ในพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลความสัมพันธ์ระหว่างแต่ละบุคคลจะถูกกำหนดโดยใช้ลักษณะเฉพาะ เช่นDNA , RNAหรือโปรตีน ซึ่งอาจได้มาจากการใช้เทคโนโลยี การจัดลำดับหลาย วิธี การจัดลำดับรุ่นใหม่ที่มีความเร็วสูงได้กลายเป็นเทคนิคยอดนิยมในด้านทรานสคริปโต มิกส์ ซึ่งแสดงถึงภาพรวมของการแสดงออกของยีน ในยูคาริ โอต การอนุมานทางวิวัฒนาการโดยใช้RNA นั้นมีความซับซ้อนเนื่องจากการตัดต่อทางเลือก (alternative splicing ) ซึ่งสร้างทรานสคริปต์ หลายแบบ จากยีน เดียว ดังนั้นจึงอาจใช้วิธีการต่างๆ เพื่อปรับปรุงการอนุมานทางวิวัฒนาการโดยใช้ข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์ที่ได้จากRNA-Seqและประมวลผลโดยใช้พันธุศาสตร์เชิงคำนวณ

มีการนำเทคโนโลยีทางด้านทรานสคริปโตมิกส์ หลายอย่าง มาใช้ในการรวบรวมข้อมูลลำดับเบสของทรานสคริปโตมอย่างไรก็ตาม เทคโนโลยีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดคือRNA- Seq

สามารถหาข้อมูลลำดับ RNA ได้โดยใช้วิธี RNA-seq ที่หลากหลาย

มี ฐานข้อมูลสาธารณะหลายแห่งที่รวบรวมข้อมูล RNA-Seq ไว้ให้ใช้งานได้ฟรี

ข้อมูล RNA-Seq สามารถนำมาประกอบเป็นทรานสคริปต์ ได้โดยตรง โดยใช้การประกอบลำดับ (sequence assembly ) โดยทั่วไปแล้ว การประกอบลำดับมักแบ่งออกเป็น สองประเภทหลัก :

1. การประกอบทรานสคริปโตมแบบde novo - มีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อไม่มีจีโนมอ้างอิง สำหรับ สายพันธุ์ นั้น ๆ
2. การประกอบลำดับจีโนมโดยใช้จีโนมเป็นแนวทาง (บางครั้งเรียกว่า การจับคู่ หรือ การประกอบลำดับโดยใช้ข้อมูลอ้างอิง) - สามารถใช้ข้อมูลอ้างอิงที่มีอยู่แล้วเป็นแนวทางในการประกอบลำดับทรานสคริปต์ได้

ทั้งสองวิธีพยายามสร้างโครงสร้างระดับไอโซฟอร์มที่เป็นตัวแทนทางชีวภาพจากข้อมูล RNA-seq และโดยทั่วไปพยายามเชื่อมโยงไอโซฟอร์มกับโครงสร้างระดับยีน อย่างไรก็ตาม การระบุโครงสร้างระดับยีนอย่างถูกต้องอาจมีความซับซ้อนเนื่องจากการทำสำเนาซ้ำ ล่าสุด พาราโลก การตัดต่อทางเลือก หรือการหลอมรวมยีนความซับซ้อนเหล่านี้อาจทำให้เกิดปัญหาในขั้นตอนต่อไปของการอนุมานออร์โธโลก เมื่อเลือกหรือสร้างข้อมูลลำดับ สิ่งสำคัญคือต้องพิจารณาชนิดของเนื้อเยื่อ ระยะการพัฒนา และสภาพแวดล้อมของสิ่งมีชีวิต เนื่องจากทรานสคริปโตมแสดงถึงภาพรวมของการแสดงออกของยีนการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในสภาวะเหล่านี้อาจส่งผลกระทบอย่างมากต่อทรานสคริปต์ที่แสดงออก ซึ่งอาจส่งผลเสียต่อการตรวจจับออร์โธโลกในขั้นตอนถัดไป^{[ 1 ]}

นอกจากนี้ ยังสามารถขอรับ RNA จากฐานข้อมูลสาธารณะ เช่นGenBank , RefSeq , 1000 Plants (1KP)และ1KITE ได้อีก ด้วย ฐานข้อมูลสาธารณะเหล่านี้มักมีลำดับเบสที่ผ่านการคัดกรองแล้ว ซึ่งสามารถปรับปรุงคุณภาพการอนุมานและหลีกเลี่ยงภาระการคำนวณที่เกี่ยวข้องกับการประกอบลำดับเบสได้

การอนุมาน ออร์โธล็อกหรือพาราล็อกต้องอาศัยการประเมินความเหมือนกันของลำดับโดยปกติผ่านการจัดเรียงลำดับการวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการและการจัดเรียงลำดับมักถูกพิจารณาร่วมกัน เนื่องจากการวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการโดยใช้DNA หรือ RNA จำเป็นต้องมีการจัดเรียงลำดับ และการจัดเรียงลำดับเองมักแสดงถึงสมมติฐานบางอย่างเกี่ยวกับความเหมือนกันเนื่องจากการระบุออร์โธล็อกที่ถูกต้องเป็นสิ่งสำคัญต่อการวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการ จึงมีวิธีการต่างๆ มากมายที่ใช้ในการอนุมานออร์โธล็อกและพาราล็อก^{[ 2 ]}

โดยทั่วไปแล้ว วิธีการเหล่านี้จะถูกจำแนกออกเป็นอัลกอริทึมแบบกราฟหรืออัลกอริทึมแบบต้นไม้ ตัวอย่างของวิธีการแบบกราฟ ได้แก่ InParanoid ^{[ 3 ]} MultiParanoid ^{[ 4 ]} OrthoMCL ^{[ 5 ]} HomoloGene ^{[ 6 ]}และ OMA ^{[ 7 ]}อัลกอริทึมแบบต้นไม้ ได้แก่ โปรแกรมต่างๆ เช่น OrthologID หรือ RIO ^{[ 8 ] [ 2 ]}

โดย ทั่วไปแล้วมีการใช้วิธี BLASTที่หลากหลายเพื่อตรวจหาออร์โธล็อกระหว่างสปีชีส์โดยเป็นส่วนหนึ่งของอัลกอริทึมแบบกราฟ เช่น MegaBLAST, BLASTALL หรือ BLAST แบบ all-versus-all รูปแบบอื่นๆ และอาจเป็นการจัดเรียงตามนิวคลีโอไทด์หรือโปรตีน^{[ 9 ] [ 10 ]} RevTrans ^{[ 11 ]}จะใช้ข้อมูลโปรตีนเพื่อแจ้งการจัดเรียง DNA ซึ่งอาจเป็นประโยชน์สำหรับการแก้ไขความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการที่ห่างไกลออกไป วิธีการเหล่านี้มักจะถือว่าการจับคู่แบบย้อนกลับที่ดีที่สุดที่ผ่านเกณฑ์เมตริกบางอย่าง เช่น ความเหมือน ค่า E หรือเปอร์เซ็นต์การจัดเรียง แสดงถึงออร์โธล็อกและอาจสับสนได้จากการเรียงลำดับสายพันธุ์ที่ไม่สมบูรณ์^{[ 12 ] [ 13 ]}

สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือ ความสัมพันธ์แบบออร์โธโลยีในฐานข้อมูลสาธารณะโดยทั่วไปจะแสดงถึงออร์โธโลยีในระดับยีน และไม่ได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับรูปแบบการตัดต่อทางเลือกที่ได้ รับการอนุรักษ์ ไว้

ฐานข้อมูลที่บรรจุและ/หรือตรวจจับความสัมพันธ์แบบออร์โธล็อกัส ได้แก่:

เนื่องจากการถอดรหัสยูคาริโอตเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนซึ่งสามารถสร้างทรานสคริปต์ ได้หลายรายการจาก ยีน เดียว ผ่านการสไปลซิงทางเลือก ที่มี การแสดงออกที่แปรผันการใช้ RNA จึงซับซ้อนกว่า DNA อย่างไรก็ตามการจัดลำดับทรานสคริปโตมมีราคาถูกกว่าการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด และอาจได้รับโดยไม่ต้องใช้จีโนมอ้างอิง ที่มีอยู่ก่อน ^{[ 1 ]}

การแปลลำดับ RNA เป็นลำดับโปรตีนไม่ใช่เรื่องแปลก เมื่อใช้ข้อมูลทรานสคริปโตมิก โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อวิเคราะห์กลุ่มสิ่งมีชีวิตที่มีความแตกต่างสูง นี่เป็นขั้นตอนที่เข้าใจได้ง่าย เนื่องจากคาดว่าทรานสคริปต์จำนวนมาก (แต่ไม่ใช่ทั้งหมด) จะเข้ารหัส โปรตีนไอโซฟอร์มประโยชน์ที่อาจเกิดขึ้น ได้แก่ การลดอคติของการกลายพันธุ์และจำนวนอักขระที่ลดลง ซึ่งอาจช่วยเร่งการวิเคราะห์ อย่างไรก็ตาม การลดจำนวนอักขระนี้อาจส่งผลให้สูญเสียอักขระที่มีข้อมูลที่เป็นประโยชน์ได้^{[ 1 ]}

มีเครื่องมือหลายอย่างที่ใช้สำหรับการจัดเรียงลำดับหลายลำดับแต่ละเครื่องมือมีจุดแข็งและจุดอ่อนของตัวเอง และอาจมีความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านสำหรับลำดับประเภทต่างๆ (DNA, RNA หรือโปรตีน) ดังนั้น โปรแกรมจัดเรียงลำดับที่คำนึงถึงการเชื่อมต่อของยีนอาจเหมาะสำหรับการจัดเรียงลำดับ RNA ในขณะที่โปรแกรมจัดเรียงลำดับที่พิจารณาโครงสร้างโปรตีนหรืออัตราการแทนที่ของกรดอะมิโนอาจเหมาะสมกว่าสำหรับข้อมูลลำดับ RNA ที่ผ่านการแปลแล้ว

การใช้ RNA ในการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการมีทั้งจุดแข็งและจุดอ่อนเฉพาะตัว

• ชุดตัวอักษรขนาดใหญ่
• คุ้มค่า
• ไม่ขึ้นอยู่กับจีโนมอ้างอิง

• ค่าใช้จ่ายในการสุ่มตัวอย่างอนุกรมวิธานอย่างครอบคลุม
• ความยากลำบากในการระบุทรานสคริปต์แบบเต็มความยาว สำเนาเดียว และออร์โธล็อก
• อาจเกิดการเรียงลำดับข้อมูลในเอกสารผิดพลาด (โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมีข้อมูลซ้ำกัน)
• ข้อมูลที่หายไปเป็นผลผลิตจากทรานสคริปโตมซึ่งแสดงถึงภาพรวมของการแสดงออกหรือการคัดแยกสายพันธุ์ที่ไม่สมบูรณ์^{[ 14 ]}