมทัลโลเบตา-แลคตาเมสได้รับการปรับให้เข้ากับการเชื่อมโยงกับฟอสโฟลิ ปิดของเมมเบรน โพรง ไฮโดรโฟบิกเป็นทางเข้าสำหรับสารตั้งต้นNAPEเข้าสู่บริเวณออกฤทธิ์ ซึ่งศูนย์สังกะสีแบบสองนิวเคลียสจะเร่งปฏิกิริยาไฮโดรไลซิส กรดน้ำดีจะจับกับช่องที่เลือกในโพรงนี้ด้วยความสัมพันธ์สูง ช่วยเพิ่มการประกอบไดเมอร์และทำให้เกิดการเร่งปฏิกิริยา NAPE-PLD ช่วยอำนวยความสะดวกในการสื่อสารระหว่าง สัญญาณ กรดน้ำดีและสัญญาณอะไมด์ของลิปิด^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]}

ยา ขับปัสสาวะกลุ่มไทอะไซด์และคล้ายไทอะไซด์เป็นยา ที่มีประสิทธิภาพและใช้กันอย่างแพร่หลาย ในการรักษาความดันโลหิตสูงอาการบวมน้ำและ โรคหัวใจ และหลอดเลือด ที่สำคัญ แม้ว่าจะมีการใช้ทางคลินิกมานานกว่าหกทศวรรษ กลไกการออกฤทธิ์ของยาเหล่านี้ในการรักษาความดันโลหิตสูงหลังจากการใช้ในระยะยาวก็ยังคงเป็นปริศนาอยู่ เมื่อเร็วๆ นี้ Garau Gianpiero และผู้ร่วมเขียนได้รายงานว่าเอนไซม์เมมเบรนNAPE-PLDเป็นเป้าหมายทั้งในและนอกไตของไฮโดรคลอโรไทอะไซด์ คลอ ร์ทาลิโดนและอินดาพาไมด์ซึ่งช่วยให้เข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ในการรักษาความดันโลหิตสูงและโรคหัวใจและหลอดเลือดได้ ดียิ่ง ขึ้น^{[ 11 ]}จากโครงสร้างผลึกของ NAPE-PLD ที่ซับซ้อนกับไฮโดรคลอโรไทอะไซด์และไพริดอกซาลฟอสเฟต (PLP) พบว่าโมเลกุลของไทอะไซด์จะจับกับช่องภายในของ NAPE-PLD ที่กว้าง 9 อังสตรอมในลักษณะที่แข่งขันกับโคแฟคเตอร์PLPเมื่อมีกรดน้ำดีอยู่ การจับตัวกันของ NAPE-PLD กับเยื่อหุ้มเซลล์จะสร้างรูพรุนในเยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่งเป็นทางเดินนำไฟฟ้าแบบไดนามิกที่ทำให้ PLP ที่มีประจุสามารถแพร่ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์และเยื่อหุ้มของส่วนประกอบย่อยภายในเซลล์ (เช่นไมโทคอนเดรียและเพอร์ออกซิโซม ) ได้ ข้อเท็จจริงที่ว่ายา ไทอะไซด์ ส่งเสริมผลดีที่เกี่ยวข้องโดยตรงกับโปรตีนหลักของระบบเอนโดแคนนาบินอยด์คือ NAPE-PLD เผยให้เห็นไม่เพียงแต่เป้าหมายใหม่สำหรับโรคหัวใจและหลอดเลือด เท่านั้น แต่ยังเป็นวิธีในการปรับระบบเอนโดแคนนาบินอยด์อย่างมีประสิทธิภาพในการรักษาอีกด้วย ผลลัพธ์เหล่านี้อาจเป็นประโยชน์ในการจัดการปัจจัยเสี่ยงของหลอดเลือด ตลอดจน โรค เม็ดเลือดขาวในสมองและโรคปลอกประสาทเสื่อมที่ เกี่ยวข้อง