การต่อเชื่อมแบบทางเลือก (Alternative splicing ) การต่อเชื่อม RNA แบบทางเลือก (Alternative RNA splicing ) หรือการต่อเชื่อมแบบแตกต่าง (Differential splicing)เป็น กระบวนการ ต่อเชื่อม แบบทางเลือก ในระหว่างการแสดงออกของยีน ซึ่งทำให้ยีนเดียวสามารถสร้างรูปแบบการต่อเชื่อมที่แตกต่างกันได้ ตัวอย่างเช่น เอ็กซอนบางส่วนของยีนอาจถูกรวมไว้ภายในหรือถูกแยกออกจาก ผลิตภัณฑ์ RNA สุดท้าย ของยีน^{[ 1 ]}ซึ่งหมายความว่าเอ็กซอนจะถูกรวมเข้าด้วยกันในรูปแบบต่างๆ ทำให้เกิดรูปแบบการต่อเชื่อมที่แตกต่างกัน ในกรณีของยีนที่เข้ารหัสโปรตีน โปรตีนที่ถูกแปลจากรูปแบบการต่อเชื่อมเหล่านี้อาจมีความแตกต่างกันใน ลำดับ กรดอะมิโนและในหน้าที่ทางชีวภาพ (ดูรูป)

การสไปลซิงทางเลือกที่มีความสำคัญทางชีววิทยาเกิดขึ้นเป็นปรากฏการณ์ปกติในยูคาริโอตซึ่งจะเพิ่มจำนวนโปรตีนที่สามารถเข้ารหัสโดยจีโนมได้^{[ 1 ]}ในมนุษย์ เป็นที่เชื่อกันอย่างกว้างขวางว่ายีนที่มีหลายเอ็กซอนประมาณ 95% จะถูกสไปลซิงทางเลือกเพื่อสร้างผลิตภัณฑ์ทางเลือกที่มีฟังก์ชันการทำงานจากยีนเดียวกัน^{[ 2 ]}แต่นักวิทยาศาสตร์หลายคนเชื่อว่าตัวแปรการสไปลซิงที่สังเกตได้ส่วนใหญ่เกิดจากข้อผิดพลาดในการสไปลซิง และจำนวนยีนที่ถูกสไปลซิงทางเลือกที่มีความสำคัญทางชีววิทยาที่แท้จริงนั้นต่ำกว่ามาก^{[ 3 ] [ 4 ]}

การตัดต่อทางเลือก (Alternative splicing) ถูกสังเกตครั้งแรกในปี พ.ศ. 2520 ^{[ 5 ] [ 6 ]}อะดีโนไวรัสสร้างทรานสคริปต์หลัก 5 รายการ ในช่วงต้นของวงจรการติดเชื้อ ก่อนการจำลองดีเอ็นเอ ของไวรัส และอีกหนึ่งรายการในภายหลัง หลังจากที่การจำลองดีเอ็นเอเริ่มต้นขึ้น ทรานสคริปต์หลักในช่วงต้นยังคงถูกผลิตต่อไปหลังจากที่การจำลองดีเอ็นเอเริ่มต้นขึ้น ทรานสคริปต์หลักเพิ่มเติมที่ผลิตในช่วงปลายของการติดเชื้อมีขนาดใหญ่และมาจาก 5/6 ของจีโนมอะดีโนไวรัสขนาด 32 กิโลเบส ซึ่งมีขนาดใหญ่กว่า mRNA ของอะดีโนไวรัสแต่ละตัวที่มีอยู่ในเซลล์ที่ติดเชื้อมาก นักวิจัยพบว่าทรานสคริปต์ RNA หลักที่ผลิตโดยอะดีโนไวรัสชนิดที่ 2 ในช่วงปลายมีการตัดต่อในหลายวิธีที่แตกต่างกัน ส่งผลให้ mRNA เข้ารหัสโปรตีนไวรัสที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ ทรานสคริปต์หลักยังมี ไซต์ โพลีอะดีนิเลชัน หลาย ไซต์ ทำให้ mRNA ที่ผ่านกระบวนการมีปลาย 3' ที่แตกต่างกัน^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]}

ในปี พ.ศ. 2524 ตัวอย่างแรกของการสไปลซิงทางเลือกในทรานสคริปต์จากยีนปกติภายในร่างกายได้รับการระบุลักษณะ^{[ 7 ]}พบว่ายีนที่เข้ารหัสฮอร์โมนไทรอยด์แคลซิโทนิน มีการสไปลซิงทางเลือกในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ทรานสคริปต์หลักจากยีนนี้ประกอบด้วยเอ็กซอน 6 เอ็กซอน mRNA ของ แคลซิโทนินประกอบด้วยเอ็กซอน 1–4 และสิ้นสุดหลังจากไซต์โพลีอะดีนิเลชันในเอ็กซอน 4 mRNA อีกตัวหนึ่งถูกสร้างขึ้นจาก pre-mRNA นี้โดยการข้ามเอ็กซอน 4 และรวมถึงเอ็กซอน 1–3, 5 และ 6 มันเข้ารหัสโปรตีนที่รู้จักกันในชื่อ CGRP ( calcitonin gene related peptide ) ^{[ 10 ] [ 11 ]}ตัวอย่างของการสไปลซิงทางเลือกในทรานสคริปต์ยีนอิมมูโนโกลบินในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมก็ได้รับการสังเกตในช่วงต้นทศวรรษ พ.ศ. 2523 เช่นกัน^{[ 7 ] [ 12 ]}

ตั้งแต่นั้นมา มีการค้นพบตัวอย่างการตัดต่อทางเลือกที่เกี่ยวข้องทางชีววิทยาอื่นๆ อีกมากมายในยูคาริโอต^{[ 1 ]} ยีน DscamในD. melanogasterเป็น "ผู้ครองสถิติ" สำหรับการตัดต่อทางเลือกซึ่งอาจมีรูปแบบการตัดต่อได้ถึง 38,016 รูปแบบ^{[ 13 ]}

ในปี 2021 มีการค้นพบว่าจีโนมของอะดีโนไวรัสชนิดที่ 2 ซึ่งเป็นอะดีโนไวรัสชนิดแรกที่พบการตัดต่อทางเลือก สามารถสร้างตัวแปรการตัดต่อที่หลากหลายกว่าที่เคยคิดไว้^{[ 14 ]}ด้วยการใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นต่อไป นักวิจัยสามารถอัปเดตทรานสคริปโตมของอะดีโนไวรัสชนิดที่ 2 ในมนุษย์ และบันทึกการมีอยู่ของตัวแปรการตัดต่อ 904 ตัวที่ไวรัสสร้างขึ้นผ่านรูปแบบการตัดต่อทางเลือกที่ซับซ้อน มีตัวแปรการตัดต่อเพียงไม่กี่ตัวเท่านั้นที่แสดงให้เห็นว่าทำงานได้ ซึ่งเป็นประเด็นที่ผู้เขียนยกขึ้นมาในบทความของพวกเขา

"คำถามสำคัญคือ RNA สายพันธุ์ใหม่เหล่านี้มีบทบาทอย่างไร หรือว่าพวกมันเป็นโมเลกุลปลอมที่เกิดจากกลไกการตัดต่อที่ทำงานหนักเกินไป" ^{[ 14 ]}

โดยทั่วไปแล้วมีการยอมรับโหมดการตัดต่อทางเลือกพื้นฐาน 5 โหมด^{[ 1 ] [ 2 ] [ 16 ] [ 15 ]}

• การข้ามเอ็กซอนหรือเอ็กซอนแบบคาสเซ็ต : ในกรณีนี้เอ็กซอนอาจถูกตัดออกจากทรานสคริปต์ หลักหรือคงไว้ นี่เป็นโหมดที่พบได้บ่อยที่สุดใน พรีเอ็มอาร์เอ็นเอของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม^{[ 15 ]}
• เอ็กซอนที่แยกจากกันโดยสิ้นเชิง : เอ็กซอนหนึ่งในสองเอ็กซอนจะยังคงอยู่ใน mRNA หลังจากการเชื่อมต่อ แต่ไม่ใช่ทั้งสองเอ็กซอน
• ตำแหน่งผู้ให้ทางเลือก : มีการใช้จุดเชื่อมต่อ 5' ทางเลือก (ตำแหน่งผู้ให้) ซึ่งจะเปลี่ยนขอบเขต 3' ของเอ็กซอนต้นน้ำ
• ตำแหน่งตัวรับทางเลือก : มีการใช้จุดเชื่อมต่อ 3' ทางเลือก (ตำแหน่งตัวรับ) ซึ่งจะเปลี่ยนขอบเขต 5' ของเอ็กซอนที่อยู่ถัดไป
• การคงอินทรอน : ลำดับอาจถูกตัดออกเป็นอินทรอนหรือคงไว้เฉยๆ ซึ่งแตกต่างจากการข้ามเอ็กซอนเพราะลำดับที่คงไว้ไม่ได้ถูกล้อมรอบด้วยอินทรอนหากอินทรอนที่คงไว้อยู่ในบริเวณการเข้ารหัส อินทรอนจะต้องเข้ารหัสกรดอะมิโนในเฟรมเดียวกับเอ็กซอนข้างเคียง มิฉะนั้นรหัสหยุดหรือการเปลี่ยนแปลงในเฟรมการอ่านจะทำให้โปรตีนไม่ทำงาน นี่เป็นโหมดที่พบได้ยากที่สุดในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม แต่พบได้บ่อยที่สุดในพืช^{[ 15 ] [ 17 ]}

นอกเหนือจากโหมดหลักของการสไปลซิงทางเลือกเหล่านี้แล้ว ยังมีกลไกหลักอีกสองอย่างที่สามารถสร้าง mRNA ที่แตกต่างกันจากยีนเดียวกันได้ ได้แก่โปรโมเตอร์ หลายตัว และ ไซต์ โพลีอะดีนิเลชัน หลาย ไซต์ การใช้โปรโมเตอร์หลายตัวนั้นอธิบายได้อย่างถูกต้องว่าเป็น กลไก การควบคุมการถอดรหัสมากกว่าการสไปลซิงทางเลือก โดยการเริ่มต้นการถอดรหัสที่จุดต่างกัน สามารถสร้างทรานสคริปต์ที่มีเอ็กซอน 5'-สุดที่แตกต่างกันได้ ในทางกลับกัน ไซต์โพลีอะดีนิเลชันหลายไซต์จะให้จุดปลาย 3' ที่แตกต่างกันสำหรับทรานสคริปต์ กลไกทั้งสองนี้พบร่วมกับการสไปลซิงทางเลือกและให้ความหลากหลายเพิ่มเติมใน mRNA ที่ได้มาจากยีน^{[ 1 ] [ 16 ]}

โหมดเหล่านี้อธิบายกลไกการต่อเชื่อมพื้นฐาน แต่อาจไม่เพียงพอที่จะอธิบายเหตุการณ์การต่อเชื่อมที่ซับซ้อน ตัวอย่างเช่น รูปทางด้านขวาแสดงรูปแบบการต่อเชื่อมสามแบบจาก ยีน ไฮยาลูโรนิเดส 3 ของหนู การเปรียบเทียบโครงสร้างเอ็กซอนที่แสดงในบรรทัดแรก (สีเขียว) กับโครงสร้างในบรรทัดที่สอง (สีเหลือง) แสดงให้เห็นการคงอยู่ของอินทรอน ในขณะที่การเปรียบเทียบระหว่างรูปแบบการต่อเชื่อมที่สองและที่สาม (สีเหลืองเทียบกับสีน้ำเงิน) แสดงให้เห็นการข้ามเอ็กซอน มีการเสนอระบบการตั้งชื่อแบบจำลองเพื่อกำหนดรูปแบบการต่อเชื่อมที่เป็นไปได้ทั้งหมดอย่างเฉพาะเจาะจงเมื่อเร็ว ๆ นี้^{[ 15 ]}

เมื่อพรีเอ็มอาร์เอ็นเอถูกถอดรหัสจากดีเอ็นเอแล้ว มันจะประกอบด้วยอินทรอนและเอ็กซอน หลายส่วน (ในหนอนตัวกลมโดยเฉลี่ยจะมีเอ็กซอนและอินทรอน 4-5 ส่วน ในแมลงหวี่ดรอโซฟิลาอาจมีอินทรอนและเอ็กซอนมากกว่า 100 ส่วนในพรีเอ็มอาร์เอ็นเอที่ถอดรหัสได้หนึ่งโมเลกุล) เอ็กซอนที่จะถูกเก็บไว้ในเอ็มอาร์เอ็นเอจะถูกกำหนดในระหว่างกระบวนการสไปลซิง การควบคุมและการเลือกตำแหน่งสไปลซิงจะทำโดยโปรตีนตัวกระตุ้นสไปลซิงและโปรตีนตัวยับยั้งสไปลซิงที่ออกฤทธิ์แบบทรานส์ รวมถึงองค์ประกอบที่ออกฤทธิ์แบบซิสภายในพรีเอ็มอาร์เอ็นเอเอง เช่น ตัวเสริมสไปลซิงเอ็กซอนและตัวยับยั้งสไปลซิงเอ็กซอน

อินทรอนนิวเคลียร์ของยูคาริโอตทั่วไปมีลำดับคอนเซนซัสที่กำหนดบริเวณสำคัญ อินทรอนแต่ละตัวมีลำดับ GU ที่ปลาย 5' ใกล้กับปลาย 3' มีไซต์สาขา นิวคลีโอไทด์ที่จุดสาขาจะเป็น A เสมอ คอนเซนซัสรอบลำดับนี้จะแตกต่างกันไปบ้าง ในมนุษย์ ลำดับคอนเซนซัสของไซต์สาขาคือ yUnAy ^{[ 18 ]}ไซต์สาขาจะตามด้วยไพริมิดีน หลายตัว – แทร็กโพลีไพริมิดีน – จากนั้นตามด้วย AG ที่ปลาย 3' ^{[ 16 ]}

การตัดต่อ mRNA ดำเนินการโดยคอมเพล็กซ์ RNA และโปรตีนที่เรียกว่าสไปโซโซมซึ่งประกอบด้วยsnRNPที่กำหนดเป็น U1, U2, U4, U5 และ U6 (U3 ไม่เกี่ยวข้องกับการตัดต่อ mRNA) ^{[ 19 ]} U1 จับกับ 5' GU และ U2 โดยความช่วยเหลือของ ปัจจัยโปรตีน U2AFจับกับจุดแยก A ภายในไซต์แยก คอมเพล็กซ์ในขั้นตอนนี้เรียกว่าคอมเพล็กซ์สไปโซโซม A การก่อตัวของคอมเพล็กซ์ A มักเป็นขั้นตอนสำคัญในการกำหนดปลายของอินทรอนที่จะถูกตัดออก และกำหนดปลายของเอ็กซอนที่จะคงไว้^{[ 16 ]} (การตั้งชื่อ U มาจาก ปริมาณ ยูริดีน ที่สูง )

คอมเพล็กซ์ U4, U5, U6 จับกัน และ U6 เข้ามาแทนที่ตำแหน่ง U1 U1 และ U4 หลุดออกไป คอมเพล็กซ์ที่เหลือจะทำ ปฏิกิริยา การถ่ายโอนเอสเทอร์ สองครั้ง ในการถ่ายโอนเอสเทอร์ครั้งแรก ปลาย 5' ของอินทรอนจะถูกตัดออกจากเอ็กซอนต้นน้ำและเชื่อมต่อกับไซต์สาขา A ด้วย พันธะ ฟอสโฟไดเอส เทอร์ 2',5 ' ในการถ่ายโอนเอสเทอร์ครั้งที่สอง ปลาย 3' ของอินทรอนจะถูกตัดออกจากเอ็กซอนปลายน้ำ และเอ็กซอนทั้งสองจะเชื่อมต่อกันด้วยพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ จากนั้นอินทรอนจะถูกปล่อยออกมาในรูปแบบห่วงและถูกย่อยสลาย^{[ 1 ]}

การต่อเชื่อมยีนถูกควบคุมโดย โปรตีน ที่ออกฤทธิ์แบบทรานส์ (ตัวยับยั้งและตัวกระตุ้น) และไซต์ควบคุมที่ออกฤทธิ์แบบซิสที่ สอดคล้องกัน (ตัวปิดกั้นและตัวเสริม) บนพรี-mRNA อย่างไรก็ตาม ในส่วนของความซับซ้อนของการต่อเชื่อมยีนแบบทางเลือกนั้น พบว่าผลของ ปัจจัยการต่อเชื่อมยีนมักขึ้นอยู่กับตำแหน่ง กล่าวคือ ปัจจัยการต่อเชื่อมยีนที่ทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นการต่อเชื่อมยีนเมื่อจับกับองค์ประกอบเสริมในอินทรอนิกส์ อาจทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งเมื่อจับกับองค์ประกอบการต่อเชื่อมยีนในบริบทของเอ็กซอน และในทางกลับกัน^{[ 20 ]}โครงสร้างทุติยภูมิของทรานสคริปต์พรี-mRNA ยังมีบทบาทในการควบคุมการต่อเชื่อมยีน เช่น โดยการนำองค์ประกอบการต่อเชื่อมยีนมารวมกัน หรือโดยการปิดบังลำดับที่อาจทำหน้าที่เป็นองค์ประกอบการจับสำหรับปัจจัยการต่อเชื่อมยีน^{[ 21 ] [ 22 ]}องค์ประกอบเหล่านี้รวมกันเป็น "รหัสการต่อเชื่อมยีน" ที่ควบคุมว่าการต่อเชื่อมยีนจะเกิดขึ้นอย่างไรภายใต้สภาวะของเซลล์ที่แตกต่างกัน^{[ 23 ] [ 24 ]}

มีองค์ประกอบลำดับ RNA ที่ออกฤทธิ์แบบซิสสองประเภทหลักอยู่ในพรี-mRNA และมีโปรตีนที่จับกับ RNA ที่ออกฤทธิ์แบบทรานส์ที่สอดคล้องกัน ตัวยับยั้งการต่อ เชื่อม (Splicing silencers)คือตำแหน่งที่โปรตีนยับยั้งการต่อเชื่อมจะจับ ทำให้ลดโอกาสที่ตำแหน่งใกล้เคียงจะถูกใช้เป็นจุดเชื่อมต่อการต่อเชื่อม (Splice junction) ตำแหน่งเหล่านี้อาจอยู่ในอินทรอนเอง (ตัวยับยั้งการต่อเชื่อมในอินทรอน, ISS) หรือในเอ็กซอนที่อยู่ใกล้เคียง ( ตัวยับยั้งการต่อเชื่อมในเอ็กซอน , ESS) พวกมันมีความแตกต่างกันในลำดับ รวมถึงชนิดของโปรตีนที่จับกับพวกมันด้วย โปรตีนยับยั้งการต่อเชื่อมส่วนใหญ่เป็นไรโบนิวคลีโอโปรตีนนิวเคลียร์ที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน (hnRNPs) เช่น hnRNPA1 และโปรตีนที่จับกับพอลิไพริมิดีนแทร็ก (PTB) ^{[ 16 ] [ 23 ]} ตัวเร่งการต่อเชื่อม (Splicing enhancers)คือตำแหน่งที่โปรตีนกระตุ้นการต่อเชื่อมจะจับ ทำให้เพิ่มโอกาสที่ตำแหน่งใกล้เคียงจะถูกใช้เป็นจุดเชื่อมต่อการต่อเชื่อม สิ่งเหล่านี้อาจเกิดขึ้นในอินตรอน (ตัวเร่งการต่อเชื่อมอินตรอน, ISE) หรือเอ็กซอน ( ตัวเร่งการต่อเชื่อมเอ็กซอน , ESE) โปรตีนตัวกระตุ้นส่วนใหญ่ที่จับกับ ISE และ ESE เป็นสมาชิกของตระกูลโปรตีน SRโปรตีนดังกล่าวมีโมทีฟการจดจำ RNA และ โดเมนที่อุดมไปด้วย อาร์จินีนและซีรีน (RS) ^{[ 16 ] [ 23 ]}

โดยทั่วไป ปัจจัยกำหนดการต่อเชื่อมจะทำงานในลักษณะที่พึ่งพาซึ่งกันและกันโดยขึ้นอยู่กับบริบท ดังนั้นกฎที่ควบคุมวิธีการควบคุมการต่อเชื่อมจึงก่อให้เกิดรหัสการต่อเชื่อม^{[ 24 ]}การมีอยู่ขององค์ประกอบลำดับ RNA ที่ออกฤทธิ์แบบซิสโดยเฉพาะอาจเพิ่มความน่าจะเป็นที่ไซต์ใกล้เคียงจะถูกต่อเชื่อมในบางกรณี แต่ลดความน่าจะเป็นในกรณีอื่นๆ ขึ้นอยู่กับบริบท บริบทที่องค์ประกอบควบคุมทำงานนั้นรวมถึงบริบทที่ออกฤทธิ์แบบซิสซึ่งถูกสร้างขึ้นโดยการมีอยู่ของคุณลักษณะลำดับ RNA อื่นๆ และบริบทที่ออกฤทธิ์แบบทรานส์ซึ่งถูกสร้างขึ้นโดยสภาวะของเซลล์ ตัวอย่างเช่น องค์ประกอบลำดับ RNA ที่ออกฤทธิ์แบบซิสบางอย่างมีอิทธิพลต่อการต่อเชื่อมก็ต่อเมื่อมีองค์ประกอบหลายตัวอยู่ในบริเวณเดียวกันเพื่อสร้างบริบท อีกตัวอย่างหนึ่ง องค์ประกอบที่ออกฤทธิ์แบบซิสสามารถมีผลตรงกันข้ามต่อการต่อเชื่อมได้ ขึ้นอยู่กับโปรตีนที่แสดงออกในเซลล์ (เช่น PTB ของเซลล์ประสาทเทียบกับ PTB ที่ไม่ใช่เซลล์ประสาท) ความสำคัญเชิงปรับตัวของตัวยับยั้งและตัวเร่งการตัดต่อได้รับการยืนยันโดยการศึกษาที่แสดงให้เห็นว่ามีการคัดเลือกอย่างเข้มข้นในยีนของมนุษย์เพื่อต่อต้านการกลายพันธุ์ที่สร้างตัวยับยั้งใหม่หรือขัดขวางตัวเร่งที่มีอยู่^{[ 25 ] [ 26 ]}

พรีเอ็มอาร์เอ็นเอจากยีนdsx ของ Drosophila melanogasterประกอบด้วยเอ็กซอน 6 ตัว ในตัวผู้ เอ็กซอน 1, 2, 3, 5 และ 6 จะรวมกันเพื่อสร้างเอ็มอาร์เอ็นเอ ซึ่งเข้ารหัสโปรตีนควบคุมการถอดรหัสที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาของตัวผู้ ในตัวเมีย เอ็กซอน 1, 2, 3 และ 4 จะรวมกัน และ สัญญาณ โพลีอะดีนิเลชันในเอ็กซอน 4 ทำให้เกิดการตัดเอ็มอาร์เอ็นเอ ณ จุดนั้น เอ็มอาร์เอ็นเอที่ได้จะเป็นโปรตีนควบคุมการถอดรหัสที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาของตัวเมีย^{[ 27 ]}

นี่เป็นตัวอย่างของการข้ามเอ็กซอน อินทรอนที่อยู่เหนือเอ็กซอน 4 มีลำดับโพลีไพริมิดีนที่ไม่ตรงกับลำดับคอนเซนซัสได้ดี ทำให้โปรตีน U2AF จับกับลำดับนี้ได้ไม่ดีหากไม่มีตัวกระตุ้นการตัดต่อช่วย ดังนั้นไซต์ตัวรับการตัดต่อ 3' นี้จึงไม่ถูกใช้ในเพศชาย อย่างไรก็ตาม เพศหญิงจะสร้างตัวกระตุ้นการตัดต่อ Transformer (Tra) (ดูด้านล่าง) โปรตีน SR Tra2 ถูกผลิตขึ้นในทั้งสองเพศและจับกับ ESE ในเอ็กซอน 4 หากมี Tra อยู่ Tra จะจับกับ Tra2 และร่วมกับโปรตีน SR อีกตัวหนึ่งสร้างคอมเพล็กซ์ที่ช่วยให้โปรตีน U2AF จับกับลำดับโพลีไพริมิดีนที่อ่อนแอ U2 จะถูกดึงดูดไปยังจุดแยกสาขาที่เกี่ยวข้อง และนำไปสู่การรวมเอ็กซอน 4 ใน mRNA ^{[ 27 ] [ 28 ]}

พรีเอ็มอาร์เอ็นเอของ ยีน ทรานส์ฟอร์เมอร์ (Tra) ในแมลง หวี่ Drosophila melanogasterเกิดการสไปลซิงแบบทางเลือกผ่านโหมดตัวรับทางเลือก ยีน Tra เข้ารหัสโปรตีนที่แสดงออกเฉพาะในเพศเมียเท่านั้น ทรานสคริปต์หลักของยีนนี้มีอินทรอนที่มีตัวรับสองตำแหน่งที่เป็นไปได้ ในเพศผู้จะใช้ตัวรับตำแหน่งต้นน้ำ ซึ่งทำให้มีการรวมเอ็กซอน 2 เวอร์ชันที่ยาวกว่าไว้ในทรานสคริปต์ที่ผ่านกระบวนการ รวมถึงรหัสหยุด ก่อน กำหนด ผลลัพธ์ที่ได้คือเอ็มอาร์เอ็นเอที่เข้ารหัสโปรตีนที่สั้นลงและไม่ทำงาน เพศเมียสร้างโปรตีนกำหนดเพศหลักSex lethal (Sxl) โปรตีน Sxl เป็นตัวยับยั้งการสไปลซิงที่จับกับ ISS ในอาร์เอ็นเอของทรานสคริปต์ Tra ใกล้กับตัวรับตำแหน่งต้นน้ำ ป้องกันไม่ให้ โปรตีน U2AFจับกับส่วนโพลีไพริมิดีน ซึ่งจะป้องกันการใช้จุดเชื่อมต่อนี้ ทำให้การจับของสไปลโซมเปลี่ยนไปที่ตัวรับตำแหน่งปลายน้ำ การต่อเชื่อม ณ จุดนี้ข้ามโคดอนหยุดซึ่งถูกตัดออกเป็นส่วนหนึ่งของอินทรอน mRNA ที่ได้จะเข้ารหัสโปรตีน Tra ที่ทำงานได้ ซึ่งตัวมันเองเป็นตัวควบคุมการต่อเชื่อมทางเลือกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเพศอื่นๆ (ดูdsxด้านบน) ^{[ 1 ]}

ไอโซฟอร์มหลายชนิดของ โปรตีน ตัวรับ Fasถูกสร้างขึ้นโดยการตัดต่อทางเลือก ไอโซฟอร์มสองชนิดที่เกิดขึ้นตามปกติในมนุษย์ถูกสร้างขึ้นโดยกลไกการข้ามเอ็กซอน mRNA ที่รวมเอ็กซอน 6 จะเข้ารหัสรูปแบบของตัวรับ Fas ที่ยึดติดกับเยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่งส่งเสริมอะพอพโทซิสหรือการตายของเซลล์ตามโปรแกรม การแสดงออกของตัวรับ Fas ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ผิวหนังที่สัมผัสกับแสงแดดเป็นเวลานาน และการไม่มีการแสดงออกในเซลล์มะเร็งผิวหนัง บ่งชี้ว่ากลไกนี้อาจมีความสำคัญในการกำจัดเซลล์ก่อนเป็นมะเร็งในมนุษย์^{[ 29 ]}หากข้ามเอ็กซอน 6 mRNA ที่ได้จะเข้ารหัสโปรตีน Fas ที่ละลายได้ซึ่งไม่ส่งเสริมอะพอพโทซิส การรวมหรือการข้ามเอ็กซอนขึ้นอยู่กับโปรตีนที่เป็นปฏิปักษ์กันสองชนิด ได้แก่TIA-1และโปรตีนที่จับกับพอลิไพริมิดีนแทร็ก (PTB)

• ตำแหน่งผู้ให้ 5' ในอินทรอนที่อยู่ถัดจากเอ็กซอน 6 ในพรี-mRNA มีความสอดคล้องกับลำดับคอนเซนซัสเพียงเล็กน้อย และโดยปกติจะไม่ถูกจับโดย U1 snRNP หาก U1 ไม่จับ เอ็กซอนนั้นจะถูกข้ามไป (ดู "a" ในรูปประกอบ)
• การจับกันของโปรตีน TIA-1 กับไซต์เสริมการต่อเชื่อมอินทรอนิกส์ทำให้การจับกันของ U1 snRNP มีเสถียรภาพ^{[ 16 ]}คอมเพล็กซ์ไซต์ผู้ให้ 5' ที่เกิดขึ้นจะช่วยในการจับกันของปัจจัยการต่อเชื่อม U2AF กับไซต์ต่อเชื่อม 3' ต้นน้ำของเอ็กซอน ผ่านกลไกที่ยังไม่เป็นที่รู้จัก (ดู b) ^{[ 30 ]}
• เอ็กซอน 6 ประกอบด้วยตัวยับยั้งการตัดต่อเอ็กซอนที่มีไพริมิดีนเป็นองค์ประกอบหลักure6ซึ่ง PTB สามารถจับได้ หาก PTB จับได้ มันจะยับยั้งผลของคอมเพล็กซ์ผู้ให้ 5' ต่อการจับของ U2AF กับไซต์ผู้รับ ส่งผลให้เกิดการข้ามเอ็กซอน (ดู c)

กลไกนี้เป็นตัวอย่างของการกำหนดเอ็กซอนในการตัดต่อ สไปโซโซมจะประกอบขึ้นบนอินทรอน และซับยูนิต snRNP จะพับ RNA เพื่อให้ปลาย 5' และ 3' ของอินทรอนเชื่อมต่อกัน อย่างไรก็ตาม ตัวอย่างที่ศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ เช่น ตัวอย่างนี้ แสดงให้เห็นว่ายังมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างปลายของเอ็กซอนด้วย ในกรณีนี้ ปฏิสัมพันธ์ในการกำหนดเอ็กซอนเหล่านี้จำเป็นต่อการอนุญาตให้ปัจจัยการตัดต่อหลักจับกับก่อนการประกอบสไปโซโซมบนอินทรอนที่อยู่ขนาบข้างทั้งสอง^{[ 30 ]}

HIVซึ่งเป็นเรโทรไวรัสที่ก่อให้เกิดโรคเอดส์ในมนุษย์ สร้างทรานสคริปต์ RNA หลักเพียงตัวเดียว ซึ่งถูกตัดต่อแบบทางเลือกได้หลายวิธีเพื่อสร้าง mRNA ที่แตกต่างกันมากกว่า 40 ชนิด^{[ 31 ]}สมดุลระหว่างทรานสคริปต์ที่ถูกตัดต่อแบบแตกต่างกันจะให้ mRNA หลายตัวที่เข้ารหัสผลิตภัณฑ์ที่แตกต่างกันซึ่งจำเป็นสำหรับการเพิ่มจำนวนของไวรัส^{[ 32 ]}หนึ่งในทรานสคริปต์ที่ถูกตัดต่อแบบแตกต่างกันนั้นมี จีน tatซึ่งเอ็กซอน 2 เป็นเอ็กซอนแบบคาสเซ็ตที่อาจถูกข้ามหรือรวมไว้ การรวมเอ็กซอน 2 ของ tat ใน RNA ถูกควบคุมโดยการแข่งขันระหว่างตัวยับยั้งการตัดต่อ hnRNP A1 และโปรตีน SR SC35 ภายในเอ็กซอน 2 ลำดับตัวยับยั้งการตัดต่อเอ็กซอน (ESS) และลำดับตัวเสริมการตัดต่อเอ็กซอน (ESE) จะทับซ้อนกัน หากโปรตีนตัวยับยั้ง A1 จับกับ ESS มันจะเริ่มต้นการจับกันแบบร่วมมือกันของโมเลกุล A1 หลายตัว ขยายเข้าไปในไซต์ผู้บริจาค 5' ต้นน้ำของเอ็กซอน 2 และป้องกันการจับของปัจจัยการตัดต่อหลัก U2AF35 กับส่วนโพลีไพริมิดีน หาก SC35 จับกับ ESE มันจะป้องกันการจับของ A1 และรักษาไซต์ผู้บริจาค 5' ให้อยู่ในสถานะที่เข้าถึงได้สำหรับการประกอบสไปโซโซม การแข่งขันระหว่างตัวกระตุ้นและตัวยับยั้งทำให้มั่นใจได้ว่า mRNA ทั้งสองประเภท (ที่มีและไม่มีเอ็กซอน 2) จะถูกผลิตขึ้น^{[ 31 ]}

การสลับตำแหน่งการต่อเชื่อมที่แท้จริงเกิดขึ้นทั้งในยีนที่เข้ารหัสโปรตีนและยีนที่ไม่เข้ารหัสเพื่อสร้างผลิตภัณฑ์หลายชนิด (โปรตีนหรือ RNA ที่ไม่เข้ารหัส) จำเป็นต้องมีข้อมูลภายนอกเพื่อตัดสินใจว่าจะสร้างผลิตภัณฑ์ใด โดยพิจารณาจากลำดับ DNA และการถอดรหัสเริ่มต้น เนื่องจากวิธีการควบคุมได้รับการถ่ายทอดทางพันธุกรรม จึงทำให้เกิดวิธีการใหม่ๆ ที่การกลายพันธุ์ส่งผลต่อการแสดงออกของยีน^{[ 33 ]}

การสไปลซิงทางเลือกอาจให้ความยืดหยุ่นเชิงวิวัฒนาการ การ กลายพันธุ์แบบ จุด เดียว อาจทำให้เอ็กซอนที่กำหนดถูกแยกออกหรือรวมเข้าในทรานสคริปต์เป็นครั้งคราวในระหว่างการสไปลซิง ทำให้เกิดโปรตีนไอโซฟอร์ม ใหม่ โดยไม่สูญเสียโปรตีนดั้งเดิม^{[ 1 ]}การศึกษาได้ระบุบริเวณที่ไม่มีระเบียบโดยเนื้อแท้ (ดูโปรตีนที่ไม่มีโครงสร้างโดยเนื้อแท้ ) ว่าอุดมไปด้วยเอ็กซอนที่ไม่เป็นองค์ประกอบ^{[ 34 ]}ซึ่งชี้ให้เห็นว่าโปรตีนไอโซฟอร์มอาจแสดงความหลากหลายทางหน้าที่เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงของโมดูลการทำงานภายในบริเวณเหล่านี้ ความหลากหลายทางหน้าที่ดังกล่าวที่เกิดขึ้นโดยไอโซฟอร์มสะท้อนให้เห็นจากรูปแบบการแสดงออกของพวกมันและสามารถทำนายได้โดยวิธีการเรียนรู้ของเครื่อง^{[ 35 ] [ 36 ]}การศึกษาเปรียบเทียบแสดงให้เห็นว่าการสไปลซิงทางเลือกเกิดขึ้นก่อนการมีหลายเซลล์ในวิวัฒนาการ และชี้ให้เห็นว่ากลไกนี้อาจถูกนำมาใช้เพื่อช่วยในการพัฒนาสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์^{[ 37 ]}

งานวิจัยที่อิงตามโครงการจีโนมมนุษย์และการจัดลำดับจีโนมอื่นๆ แสดงให้เห็นว่ามนุษย์มีจำนวนยีนมากกว่าหนอนตัวกลมCaenorhabditis elegans เพียงประมาณ 30% และมากกว่าแมลงวันDrosophila melanogaster เพียงประมาณสองเท่า การค้นพบนี้ทำให้เกิดการคาดการณ์ว่าความซับซ้อนที่มากกว่าของมนุษย์ หรือสัตว์มีกระดูกสันหลังโดยทั่วไป อาจเกิดจากอัตราการตัดต่อทางเลือกที่สูงกว่าในมนุษย์เมื่อเทียบกับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง^{[ 38 ] [ 39 ]}อย่างไรก็ตาม การศึกษาตัวอย่างแท็กแสดงลำดับ (EST) จำนวน 100,000 ตัวอย่างจากมนุษย์ หนู หนูแรต วัว แมลงวัน ( D. melanogaster ) หนอน ( C. elegans ) และพืชArabidopsis thalianaพบว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความถี่ของยีนที่ตัดต่อทางเลือกในมนุษย์และสัตว์อื่นๆ ที่ทดสอบ^{[ 40 ]}อย่างไรก็ตาม การศึกษาอีกชิ้นหนึ่งเสนอว่าผลลัพธ์เหล่านี้เป็นสิ่งผิดปกติที่เกิดจากจำนวน EST ที่แตกต่างกันสำหรับสิ่งมีชีวิตต่างๆ เมื่อเปรียบเทียบความถี่ของการสลับตำแหน่งยีนในกลุ่มยีนแบบสุ่มจากสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด ผู้เขียนสรุปว่าสัตว์มีกระดูกสันหลังมีอัตราการสลับตำแหน่งยีนที่สูงกว่าสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง^{[ 41 ]}

การเปลี่ยนแปลงในกลไกการประมวลผล RNA อาจนำไปสู่การตัดต่อผิดพลาดของทรานสคริปต์หลายตัว ในขณะที่การเปลี่ยนแปลงนิวคลีโอไทด์เดี่ยวในตำแหน่งการตัดต่อหรือตำแหน่งควบคุมการตัดต่อแบบซิสแอคติ้งอาจนำไปสู่ความแตกต่างในการตัดต่อของยีนเดียว และด้วยเหตุนี้จึงส่งผลต่อ mRNA ที่ผลิตจากทรานสคริปต์ของยีนกลายพันธุ์ การศึกษาในปี 2548 ที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ความน่าจะเป็นระบุว่าการกลายพันธุ์ ที่ก่อให้เกิดโรคในมนุษย์มากกว่า 60% ส่งผลต่อการตัดต่อมากกว่าที่จะส่งผลต่อลำดับการเข้ารหัสโดยตรง^{[ 42 ]}การศึกษาล่าสุดระบุว่าหนึ่งในสามของโรคทางพันธุกรรมทั้งหมดมีแนวโน้มที่จะมีองค์ประกอบของการตัดต่อ^{[ 20 ]}ไม่ว่าเปอร์เซ็นต์ที่แน่นอนจะเป็นเท่าใด โรคที่เกี่ยวข้องกับการตัดต่อก็มีอยู่จริง^{[ 43 ]}ดังที่อธิบายไว้ด้านล่าง ตัวอย่างที่โดดเด่นของโรคที่เกี่ยวข้องกับการตัดต่อคือมะเร็ง

mRNA ที่ถูกตัดต่ออย่างผิดปกติยังพบได้ในเซลล์มะเร็งจำนวนมาก^{[ 44 ] [ 45 ] [ 46 ]} การวิเคราะห์ RNA-Seqและโปรตีโอมิกส์แบบผสมผสานได้เผยให้เห็นการแสดงออกที่แตกต่างกันอย่างน่าทึ่งของไอโซฟอร์มการตัดต่อของโปรตีนสำคัญในเส้นทางมะเร็งที่สำคัญ^{[ 47 ]}ยังไม่ชัดเจนเสมอไปว่ารูปแบบการตัดต่อที่ผิดปกติดังกล่าวมีส่วนทำให้เกิดการเจริญเติบโตของมะเร็ง หรือเป็นเพียงผลพวงจากความผิดปกติของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง สำหรับมะเร็งบางชนิด เช่น มะเร็งลำไส้ใหญ่และมะเร็งต่อมลูกหมาก จำนวนข้อผิดพลาดในการตัดต่อต่อมะเร็งแต่ละชนิดแสดงให้เห็นว่าแตกต่างกันอย่างมาก ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่เรียกว่าความไม่เสถียรของท ราน สคริปโตม^{[ 48 ] [ 49 ]}นอกจากนี้ยังพบว่าความไม่เสถียรของทรานสคริปโตมมีความสัมพันธ์อย่างมากกับระดับการแสดงออกที่ลดลงของยีนปัจจัยการตัดต่อ การกลายพันธุ์ของDNMT3Aได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีส่วนทำให้เกิดมะเร็งเม็ดเลือดและ เซลล์สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ ของ DNMT3Aแสดงให้เห็นถึงความไม่เสถียรของทรานสคริปโตมเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์สายพันธุ์ปกติที่เป็นไอโซจีนิก^{[ 50 ]}

ในความเป็นจริงแล้ว เซลล์มะเร็งมีการลดลงของการตัดต่อทางเลือกเมื่อเทียบกับเซลล์ปกติ และประเภทของการตัดต่อก็แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น เซลล์มะเร็งแสดงระดับการคงอยู่ของอินทรอนที่สูงกว่าเซลล์ปกติ แต่มีระดับการข้ามเอ็กซอนที่ต่ำกว่า^{[ 51 ]}ความแตกต่างบางประการในการตัดต่อในเซลล์มะเร็งอาจเกิดจากความถี่สูงของการกลายพันธุ์ของยีนปัจจัยการตัดต่อ^{[ 46 ]}และบางส่วนอาจเกิดจากการเปลี่ยนแปลงในการฟอสโฟรีเลชันของปัจจัยการตัดต่อแบบทรานส์แอคติ้ง^{[ 33 ]}บางส่วนอาจเกิดจากการเปลี่ยนแปลงในปริมาณสัมพัทธ์ของปัจจัยการตัดต่อที่ผลิตขึ้น ตัวอย่างเช่น เซลล์มะเร็งเต้านมแสดงให้เห็นว่ามีระดับของปัจจัยการตัดต่อSF2/ASFเพิ่ม ขึ้น ^{[ 52 ]}การศึกษาหนึ่งพบว่าเปอร์เซ็นต์ที่ค่อนข้างน้อย (383 จากกว่า 26,000) ของตัวแปรการตัดต่อทางเลือกมีความถี่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์เนื้องอกมากกว่าเซลล์ปกติ ซึ่งบ่งชี้ว่ามีชุดยีนจำนวนจำกัดซึ่งเมื่อตัดต่อผิดพลาดจะส่งผลต่อการพัฒนาของเนื้องอก^{[ 53 ]}อย่างไรก็ตาม เชื่อกันว่าผลเสียของทรานสคริปต์ที่ตัดต่อผิดพลาดมักจะได้รับการปกป้องและกำจัดโดยกลไกการควบคุมคุณภาพหลังการถอดรหัสของเซลล์ที่เรียกว่าการสลายตัวของ mRNA ที่เกิดจากความไร้สาระ [NMD] ^{[ 54 ]}

ตัวอย่างหนึ่งของรูปแบบการตัดต่อเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งคือยีนDNMT ของมนุษย์ ยีน DNMT สามยีนเข้ารหัสเอนไซม์ที่เพิ่มหมู่ เมทิลให้กับ DNA ซึ่งเป็นการดัดแปลงที่มักมีผลในการควบคุม พบ mRNA DNMT3B ที่มีการตัดต่อผิดปกติหลายตัวในเนื้องอกและเซลล์มะเร็ง ในการศึกษาแยกกันสองครั้ง การแสดงออกของ mRNA ที่มีการตัดต่อผิดปกติสองตัวนี้ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในรูปแบบการเมทิลเลชั่นของ DNA ในเซลล์เหล่านั้น เซลล์ที่มี mRNA ที่ผิดปกติตัวใดตัวหนึ่งยังเติบโตเร็วกว่าเซลล์ควบคุมถึงสองเท่า ซึ่งบ่งชี้ว่าผลิตภัณฑ์นี้มีส่วนช่วยโดยตรงต่อการพัฒนาของเนื้องอก^{[ 33 ]}

อีกตัวอย่างหนึ่งคือโปรโตออนโคยีนRon ( MST1R ) คุณสมบัติที่สำคัญของเซลล์มะเร็งคือความสามารถในการเคลื่อนที่และบุกรุกเนื้อเยื่อปกติ การผลิตทรานสคริปต์Ron ที่ถูกตัดต่ออย่างผิดปกติ พบว่ามีความเกี่ยวข้องกับระดับ SF2/ASF ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์มะเร็งเต้านม ไอโซฟอร์มที่ผิดปกติของโปรตีน Ron ที่เข้ารหัสโดย mRNA นี้ทำให้เซลล์เคลื่อนที่ได้^{[ 52 ]}

การแสดงออกมากเกินไปของตัวแปรการต่อเชื่อมที่ถูกตัดทอนของ ยีน FOSB – ΔFosB – ในกลุ่มเซลล์ประสาทเฉพาะกลุ่มในนิวเคลียสแอคคัมเบนส์ได้รับการระบุว่าเป็นกลไกเชิงสาเหตุที่เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำและการรักษาการเสพติดยาและรางวัลตามธรรมชาติ^{[ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ]}

การศึกษาวิจัยล่าสุดที่กระตุ้นความคิดชี้ให้เห็นถึงหน้าที่สำคัญของโครงสร้างโครมาตินและการดัดแปลงฮิสโตนในการควบคุมการตัดต่อทางเลือก ข้อมูลเชิงลึกเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการควบคุมเอพิเจเนติกส์ไม่เพียงแต่กำหนดว่าส่วนใดของจีโนมจะถูกแสดงออก แต่ยังกำหนดวิธีการตัดต่ออีกด้วย^{[ 59 ]}

การวิเคราะห์การสลับตำแหน่งของยีนในระดับทรานสคริปโตมโดยทั่วไปจะดำเนินการโดยการจัดลำดับ RNA ที่มีความละเอียดสูง โดยส่วนใหญ่จะใช้การจัดลำดับแบบอ่านสั้น เช่น เครื่องมือของ Illumina แต่การจัดลำดับแบบอ่านยาว เช่น เครื่องมือของ Nanopore หรือ PacBio จะให้ข้อมูลมากกว่า การวิเคราะห์ในระดับทรานสคริปโตมสามารถใช้เพื่อวัดปริมาณการสลับตำแหน่งของยีนที่เบี่ยงเบนไปจากปกติได้ เช่น ในกลุ่มผู้ป่วยมะเร็ง^{[ 60 ]}

เทคโนโลยีการจัดลำดับเชิงลึกถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์จีโนมทั่วทั้งจีโนมของ mRNA ทั้งที่ยังไม่ผ่านกระบวนการและที่ผ่านกระบวนการแล้ว ซึ่งทำให้ได้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการตัดต่อทางเลือก ตัวอย่างเช่น ผลลัพธ์จากการใช้การจัดลำดับเชิงลึกบ่งชี้ว่า ในมนุษย์ ประมาณ 95% ของทรานสคริปต์จากยีนที่มีหลายเอ็กซอนจะผ่านการตัดต่อทางเลือก โดยมีทรานสคริปต์ pre-mRNA จำนวนหนึ่งที่ถูกตัดต่อในลักษณะเฉพาะของเนื้อเยื่อ^{[ 2 ]}จีโนมิกส์เชิงฟังก์ชันและวิธีการคำนวณที่อิงตามการเรียนรู้แบบหลายอินสแตนซ์ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อบูรณาการข้อมูล RNA-seq เพื่อทำนายหน้าที่ของไอโซฟอร์มที่ถูกตัดต่อทางเลือก^{[ 36 ]}การจัดลำดับเชิงลึกยังช่วยในการ ตรวจจับ lariatsชั่วคราว ที่ถูกปล่อยออกมาในระหว่างการตัดต่อใน ร่างกายการกำหนดลำดับไซต์สาขา และการทำแผนที่จุดสาขาขนาดใหญ่ในทรานสคริปต์ pre-mRNA ของมนุษย์^{[ 61 ]}

ในอดีต การค้นพบทรานสคริปต์ที่มีการต่อเชื่อมแบบอื่นทำได้โดยการเปรียบเทียบ ลำดับ ESTแต่ต้องใช้การจัดลำดับ EST จำนวนมาก ห้องสมุด EST ส่วนใหญ่มาจากเนื้อเยื่อจำนวนจำกัด ดังนั้นจึงมีโอกาสสูงที่จะพลาดตัวแปรการต่อเชื่อมเฉพาะเนื้อเยื่อในทุกกรณี อย่างไรก็ตาม ได้มีการพัฒนาวิธีการตรวจสอบการต่อเชื่อมแบบความเร็วสูง เช่น การวิเคราะห์โดยใช้ ไมโครอาร์เรย์ DNAการทดสอบการจับ RNA และการจัดลำดับแบบละเอียดวิธีการเหล่านี้สามารถใช้ในการคัดกรองโพลีมอร์ฟิซึมหรือการกลายพันธุ์ในหรือรอบๆ องค์ประกอบการต่อเชื่อมที่ส่งผลต่อการจับโปรตีน เมื่อรวมกับการทดสอบการต่อเชื่อม รวมถึง การทดสอบ ยีนรายงานในร่างกาย ผลกระทบเชิงหน้าที่ของโพลีมอร์ฟิซึมหรือการกลายพันธุ์ต่อการต่อเชื่อมของทรานสคริปต์ pre-mRNA จึงสามารถวิเคราะห์ได้^{[ 20 ] [ 23 ] [ 62 ]}

ในการวิเคราะห์ไมโครอาร์เรย์จะใช้ อาร์เรย์ของชิ้นส่วน DNA ที่แสดงถึง เอ็กซอน แต่ละตัว ( เช่น ไมโครอาร์เรย์เอ็กซอนของAffymetrix ) หรือขอบเขตเอ็กซอน/เอ็กซอน ( เช่นอาร์เรย์จากExonHitหรือJivan ) จากนั้นจึงใช้โพรบ cDNA ที่ติดฉลาก จากเนื้อเยื่อที่สนใจ โพรบ cDNA จะจับกับ DNA จากเอ็กซอนที่รวมอยู่ใน mRNA ในเนื้อเยื่อต้นกำเนิด หรือกับ DNA จากขอบเขตที่เอ็กซอนสองตัวถูกเชื่อมต่อกัน ซึ่งสามารถเปิดเผยการมีอยู่ของ mRNA ที่มีการตัดต่อแบบทางเลือกเฉพาะได้^{[ 63 ]}

CLIP ( Cross-linking and immunoprecipitation ) ใช้รังสี UV ในการเชื่อมโยงโปรตีนกับโมเลกุล RNA ในเนื้อเยื่อระหว่างการตัดต่อ จากนั้นโปรตีนควบคุมการตัดต่อแบบทรานส์แอคติ้งที่สนใจจะถูกตกตะกอนโดยใช้แอนติบอดีเฉพาะ เมื่อ RNA ที่ติดอยู่กับโปรตีนนั้นถูกแยกและโคลน มันจะเผยให้เห็นลำดับเป้าหมายสำหรับโปรตีนนั้น^{[ 64 ]}อีกวิธีหนึ่งในการระบุโปรตีนที่จับกับ RNA และแมปการจับของพวกมันกับทรานสคริปต์ pre-mRNA คือ "Microarray Evaluation of Genomic Aptamers by shift (MEGAshift)".net ^{[ 65 ]}วิธีนี้เกี่ยวข้องกับการดัดแปลงวิธี "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX)" ^{[ 66 ]}ร่วมกับการอ่านค่าแบบไมโครอาร์เรย์ การใช้วิธี MEGAshift ช่วยให้เข้าใจถึงการควบคุมการตัดต่อทางเลือกโดยการระบุลำดับในทรานสคริปต์ pre-mRNA ที่อยู่รอบเอ็กซอนที่ตัดต่อทางเลือกซึ่งเป็นตัวกลางในการจับกับปัจจัยการตัดต่อที่แตกต่างกัน เช่น ASF/SF2 และ PTB ^{[ 67 ]}แนวทางนี้ยังถูกนำมาใช้เพื่อช่วยในการกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างทุติยภูมิของ RNA และการจับของปัจจัยการตัดต่อ^{[ 22 ]}

การใช้การทดสอบรีพอร์เตอร์ทำให้สามารถค้นหาโปรตีนสไปลซิงที่เกี่ยวข้องกับเหตุการณ์สไปลซิงทางเลือกเฉพาะได้โดยการสร้างยีนรีพอร์เตอร์ที่จะแสดงโปรตีนเรืองแสงที่แตกต่างกัน 2 ชนิดขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาสไปลซิงที่เกิดขึ้น วิธีนี้ถูกนำมาใช้เพื่อแยกตัวกลายพันธุ์ที่มีผลต่อสไปลซิงและเพื่อระบุโปรตีนควบคุมสไปลซิงใหม่ที่ถูกทำให้ไม่ทำงานในตัวกลายพันธุ์เหล่านั้น^{[ 64 ]}

ความก้าวหน้าล่าสุดในการทำนายโครงสร้างโปรตีนได้อำนวยความสะดวกในการพัฒนาเครื่องมือใหม่สำหรับการระบุจีโนมและการวิเคราะห์การตัดต่อทางเลือก ตัวอย่างเช่น isoform.io ซึ่งเป็นแพลตฟอร์มที่ได้รับคำแนะนำจากการทำนายโครงสร้างโปรตีน ได้ประเมินไอโซฟอร์มหลายแสนรายการของยีนที่เข้ารหัสโปรตีนของมนุษย์ที่รวบรวมจากการทดลองลำดับ RNA จำนวนมากในเนื้อเยื่อของมนุษย์หลากหลายชนิด การวิเคราะห์ที่ครอบคลุมนี้ได้นำไปสู่การระบุไอโซฟอร์มจำนวนมากที่มีโครงสร้างที่ทำนายได้อย่างมั่นใจมากขึ้นและอาจมีฟังก์ชันที่เหนือกว่าเมื่อเทียบกับไอโซฟอร์มมาตรฐานในฐานข้อมูลยีนของมนุษย์ล่าสุด ด้วยการบูรณาการการทำนายโครงสร้างเข้ากับหลักฐานการแสดงออกและวิวัฒนาการ แนวทางนี้ได้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของการทำนายโครงสร้างโปรตีนในฐานะเครื่องมือสำหรับการปรับปรุงการระบุจีโนมของมนุษย์^{[ 68 ]}

มีฐานข้อมูลการสลับการต่อยีนทางเลือกอยู่^{[ 69 ] [ 70 ] [ 71 ]}ฐานข้อมูลเหล่านี้มีประโยชน์สำหรับการค้นหายีนที่มีพรีเอ็มอาร์เอ็นเอที่ผ่านกระบวนการสลับการต่อยีนทางเลือกและเหตุการณ์การสลับการต่อยีนทางเลือก หรือเพื่อศึกษาผลกระทบเชิงหน้าที่ของการสลับการต่อยีนทางเลือก

• ฐานข้อมูลAspicDB
• ฐานข้อมูลอินโทรเนเตอร์
• ฐานข้อมูลProSAS

• เอ็กซิตรอน
• การเติมหมู่โพลีอะดีนีน § การเติมหมู่โพลีอะดีนีนแบบทางเลือก
• ทรานส์สไปลซิง

วิกิมีเดียคอมมอนส์มีสื่อที่เกี่ยวข้องกับการตัดต่อทางเลือก (Alternative splicing )

• คำจำกัดความทั่วไปและระบบการตั้งชื่อสำหรับเหตุการณ์การตัดต่อทางเลือก (Alternative Splicing Events)ที่SciVee
• AStalavista (เครื่องมือแสดงภาพภูมิทัศน์การตัดต่อทางเลือก) วิธีการจัดประเภทโครงสร้างการตัดต่อทางเลือกอย่างละเอียดถี่ถ้วนด้วยวิธีการคำนวณ เก็บถาวรเมื่อ 11 ธันวาคม 2009 ที่Wayback Machine
• IsoPred: ฟังก์ชันไอโซฟอร์มที่ทำนายโดยใช้การคำนวณ
• Stamms-lab.net: กลุ่มวิจัยที่ศึกษาปัญหาเกี่ยวกับการตัดต่อทางเลือกและการตัดต่อผิดพลาดในโรคต่างๆ ของมนุษย์
• การตัดต่อทางเลือกของช่องไอออนในสมอง เกี่ยวข้องกับโรคทางจิตและระบบประสาท
• BIPASS: บริการเว็บในการตัดต่อทางเลือก