เครื่องหมายดีเอ็นเอที่เกี่ยวข้องกับตำแหน่งตัดจำกัด (RAD) เป็น เครื่องหมายทางพันธุกรรมชนิดหนึ่งที่มีประโยชน์สำหรับการทำแผนที่ความสัมพันธ์ การทำแผนที่QTL พันธุ ศาสตร์ประชากร พันธุศาสตร์เชิงนิเวศและพันธุศาสตร์วิวัฒนาการ การใช้เครื่องหมาย RAD สำหรับการทำแผนที่ทางพันธุกรรมมักเรียกว่าการทำแผนที่ RAD แง่มุมที่สำคัญของเครื่องหมาย RAD และการทำแผนที่คือกระบวนการแยกแท็ก RAD ซึ่งเป็นลำดับดีเอ็นเอที่อยู่ติดกับตำแหน่งตัดจำกัดเฉพาะของเอนไซม์ตัดจำกัดตลอดทั้งจีโนม^{[ 1 ]}เมื่อแยกแท็ก RAD ได้แล้ว สามารถนำมาใช้ระบุและกำหนดจีโนไทป์ของลำดับดีเอ็นเอที่มีความหลากหลาย โดยส่วนใหญ่จะอยู่ในรูปของ โพลีมอร์ฟิซึมของ นิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNP) [ ^{1 ] โพ}ลีมอร์ฟิซึมที่ถูกระบุและกำหนดจีโนไทป์โดยการแยกและวิเคราะห์แท็ก RAD เรียกว่าเครื่องหมาย RAD แม้ว่าการกำหนดจีโนไทป์โดยการจัดลำดับจะนำเสนอแนวทางที่คล้ายกับวิธี RAD-seq แต่ก็มีความแตกต่างกันในประเด็นสำคัญบางประการ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

การใช้ลำดับดีเอ็นเอข้างเคียงรอบไซต์จำกัดแต่ละไซต์เป็นแง่มุมที่สำคัญของแท็ก RAD ^{[ 1 ]}ความหนาแน่นของแท็ก RAD ในจีโนมขึ้นอยู่กับเอนไซม์จำกัดที่ใช้ในระหว่างกระบวนการแยก^{[ 5 ]}มีเทคนิคเครื่องหมายไซต์จำกัดอื่นๆ เช่นRFLPหรือโพลีมอร์ฟิซึมความยาวชิ้นส่วนที่ขยาย (AFLP) ซึ่งใช้โพลีมอร์ฟิซึมความยาวชิ้นส่วนที่เกิดจากไซต์จำกัดที่แตกต่างกันเพื่อแยกแยะโพลีมอร์ฟิซึมทางพันธุกรรม การใช้ลำดับดีเอ็นเอข้างเคียงในเทคนิคแท็ก RAD เรียกว่าวิธีการแสดงแทนแบบลดทอน^{[ 2 ]}

ขั้นตอนเริ่มต้นในการแยกแท็ก RAD เกี่ยวข้องกับการย่อย DNA ด้วยเอนไซม์จำกัดเฉพาะ การเชื่อมต่อ อะแดปเตอร์ ไบโอตินิลกับส่วนที่ยื่นออกมาการตัด DNA แบบสุ่มให้เป็นชิ้นส่วนที่เล็กกว่าระยะห่างเฉลี่ยระหว่างไซต์จำกัด และการแยกชิ้นส่วนไบโอตินิลโดยใช้ลูกปัดสเตรปตาไวดีน^{[ 1 ]} ขั้นตอนนี้ถูกนำมาใช้ในขั้นต้นเพื่อแยกแท็ก RAD สำหรับการวิเคราะห์ไมโครอาร์เรย์^{[ 1 ] [ 6 ] [ 7 ]}เมื่อไม่นานมานี้ ขั้นตอนการแยกแท็ก RAD ได้รับการปรับปรุงเพื่อใช้กับการจัดลำดับความเร็วสูงบน แพลตฟอร์ม Illuminaซึ่งมีข้อดีคืออัตราข้อผิดพลาดดิบที่ลดลงอย่างมากและความเร็วสูง^{[ 5 ]} ขั้นตอนใหม่นี้เกี่ยวข้องกับการย่อย DNA ด้วยเอนไซม์จำกัดเฉพาะ (เช่น SbfI, NsiI,…) การเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ตัวแรกที่เรียกว่า P1 เข้ากับส่วนที่ยื่นออกมา การตัด DNA แบบสุ่มให้เป็นชิ้นส่วนที่มีขนาดเล็กกว่าระยะห่างเฉลี่ยระหว่างไซต์จำกัด การเตรียมปลายที่ถูกตัดให้เป็นปลายทู่และการเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ตัวที่สอง (P2) และการใช้ PCR เพื่อขยายชิ้นส่วนที่มีอะแดปเตอร์ทั้งสองตัวโดยเฉพาะ ที่สำคัญ อะแดปเตอร์ตัวแรกมีบาร์โค้ดลำดับ DNA สั้นๆ ที่เรียกว่า MID (ตัวระบุโมเลกุล) ซึ่งใช้เป็นเครื่องหมายเพื่อระบุตัวอย่าง DNA ที่แตกต่างกันซึ่งถูกรวมเข้าด้วยกันและจัดลำดับในปฏิกิริยาเดียวกัน^{[ 5 ] [ 8 ]} การใช้การจัดลำดับแบบความเร็วสูงเพื่อวิเคราะห์แท็ก RAD สามารถจัดประเภทเป็นการจัดลำดับแบบลดการแสดงผล ซึ่งรวมถึง RADSeq (RAD-Sequencing) เป็นต้น^{[ 2 ]}

เมื่อแยกแท็ก RAD ออกมาแล้ว สามารถนำมาใช้ระบุและกำหนดจีโนไทป์ของลำดับดีเอ็นเอโพลีมอร์ฟิซึม เช่น โพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNP) ^{[ 1 ] [ 5 ] ตำแหน่งโพลีมอร์ฟิกเหล่านี้เรียกว่าเครื่องหมาย RAD วิธีที่มีประสิทธิภาพที่สุดในการค้นหาแท็ก RAD คือการจัดลำดับดีเอ็นเอแบบความเร็วสูง [ 5 ] [ 8 ]ซึ่งเรียก}ว่าการจัด^{ลำดับแท็ก RAD ,}การจัดลำดับ RAD, RAD-Seq หรือ RADSeq

ก่อนการพัฒนาเทคโนโลยีการจัดลำดับแบบความเร็วสูง เครื่องหมาย RAD ถูกระบุโดยการไฮบริดแท็ก RAD กับไมโครอาร์เรย์^{[ 1 ] [ 6 ] [ 7 ]}เนื่องจากความไวต่ำของไมโครอาร์เรย์ วิธีนี้จึงสามารถตรวจจับได้เฉพาะโพลีมอร์ฟิซึมของลำดับ DNA ที่รบกวนไซต์จำกัดและนำไปสู่การไม่มีแท็ก RAD หรือโพลีมอร์ฟิซึมของลำดับ DNA ที่สำคัญซึ่งรบกวนการไฮบริดแท็ก RAD เท่านั้น ดังนั้นความหนาแน่นของเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่สามารถทำได้ด้วยไมโครอาร์เรย์จึงต่ำกว่ามากเมื่อเทียบกับสิ่งที่สามารถทำได้ด้วยการจัดลำดับ DNA แบบความเร็วสูง^{[ 9 ]}

เครื่องหมาย RAD ถูกนำมาใช้ครั้งแรกโดยใช้ไมโครอาร์เรย์และต่อมาปรับให้เข้ากับ NGS (Next-Generation-Sequencing) ^{[ 9 ]}ได้รับการพัฒนาร่วมกันโดยห้องปฏิบัติการของ Eric Johnson และ William Cresko ที่มหาวิทยาลัยโอเรกอนราวปี 2006 พวกเขายืนยันประโยชน์ของเครื่องหมาย RAD โดยการระบุจุดแตกหักของการรวมตัวใหม่ในD. melanogasterและโดยการตรวจจับ QTL ในปลาหนามสามแฉก^{[ 1 ]}

ในปี 2012 ได้มีการเสนอวิธีการติดแท็ก RAD ที่ได้รับการดัดแปลงเรียกว่า double digest RADseq (ddRADseq) ^{[ 10 ] [ 11 ]}โดยการเพิ่มเอนไซม์ตัดจำเพาะตัวที่สอง แทนที่การตัดแบบสุ่ม และขั้นตอนการเลือกขนาด DNA ที่เข้มงวด ทำให้สามารถทำการตรวจหาจีโนไทป์ของประชากรได้ในราคาประหยัด ซึ่งอาจเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพอย่างยิ่งสำหรับการสแกนจีโนมทั้งหมดเพื่อการคัดเลือกและความแตกต่างของประชากรหรือการปรับตัวของประชากร^{[ 11 ]}

การศึกษาในปี 2016 นำเสนอวิธีการใหม่ที่เรียกว่า hybridization RAD (hyRAD) ^{[ 12 ]}โดยใช้ชิ้นส่วน RAD ที่ติด ไบโอติน ซึ่งครอบคลุมส่วนสุ่มของจีโนม เป็นตัวล่อเพื่อจับชิ้นส่วนที่เหมือนกันจาก ไลบรารีการจัดลำดับจีโนม แบบช็อตกัน ชิ้นส่วน DNA จะถูกสร้างขึ้นก่อนโดยใช้โปรโตคอล ddRADseq ที่ใช้กับตัวอย่างสด และใช้เป็นโพรบจับไฮบริดไดเซชันเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของไลบรารีช็อตกันในชิ้นส่วนที่สนใจ วิธีการที่เรียบง่ายและคุ้มค่านี้ช่วยให้สามารถจัดลำดับตำแหน่งออร์โธล็อกัสได้แม้จากตัวอย่าง DNA ที่เสื่อมสภาพอย่างมาก ซึ่งเปิดช่องทางการวิจัยใหม่ในสาขามิวซีโอมิกส์ข้อดีอีกประการหนึ่งของวิธีนี้คือไม่ขึ้นอยู่กับ การมีอยู่ ของไซต์จำกัดซึ่งช่วยปรับปรุงความครอบคลุมของตำแหน่งระหว่างตัวอย่าง เทคนิคนี้ได้รับการทดสอบครั้งแรกกับตัวอย่างในพิพิธภัณฑ์และตัวอย่างสดของOedaleus decorusซึ่งเป็น ตั๊กแตนสายพันธุ์ Palearcticและต่อมาได้นำไปใช้กับนกกินน้ำหวานรีเจนท์ [ ^{13 ]}สัตว์ขาปล้อง [ ^{14 ] และ}สายพันธุ์อื่นๆ โปรโตคอลในห้องปฏิบัติการได้รับการพัฒนาเพื่อนำ hyRAD ไปใช้ใน^{นก[ 15 ]}

• การระบุจีโนไทป์โดยการลำดับดีเอ็นเอ