นอกจากไซต์การจับไพรเมอร์ที่มีการอนุรักษ์สูงแล้ว ลำดับยีน 16S rRNA ยังมีบริเวณที่มีความแปรผันสูงซึ่งสามารถให้ลำดับลายเซ็นเฉพาะสายพันธุ์ที่เป็นประโยชน์สำหรับการระบุแบคทีเรีย^{[ 21 ] [ 22 ]} ด้วยเหตุนี้ การจัดลำดับยีน 16S rRNA จึงแพร่หลายในจุลชีววิทยาทางการแพทย์ในฐานะทางเลือกที่รวดเร็วและราคาถูกกว่าวิธีการระบุแบคทีเรียแบบฟีโนไทป์^{[ 23 ]}แม้ว่าเดิมทีจะใช้เพื่อระบุแบคทีเรีย แต่ต่อมาพบว่าการจัดลำดับ 16S สามารถจัดจำแนกแบคทีเรียใหม่เป็นสายพันธุ์ ใหม่ได้อย่างสมบูรณ์ ^{[ 24 ]}หรือแม้แต่สกุลใหม่ [ 7 ^{] [ 25 ] นอกจาก} นี้ยังใช้เพื่ออธิบายสายพันธุ์ใหม่ที่ไม่เคยเพาะเลี้ยงได้สำเร็จมาก่อน^{[ 26 ] [ 27 ]} ด้วยการจัดลำดับรุ่นที่สามที่เข้ามาในห้องปฏิบัติการหลายแห่ง การระบุลำดับ 16S rRNA หลายพันลำดับพร้อมกันจึงเป็นไปได้ภายในไม่กี่ชั่วโมง ทำให้สามารถ ทำการศึกษา เมตาจีโนมิกส์^ได้เช่น การ ศึกษาจุลินทรีย์ ในลำไส้^{[ 28 ]}ในตัวอย่างที่เก็บจากผู้ป่วยที่ได้รับการยืนยันการติดเชื้อ การจัดลำดับจีโนม 16S rRNA รุ่นใหม่ (NGS) แสดงให้เห็นถึงการตรวจจับที่เพิ่มขึ้นใน 40% ของกรณีเมื่อเทียบกับวิธีการเพาะเลี้ยงแบบดั้งเดิม ยิ่งไปกว่านั้น การบริโภคยาปฏิชีวนะก่อนการเก็บตัวอย่างไม่ได้ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อความไวของ 16S NGS ^{[ 29 ]}

ยีน 16S ของแบคทีเรียประกอบด้วยบริเวณที่มีความแปรผันสูง 9 บริเวณ (V1–V9) ซึ่งมีความยาวตั้งแต่ประมาณ 30 ถึง 100 คู่เบสและเกี่ยวข้องกับโครงสร้างทุติยภูมิของ หน่วยย่อย ไรโบโซมขนาดเล็ก^{[ 30 ]}ระดับการอนุรักษ์แตกต่างกันอย่างมากระหว่างบริเวณที่มีความแปรผันสูง โดยบริเวณที่มีการอนุรักษ์มากกว่าจะสัมพันธ์กับอนุกรมวิธานระดับสูงกว่า และบริเวณที่มีการอนุรักษ์น้อยกว่าจะสัมพันธ์กับระดับที่ต่ำกว่า เช่น สกุลและสปีชีส์^{[ 31 ]}แม้ว่าลำดับ 16S ทั้งหมดจะช่วยให้สามารถเปรียบเทียบบริเวณที่มีความแปรผันสูงทั้งหมดได้ แต่ด้วยความยาวประมาณ 1,500 คู่เบส อาจมีค่าใช้จ่ายสูงเกินไปสำหรับการศึกษาที่ต้องการระบุหรือจำแนกลักษณะของชุมชนแบคทีเรียที่หลากหลาย^{[ 31 ]}การศึกษาเหล่านี้มักใช้แพลตฟอร์ม Illumina ซึ่งสร้างการอ่านได้ในอัตราที่ถูกกว่าการจัดลำดับแบบ 454 pyrosequencingและSanger sequencingถึง 50 เท่าและ 12,000 เท่าตาม ลำดับ ^{[ 32 ]}แม้ว่าการจัดลำดับดีเอ็นเอด้วย Illumina จะมีราคาถูกกว่าและครอบคลุมชุมชนได้ลึกกว่า แต่ก็ให้ผลลัพธ์เป็นลำดับที่มีความยาวเพียง 75–250 คู่เบส (สูงสุด 300 คู่เบสด้วย Illumina MiSeq) และไม่มีโปรโตคอลที่กำหนดไว้สำหรับการประกอบยีนทั้งหมดในตัวอย่างชุมชนได้อย่างน่าเชื่อถือ^{[ 33 ]}อย่างไรก็ตาม สามารถประกอบบริเวณที่มีความแปรผันสูงทั้งหมดได้จากการทำงานของ Illumina เพียงครั้งเดียว ทำให้บริเวณเหล่านั้นเป็นเป้าหมายที่เหมาะสมสำหรับแพลตฟอร์มนี้^{[ 33 ]}

แม้ว่าบริเวณไฮเปอร์แปรผัน 16S จะแตกต่างกันอย่างมากระหว่างแบคทีเรีย แต่ยีน 16S โดยรวมยังคงมีความยาวสม่ำเสมอมากกว่าคู่ของมันในยูคาริโอต ( RNA ไรโบโซม 18S ) ซึ่งสามารถทำให้การจัดเรียงลำดับง่ายขึ้น^{[ 34 ]}นอกจากนี้ ยีน 16S ยังมีลำดับที่อนุรักษ์ไว้สูงระหว่างบริเวณไฮเปอร์แปรผัน ทำให้สามารถออกแบบไพรเมอร์สากลที่สามารถสร้างส่วนเดียวกันของลำดับ 16S ได้อย่างน่าเชื่อถือในกลุ่มสิ่งมีชีวิต ที่แตกต่างกัน [ ^{35 ]}แม้ว่าจะไม่มีบริเวณไฮเปอร์แปรผันใดที่สามารถจำแนกแบคทีเรียทั้งหมดได้อย่างแม่นยำตั้งแต่โดเมน^ไปจนถึงสปีชีส์ แต่บางบริเวณก็สามารถทำนายระดับอนุกรมวิธานเฉพาะได้อย่างน่าเชื่อถือ^{[ 31 ]}การศึกษาชุมชนจำนวนมากเลือกใช้บริเวณไฮเปอร์แปรผันกึ่งอนุรักษ์ เช่น V4 ด้วยเหตุผลนี้ เนื่องจากสามารถให้ความละเอียดใน ระดับ ไฟลัมได้อย่างแม่นยำเช่นเดียวกับยีน 16S ทั้งหมด^{[ 31 ]}ในขณะที่ภูมิภาคที่มีการอนุรักษ์น้อยกว่าประสบปัญหาในการจำแนกชนิดใหม่เมื่ออนุกรมวิธานระดับสูงกว่าไม่เป็นที่รู้จัก ภูมิภาคเหล่านี้มักถูกใช้เพื่อตรวจจับการมีอยู่ของเชื้อโรคเฉพาะ ในการศึกษาหนึ่งโดย Chakravorty et al. ในปี 2550 ผู้เขียนได้กำหนดลักษณะของภูมิภาค V1–V8 ของเชื้อโรคหลายชนิดเพื่อพิจารณาว่าภูมิภาคที่มีความแปรผันสูงใดจะมีประโยชน์มากที่สุดที่จะรวมไว้สำหรับการทดสอบเฉพาะโรคและการทดสอบ ในวง กว้าง^{[ 36 ]}ในบรรดาการค้นพบอื่นๆ พวกเขาสังเกตว่าภูมิภาค V3 ดีที่สุดในการระบุสกุลสำหรับเชื้อโรคทั้งหมดที่ทดสอบ และ V6 มีความแม่นยำที่สุดในการจำแนกชนิดระหว่างเชื้อโรคที่ CDC เฝ้าระวัง ทั้งหมด ที่ทดสอบ รวมถึงโรคแอนแทรกซ์^{[ 36 ]}

แม้ว่าการวิเคราะห์บริเวณไฮเปอร์แปรผัน 16S จะเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการศึกษาอนุกรมวิธานของแบคทีเรีย แต่ก็มีข้อจำกัดในการแยกแยะความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ที่ใกล้เคียงกัน^{[ 35 ]}ในวงศ์Enterobacteriaceae , ClostridiaceaeและPeptostreptococcaceaeสายพันธุ์ต่างๆ สามารถมีความคล้ายคลึงกันของลำดับได้ถึง 99% ตลอดทั้งยีน 16S ^{[ 37 ]}ส่งผลให้ลำดับ V4 อาจแตกต่างกันเพียงไม่กี่นิวคลี โอไทด์ ทำให้ฐานข้อมูลอ้างอิงไม่สามารถจำแนกแบคทีเรียเหล่านี้ได้อย่างน่าเชื่อถือในระดับอนุกรมวิธานที่ต่ำกว่า^{[ 37 ]}การจำกัดการวิเคราะห์ 16S เฉพาะบริเวณไฮเปอร์แปรผันที่เลือกไว้ ทำให้การศึกษาเหล่านี้ไม่สามารถสังเกตความแตกต่างในกลุ่มอนุกรมวิธานที่ใกล้เคียงกันและจัดกลุ่มพวกมันไว้ในหน่วยอนุกรมวิธานเดียว จึงทำให้ประเมินความหลากหลายทั้งหมดของตัวอย่างต่ำกว่าความเป็นจริง^{[ 35 ]}นอกจากนี้ จีโนมของแบคทีเรียสามารถมียีน 16S หลายยีน โดยบริเวณ V1, V2 และ V6 มีความหลากหลายภายในสายพันธุ์มากที่สุด^{[ 8 ]}แม้ว่าจะไม่ใช่วิธีการจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียที่แม่นยำที่สุด แต่การวิเคราะห์บริเวณที่มีความแปรผันสูงยังคงเป็นหนึ่งในเครื่องมือที่มีประโยชน์ที่สุดสำหรับการศึกษาชุมชนแบคทีเรีย^{[ 37 ]}

SILVAจัดเตรียมชุดข้อมูลที่ครอบคลุม ผ่านการตรวจสอบคุณภาพ และอัปเดตอย่างสม่ำเสมอของลำดับ RNA ไรโบโซม (rRNA) หน่วยย่อยขนาดเล็ก (16S/ 18S , SSU ) และหน่วยย่อยขนาดใหญ่ ( 23S / 28S , LSU ) สำหรับสิ่งมีชีวิตทั้งสามโดเมน รวมถึงชุดเครื่องมือค้นหา ออกแบบไพรเมอร์ และจัดเรียงลำดับ (แบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอตา) ^{[ 43 ]}

GreenGenes เป็นฐานข้อมูลอ้างอิงยีน 16S rRNA ที่ครอบคลุมและมีการควบคุมคุณภาพ รวมถึงอนุกรมวิธานตาม วิวัฒนาการ แบบ de novoซึ่งให้ชุดหน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ มาตรฐาน ^{[ 44 ] [ 45 ]}ในปี 2023 GreenGenes2 ได้ถูกเผยแพร่^{[ 46 ]}

ฐานข้อมูล EzBioCloud ซึ่งเดิมชื่อEzTaxonประกอบด้วยระบบอนุกรมวิธานแบบลำดับชั้นที่สมบูรณ์ซึ่งมีแบคทีเรียและอาร์เคีย 62,988 สปีชีส์/ไฟโลไทป์ ซึ่งรวมถึงชื่อที่ตีพิมพ์ที่ถูกต้อง 15,290 ชื่อ ณ เดือนกันยายน 2018 โดยอิงตามความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการ เช่น ความน่าจะเป็นสูงสุดและ OrthoANI สปีชีส์/ซับสปีชีส์ทั้งหมดจะถูกแทนด้วยลำดับยีน 16S rRNA อย่างน้อยหนึ่งลำดับ ฐานข้อมูล EzBioCloud ได้รับการดูแลและอัปเดตอย่างเป็นระบบเป็นประจำ ซึ่งรวมถึงสปีชีส์ผู้สมัครใหม่ด้วย นอกจากนี้ เว็บไซต์ยังให้ บริการเครื่องมือ ทางชีวสารสนเทศเช่น เครื่องคำนวณ ANI, ContEst16S และ 16S rRNA DB สำหรับ QIIME และ Mothur pipeline ^{[ 47 ]}

MIMt เป็นฐานข้อมูล 16S ขนาดกะทัดรัดที่ไม่ซ้ำซ้อนสำหรับการระบุตัวอย่างเมตาจีโนมิกอย่างรวดเร็ว ประกอบด้วยลำดับ 16S ที่สมบูรณ์ 48,749 ลำดับ ซึ่งเป็นของแบคทีเรียและอาร์เคีย 24,626 สปีชีส์ที่จำแนกไว้อย่างดี ลำดับทั้งหมดได้มาจากจีโนมที่สมบูรณ์ซึ่งฝากไว้ใน NCBI และสำหรับแต่ละลำดับจะมีลำดับชั้นทางอนุกรมวิธานที่สมบูรณ์ให้ไว้ ไม่มีการซ้ำซ้อน ดังนั้นจึงพิจารณาเพียงตัวแทนเดียวสำหรับแต่ละสปีชีส์เพื่อหลีกเลี่ยงลำดับเดียวกันจากสายพันธุ์ ไอโซเลต หรือพาโทวาร์ที่แตกต่างกัน ส่งผลให้เป็นเครื่องมือที่รวดเร็วมากสำหรับการระบุจุลินทรีย์ เข้ากันได้กับซอฟต์แวร์การจำแนกประเภทใด ๆ (QIIME, Mothur, DADA เป็นต้น) ^{[ 48 ]}

โครงการฐานข้อมูลไรโบโซม (RDP) เป็นฐานข้อมูลที่ได้รับการดูแลจัดการซึ่งนำเสนอข้อมูลไรโบโซมพร้อมกับโปรแกรมและบริการที่เกี่ยวข้อง การนำเสนอประกอบด้วยการจัดเรียงลำดับทางวิวัฒนาการของลำดับ RNA ไรโบโซม (rRNA) แผนภูมิวิวัฒนาการที่ได้มา แผนภาพโครงสร้างทุติยภูมิของ rRNA และแพ็คเกจซอฟต์แวร์ต่างๆ สำหรับการจัดการ การวิเคราะห์ และการแสดงผลการจัดเรียงลำดับและแผนภูมิ^{[ 49 ]}เนื่องจากมีขนาดใหญ่ ฐานข้อมูล RDP จึงมักถูกใช้เป็นพื้นฐานสำหรับการพัฒนาเครื่องมือทางชีวสารสนเทศและการสร้างฐานข้อมูลที่ได้รับการดูแลจัดการด้วยตนเอง^{[ 50 ]}เซิร์ฟเวอร์ RDP ถูกปิดใช้งานในปี 2023 แต่ซอฟต์แวร์ยังคงสามารถดาวน์โหลดได้^{[ 51 ]}