ในชีววิทยาโมเลกุลโพลีมอร์ฟิซึมของความยาวชิ้นส่วนจำกัด ( RFLP ) เป็นเทคนิคที่ใช้ประโยชน์จากความผันแปรในลำดับดีเอ็นเอโฮโมโลกัส หรือที่เรียกว่า โพลีมอร์ฟิซึมประชากร หรือสปีชีส์ เพื่อระบุตำแหน่งของยีนภายในลำดับ คำนี้อาจหมายถึงโพลีมอร์ฟิซึมเองที่ตรวจพบผ่านตำแหน่งที่แตกต่างกันของตำแหน่งเอนไซม์จำกัดหรืออาจหมายถึงเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้องซึ่งใช้อธิบายความแตกต่างดังกล่าว ในการวิเคราะห์ RFLPตัวอย่างดีเอ็นเอจะถูกย่อยเป็นชิ้นส่วนด้วยเอนไซม์จำกัด หนึ่งตัวหรือมากกว่า จากนั้น ชิ้นส่วนจำกัดที่ได้จะถูกแยกด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลตามขนาด

ปัจจุบันการวิเคราะห์ RFLP ล้าสมัยไปมากแล้ว เนื่องจากมี เทคโนโลยี การจัดลำดับดีเอ็นเอ ราคาไม่แพงเกิดขึ้น แต่ถือเป็น เทคนิค การทำโปรไฟล์ดีเอ็นเอ ครั้งแรก ที่มีราคาไม่แพงจนสามารถนำไปใช้อย่างแพร่หลาย การวิเคราะห์ RFLP เป็นเครื่องมือสำคัญในยุคแรกๆ ในการทำแผนที่จีโนมการระบุตำแหน่งยีนที่บ่งชี้ความผิดปกติทางพันธุกรรมการประเมินความเสี่ยงต่อการเกิดโรค และการตรวจพิสูจน์ความเป็นบิดา

เทคนิคพื้นฐานสำหรับการตรวจหา RFLPs คือการแบ่งส่วนตัวอย่างดีเอ็นเอโดยใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะซึ่งสามารถตัดโมเลกุลดีเอ็นเอแบบเลือกเฉพาะจุดได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อตรวจ พบ ลำดับเบสสั้น ๆ ในกระบวนการที่เรียกว่า เอนไซม์ตัดจำเพาะ ( restriction digest ) จากนั้นชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ได้จากกระบวนการนี้จะถูกแยกตามความยาวผ่านกระบวนการที่เรียกว่าอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสและถ่ายโอนไปยังเยื่อผ่านกระบวนการเซาเทิร์นบล็อ ต การผสมข้ามพันธุ์ของเยื่อกับโพรบดีเอ็นเอ ที่ติดฉลาก แล้วจะเป็นการกำหนดความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เป็นส่วนเสริมของโพรบ กล่าวกันว่าโพลีมอร์ฟิซึมของความยาวชิ้นส่วนตัดจำเพาะเกิดขึ้นเมื่อความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ตรวจพบแตกต่างกันในแต่ละบุคคล ซึ่งบ่งชี้ถึงความคล้ายคลึงกันของลำดับเบสที่ไม่เหมือนกัน ความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอแต่ละชิ้นถือเป็นอัลลีลไม่ว่าจะมีบริเวณรหัสพันธุกรรมหรือไม่ และสามารถนำมาใช้ในการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมในภายหลังได้

มีกลไกทั่วไปสองประการที่ทำให้ขนาดของชิ้นส่วนจำกัดเฉพาะชิ้นหนึ่งสามารถเปลี่ยนแปลงได้ ในแผนผังแรกจีโนม ส่วนเล็กๆ จะถูกตรวจจับโดยโพรบดีเอ็นเอ (เส้นหนากว่า) ในอัลลีลAจีโนมจะถูกตัดออกโดยเอนไซม์จำกัดที่ตำแหน่งใกล้เคียงสามตำแหน่ง (รูปสามเหลี่ยม) แต่โพรบจะตรวจพบเฉพาะชิ้นส่วนขวาสุดเท่านั้น ในอัลลีลaตำแหน่งจำกัด 2 หายไปจากการกลายพันธุ์ดังนั้นโพรบจึงตรวจพบชิ้นส่วนที่เชื่อมติดกันขนาดใหญ่กว่าซึ่งวิ่งจากตำแหน่ง 1 ถึง 3 แผนภาพที่สองแสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงขนาดของชิ้นส่วนนี้จะมีลักษณะอย่างไรเมื่อทำ Southern blot และอัลลีลแต่ละตัว (สองตัวต่อตัว) อาจได้รับการถ่ายทอดทางพันธุกรรมในสมาชิกในครอบครัวอย่างไร

ในแผนผังที่สาม โพรบและเอนไซม์ตัดจำเพาะจะถูกเลือกเพื่อตรวจจับบริเวณหนึ่งของจีโนมที่มี เซกเมนต์ VNTR ( variable number tandem repeat ) (กรอบในแผนผัง) ในอัลลีลcมี 5 ซ้ำใน VNTR และโพรบจะตรวจจับส่วนที่ยาวกว่าระหว่างตำแหน่งตัดจำเพาะทั้งสอง ในอัลลีลdมี 2 ซ้ำใน VNTR ดังนั้นโพรบจะตรวจจับส่วนที่สั้นกว่าระหว่างตำแหน่งตัดจำเพาะทั้งสองเดียวกัน กระบวนการทางพันธุกรรมอื่นๆ เช่นการแทรกการลบการเคลื่อนย้ายและการกลับด้านก็สามารถนำไปสู่ภาวะพหุสัณฐานได้เช่นกัน การทดสอบ RFLP ต้องใช้ตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวนมากกว่าการทดสอบ STR ( short tandem repeat ) มาก

การวิเคราะห์ความแปรผันของ RFLP ในจีโนมเคยเป็นเครื่องมือสำคัญในการทำแผนที่จีโนมและการวิเคราะห์โรคทางพันธุกรรม หากนักวิจัยพยายามระบุตำแหน่งโครโมโซมของยีนโรคใดโรคหนึ่งในตอนแรก พวกเขาจะวิเคราะห์ดีเอ็นเอของสมาชิกในครอบครัวที่เป็นโรคนั้น และมองหาอัลลีล RFLP ที่แสดงรูปแบบการถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่คล้ายคลึงกันกับโรค (ดูความเชื่อมโยงทางพันธุกรรม ) เมื่อระบุตำแหน่งยีนของโรคได้แล้ว การวิเคราะห์ RFLP ของครอบครัวอื่นๆ จะสามารถระบุได้ว่าใครมีความเสี่ยงต่อโรค หรือใครมีแนวโน้มที่จะเป็นพาหะของยีนกลายพันธุ์ การทดสอบ RFLP ใช้ในการระบุและแยกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิตโดยการวิเคราะห์รูปแบบเฉพาะในจีโนม นอกจากนี้ยังใช้ในการระบุอัตราการรวมตัวใหม่ในตำแหน่งระหว่างจุดจำกัดยีนด้วย

การวิเคราะห์ RFLP ยังเป็นพื้นฐานสำหรับวิธีการในยุคแรกๆ ของการพิมพ์ลายนิ้วมือทางพันธุกรรมซึ่งมีประโยชน์ในการระบุตัวอย่างที่เก็บได้จาก ที่เกิด เหตุในการกำหนดความเป็นพ่อและในการจำแนกลักษณะความหลากหลายทางพันธุกรรมหรือรูปแบบการผสมพันธุ์ในประชากรสัตว์

อย่างไรก็ตาม เทคนิคการวิเคราะห์ RFLP นั้นค่อนข้างช้าและยุ่งยาก ต้องใช้ตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวนมาก และกระบวนการผสมผสานระหว่างการติดฉลากโพรบ การแยกส่วนดีเอ็นเอ อิเล็กโทรโฟรีซิส การบล็อต การผสมพันธุ์ การล้าง และออโตเรดิโอกราฟี อาจใช้เวลานานถึงหนึ่งเดือนจึงจะเสร็จสมบูรณ์ ในปี พ.ศ. 2528 มีรายงานวิธี RFLP เวอร์ชันจำกัดที่ใช้โพรบโอลิโกนิวคลีโอ ไทด์ ผลของโครงการจีโนมมนุษย์ได้เข้ามาแทนที่ความจำเป็นในการทำแผนที่ RFLP อย่างมาก และการระบุโพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNP) จำนวนมากในโครงการนั้น (รวมถึงการระบุยีนและการกลายพันธุ์ของโรคโดยตรง) ได้เข้ามาแทนที่ความจำเป็นในการวิเคราะห์การเชื่อมโยงโรคด้วย RFLP (ดูจีโนไทป์ SNP ) การวิเคราะห์อัลลีล VNTR ยังคงดำเนินต่อไป แต่ปัจจุบันมักดำเนินการโดยใช้ วิธี ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ตัวอย่างเช่นโปรโตคอล มาตรฐาน สำหรับการพิมพ์ลายนิ้วมือดีเอ็นเอเกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ PCR ของแผงเซลล์ที่มี VNTR มากกว่าหนึ่งโหล

RFLP ยังคงใช้ในการคัดเลือกโดยใช้มาร์กเกอร์ช่วย โพลีมอร์ฟิซึมของส่วนปลายที่จำกัดความยาว (TRFLP หรือบางครั้งเรียกว่า T-RFLP) เป็นเทคนิคที่พัฒนาขึ้นในขั้นต้นเพื่อจำแนกลักษณะของชุมชนแบคทีเรียในตัวอย่างที่มีหลายสายพันธุ์ เทคนิคนี้ยังถูกนำไปใช้กับกลุ่มอื่นๆ รวมถึงเชื้อราในดินด้วย TRFLP ทำงานโดยการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วย PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่หนึ่งที่ติดฉลากด้วยแท็กเรืองแสง จากนั้นผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกย่อยโดยใช้เอนไซม์ RFLP และแสดงรูปแบบที่ได้โดยใช้เครื่องเรียงลำดับดีเอ็นเอ ผลลัพธ์จะถูกวิเคราะห์โดยการนับและเปรียบเทียบแถบหรือจุดสูงสุดในโปรไฟล์ TRFLP หรือโดยการจับคู่แถบจาก TRFLP หนึ่งรายการหรือมากกว่านั้นกับฐานข้อมูลของสายพันธุ์ที่รู้จัก มีการพัฒนาเครื่องมือซอฟต์แวร์ที่แตกต่างกันจำนวนมากเพื่อทำให้กระบวนการจับคู่แถบ การเปรียบเทียบ และการสร้างฐานข้อมูลโปรไฟล์ TRFLP เป็นแบบอัตโนมัติ

เทคนิคนี้มีความคล้ายคลึงกันในบางแง่มุมกับการ วิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบ ไล่ระดับอุณหภูมิหรือแบบเปลี่ยนสภาพ (TGGE และ DGGE)

การเปลี่ยนแปลงลำดับที่เกี่ยวข้องโดยตรงกับ RFLP สามารถวิเคราะห์ได้รวดเร็วยิ่งขึ้นด้วย PCR การเพิ่มจำนวนสามารถทำได้โดยตรงผ่านบริเวณตัดจำเพาะที่เปลี่ยนแปลง และผลิตภัณฑ์จะถูกย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ วิธีการนี้เรียกว่าCleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) อีกทางเลือกหนึ่งคือ ส่วนที่ขยายแล้วสามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้ โพรบโอลิโกนิว คลีโอไทด์จำเพาะอัลลีล (ASO) ซึ่งเป็นกระบวนการที่มักทำโดยวิธีdot blot แบบ ง่ายๆ

• โพลีมอร์ฟิซึมความยาวชิ้นส่วนที่ขยาย (AFLP)
• กรมควบคุมโรค (RAPD)
• การวิเคราะห์ STR

• nih.gov