กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์

กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์
การใช้งาน	การสังเกตวัสดุชีวภาพที่ไม่ย้อมสีด้วยกล้องจุลทรรศน์
นักประดิษฐ์	ฟริตส์ เซอร์นิเก
ผู้ผลิต	Leica , Zeiss , Nikon , Olympusและอื่นๆ
แบบอย่าง	กกต
รายการที่เกี่ยวข้อง	กล้องจุลทรรศน์แบบความแตกต่างของการรบกวนเชิงอนุพันธ์ , กล้องจุลทรรศน์แบบความแตกต่างของการปรับความเข้มแสงของฮอฟฟ์แมน , กล้องจุลทรรศน์แบบความแตกต่างของเฟสเชิงปริมาณ

กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟส (PCM) เป็น เทคนิค กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่แปลงการเปลี่ยนแปลงเฟสของแสงที่ผ่านตัวอย่างโปร่งใสไปเป็นการเปลี่ยนแปลงความสว่างในภาพ การเปลี่ยนแปลงเฟสเองนั้นมองไม่เห็นด้วยตาเปล่า แต่จะมองเห็นได้เมื่อแสดงออกมาในรูปของการเปลี่ยนแปลงความสว่าง

เมื่อคลื่นแสงเดินทางผ่านตัวกลางอื่นที่ไม่ใช่สุญญากาศปฏิสัมพันธ์กับตัวกลางจะทำให้แอมพลิจูดและเฟสของ คลื่น เปลี่ยนแปลงไปในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของตัวกลาง การเปลี่ยนแปลงของแอมพลิจูด (ความสว่าง) เกิดจากการกระเจิงและการดูดกลืนของแสง ซึ่งมักขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นและอาจทำให้เกิดสีต่างๆ อุปกรณ์ถ่ายภาพและดวงตาของมนุษย์ไวต่อการเปลี่ยนแปลงของแอมพลิจูดเท่านั้น ดังนั้นหากไม่มีการจัดเตรียมพิเศษ การเปลี่ยนแปลงของเฟสจึงมองไม่เห็น แต่การเปลี่ยนแปลงของเฟสมักสื่อถึงข้อมูลที่สำคัญ

กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์มีความสำคัญอย่างยิ่งในทางชีววิทยา มันเผยให้เห็น โครงสร้าง ของเซลล์ หลายอย่าง ที่ไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบส่องสว่าง ดังตัวอย่างในรูป โครงสร้างเหล่านี้ถูกทำให้มองเห็นได้โดยนักจุลทรรศน์รุ่นก่อนๆ ด้วยการย้อมสีแต่ต้องมีการเตรียมการเพิ่มเติมและทำให้เซลล์ตาย กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ทำให้เป็นไปได้สำหรับนักชีววิทยาที่จะศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตและวิธีการแพร่พันธุ์ของเซลล์ผ่านการแบ่งเซลล์มันเป็นหนึ่งในไม่กี่วิธีที่มีอยู่เพื่อวัดปริมาณโครงสร้างและส่วนประกอบของเซลล์โดยไม่ต้องใช้ฟลูออเรสเซนซ์ [ ^{1 ] หลังจาก} การประดิษฐ์ขึ้นในช่วงต้นทศวรรษ 1930 ^{[ 2 ]}กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์พิสูจน์แล้วว่าเป็นความก้าวหน้าอย่างมากในด้านกล้องจุลทรรศน์ จนผู้ประดิษฐ์Frits Zernikeได้รับรางวัลโนเบลสาขาฟิสิกส์ในปี 1953 ^{[ 3 ]}ผู้หญิงที่ผลิตกล้องจุลทรรศน์นี้Caroline Bleekerมักไม่ได้รับการยกย่อง

หลักการพื้นฐานในการทำให้การเปลี่ยนแปลงเฟสปรากฏให้เห็นได้ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟส คือการแยกแสงส่องสว่าง (พื้นหลัง) ออกจากแสงที่กระเจิงจากตัวอย่าง (ซึ่งประกอบเป็นรายละเอียดในส่วนหน้า) และจัดการแสงทั้งสองนี้แตกต่างกัน

แสงสว่างรูปวงแหวน (แสดงด้วยสีเขียวในรูป) ที่ผ่าน วงแหวน ของคอนเดนเซอร์จะถูกโฟกัสไปที่ชิ้นงานโดยคอนเดนเซอร์ แสงสว่างบางส่วนจะกระเจิงโดยชิ้นงาน (สีเหลือง) แสงที่เหลือจะไม่ได้รับผลกระทบจากชิ้นงานและกลายเป็นแสงพื้นหลัง (สีแดง) เมื่อสังเกตชิ้นงานชีวภาพที่ไม่ได้ย้อมสี แสงที่กระเจิงจะมีค่าอ่อนและโดยทั่วไปจะมีเฟสเลื่อนไป −90° (เนื่องจากความหนาโดยทั่วไปของชิ้นงานและความแตกต่างของดัชนีหักเหระหว่างเนื้อเยื่อชีวภาพกับตัวกลางโดยรอบ) เมื่อเทียบกับแสงพื้นหลัง ซึ่งทำให้ส่วนหน้า (เวกเตอร์สีน้ำเงินในรูปประกอบ) และส่วนหลัง (เวกเตอร์สีแดง) มีความเข้มเกือบเท่ากัน ส่งผลให้ความคมชัดของภาพต่ำ

ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟส ความคมชัดของภาพจะเพิ่มขึ้นได้สองวิธี: โดยการสร้างการรบกวนแบบเสริมกันระหว่างรังสีแสงที่กระเจิงและรังสีแสงพื้นหลังในบริเวณของขอบเขตการมองเห็นที่มีตัวอย่าง และโดยการลดปริมาณแสงพื้นหลังที่ไปถึงระนาบภาพ^{[ 4 ]}ประการแรก แสงพื้นหลังจะถูกเปลี่ยนเฟสไป −90° โดยการส่งผ่านวงแหวนเปลี่ยนเฟส ซึ่งจะขจัดความแตกต่างของเฟสระหว่างพื้นหลังและรังสีแสงที่กระเจิง

เมื่อแสงถูกโฟกัสไปที่ระนาบภาพ (ซึ่งวางกล้องหรือช่องมองภาพไว้) การเปลี่ยนเฟสนี้จะทำให้รังสีแสงพื้นหลังและแสงกระเจิงที่มาจากบริเวณของขอบเขตการมองเห็นที่มีตัวอย่าง (เช่น พื้นหน้า) เกิดการแทรกสอดแบบเสริมกันส่งผลให้ความสว่างของบริเวณเหล่านั้นเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับบริเวณที่ไม่มีตัวอย่าง สุดท้าย แสงพื้นหลังจะถูกลดความสว่างลงประมาณ 70-90% ด้วย วงแหวน ฟิลเตอร์ความหนาแน่นกลางวิธีนี้จะเพิ่มปริมาณแสงกระเจิงที่เกิดจากแสงส่องสว่างให้มากที่สุด ในขณะที่ลดปริมาณแสงส่องสว่างที่ไปถึงระนาบภาพให้น้อยที่สุด แสงกระเจิงบางส่วนที่ส่องสว่างทั่วพื้นผิวของฟิลเตอร์จะถูกเปลี่ยนเฟสและลดความสว่างลงโดยวงแหวน แต่ในระดับที่น้อยกว่าแสงพื้นหลังมาก ซึ่งส่องสว่างเฉพาะวงแหวนเปลี่ยนเฟสและวงแหวนฟิลเตอร์ความหนาแน่นกลางเท่านั้น

ข้างต้นอธิบายถึงความแตกต่างของเฟสเชิงลบใน รูปแบบ เชิงบวก แสงพื้นหลังจะถูกเลื่อนเฟสไป +90° ดังนั้นแสงพื้นหลังจะมีเฟสต่างจากแสงที่กระเจิง 180° จากนั้นแสงที่กระเจิงจะถูกลบออกจากแสงพื้นหลังเพื่อสร้างภาพที่มีพื้นหน้ามืดกว่าและพื้นหลังสว่างกว่า ดังแสดงในรูปแรก^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}

ความสำเร็จของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสได้นำไปสู่วิธี การสร้างภาพเฟสหลายวิธีในเวลาต่อมาในปี พ.ศ. 2495 Georges Nomarskiได้จดสิทธิบัตรสิ่งที่ปัจจุบันรู้จักกันในชื่อกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์การรบกวนเชิงอนุพันธ์ (DIC) [ ^{8 ] กล้องจุลทรรศน์} ชนิดนี้ช่วยเพิ่มคอนทราสต์โดยการสร้างเงาเทียม ราวกับว่าวัตถุถูกส่องสว่างจากด้านข้าง แต่กล้องจุลทรรศน์ DIC ไม่เหมาะสมเมื่อวัตถุหรือภาชนะบรรจุเปลี่ยนโพลาไรเซชัน ด้วยการใช้งานภาชนะพลาสติกโพลาไรซ์ที่เพิ่มมากขึ้นในชีววิทยาของเซลล์ กล้องจุลทรรศน์ DIC จึงถูกแทนที่ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์การปรับเปลี่ยนของ Hoffmanซึ่งคิดค้นโดย Robert Hoffman ในปี พ.ศ. 2518 มากขึ้นเรื่อยๆ ^{[ 9 ]}

วิธีการคอนทราสต์เฟสแบบดั้งเดิมจะเพิ่มคอนทราสต์ทางแสง โดยผสมผสานข้อมูลความสว่างและเฟสเข้าไว้ในภาพเดียว นับตั้งแต่มีการนำกล้องดิจิทัล มาใช้ ในช่วงกลางทศวรรษ 1990 ได้มีการพัฒนาวิธีการสร้างภาพเฟสดิจิทัลใหม่ๆ หลายวิธี ซึ่งเรียกรวมกันว่ากล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสเชิงปริมาณ วิธีการเหล่านี้สร้างภาพแยกกันสองภาพแบบดิจิทัล ได้แก่ ภาพ สนามสว่างธรรมดาและภาพที่เรียกว่าภาพเปลี่ยนเฟสในแต่ละจุดของภาพ ภาพเปลี่ยนเฟสจะแสดงค่า การเปลี่ยนเฟสเชิง ปริมาณที่เกิดจากวัตถุ ซึ่งเป็นสัดส่วนกับความหนาเชิงแสงของวัตถุ^{[ 10 ]}ด้วยวิธีนี้ การวัดสนามแสงที่เกี่ยวข้องสามารถแก้ไขสิ่งแปลกปลอมที่เป็นรัศมีที่เกี่ยวข้องกับคอนทราสต์เฟสแบบดั้งเดิมได้โดยการแก้ปัญหาผกผันทางแสงเพื่อสร้างศักยภาพการกระเจิงของวัตถุขึ้นใหม่ด้วยวิธีการคำนวณ^{[ 11 ]}

• การถ่ายภาพเซลล์มีชีวิต
• การถ่ายภาพแบบคอนทราสต์เฟส
• การถ่ายภาพเอกซเรย์แบบคอนทราสต์เฟส

วิกิมีเดียคอมมอน ส์มีสื่อที่เกี่ยวข้องกับกล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟส

• คู่มือเบื้องต้นเกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง — กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสโดย มหาวิทยาลัยรัฐฟลอริดา
• กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสและแบบดาร์กฟิลด์ (มหาวิทยาลัยปารีส-ซูด)
• ส่วนประกอบต่างๆ ของกล้องจุลทรรศน์ที่ควรรู้