การจัดลำดับโปรตีน
การหาลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนเป็นกระบวนการเชิงปฏิบัติในการหาลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนหรือเปปไทด์ ทั้งหมดหรือบางส่วน ซึ่งอาจใช้เพื่อระบุโปรตีนหรือศึกษาลักษณะการดัดแปลงหลังการสังเคราะห์ โปรตีน โดยทั่วไป การหาลำดับกรดอะมิโนบางส่วนของโปรตีนจะให้ข้อมูลที่เพียงพอ (แท็กของลำดับอย่างน้อยหนึ่งแท็ ก) เพื่อระบุโปรตีนนั้นโดยอ้างอิงจากฐานข้อมูลลำดับโปรตีนที่ได้มาจากการแปล ความหมาย ของยีน
วิธี การหลักสองวิธีในการหาลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนโดยตรง ได้แก่การวิเคราะห์มวลสาร ด้วยเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี และการย่อยสลายแบบเอ็ดแมนโดยใช้เครื่องหาลำดับกรดอะมิโน (ซีเควนเซอร์) ปัจจุบันวิธีแมสสเปกโทรเมตรีเป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในการหาลำดับและระบุโปรตีน แต่การย่อยสลายแบบเอ็ดแมนยังคงเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าสำหรับการระบุลักษณะเฉพาะของ ปลาย N -terminus ของ โปรตีน
การหาองค์ประกอบของกรดอะมิโน
โดยทั่วไปแล้ว การทราบองค์ประกอบของกรดอะมิโนที่ไม่เรียงลำดับของโปรตีนก่อนที่จะพยายามค้นหาลำดับที่เรียงลำดับนั้นเป็นสิ่งที่พึงปรารถนา เนื่องจากความรู้นี้สามารถนำมาใช้เพื่อช่วยในการค้นหาข้อผิดพลาดในกระบวนการจัดลำดับหรือเพื่อแยกแยะผลลัพธ์ที่ไม่ชัดเจน ความรู้เกี่ยวกับความถี่ของกรดอะมิโนบางชนิดอาจถูกนำมาใช้เพื่อเลือกโปรตีเอสที่จะใช้ในการย่อยโปรตีน นอกจากนี้ยังสามารถระบุการรวมตัวของกรดอะมิโนที่ไม่เป็นมาตรฐานในระดับต่ำ (เช่น นอร์ลิวซีน) เข้าไปในโปรตีนได้อีกด้วย[ 1 ]วิธีการทั่วไปที่มักเรียกว่าการวิเคราะห์กรดอะมิโน[ 2 ]สำหรับการกำหนดความถี่ของกรดอะมิโนมีดังนี้:
- ย่อยสลายโปรตีนปริมาณที่ทราบแล้วให้เป็นกรดอะมิโนที่เป็นส่วนประกอบ
- แยกและหาปริมาณกรดอะมิโนด้วยวิธีใดวิธีหนึ่ง
ไฮโดรไลซิส
การไฮโดรไลซิสทำได้โดยการให้ความร้อนแก่ตัวอย่างโปรตีนในกรดไฮโดรคลอริก 6 M ที่อุณหภูมิ 100–110 °C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหรือนานกว่านั้น โปรตีนที่มี หมู่ ไฮโดรโฟบิก ขนาดใหญ่จำนวนมาก อาจต้องใช้ระยะเวลาในการให้ความร้อนนานกว่า อย่างไรก็ตาม สภาวะเหล่านี้รุนแรงมากจนกรดอะมิโนบางชนิด ( ซีรีน , ทรีโอนีน , ไทโรซีน , ทริปโตเฟน , กลูตามีนและซิสเทอีน ) เสื่อมสภาพ เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหานี้ Biochemistry Online แนะนำให้ให้ความร้อนแก่ตัวอย่างแยกกันในระยะเวลาที่ต่างกัน วิเคราะห์สารละลายที่ได้แต่ละครั้ง และประมาณค่ากลับไปยังเวลาไฮโดรไลซิสเป็นศูนย์ Rastall แนะนำสารเคมีหลายชนิดเพื่อป้องกันหรือลดการเสื่อมสภาพ เช่นสารเคมีกลุ่มไทออล หรือฟีนอลเพื่อป้องกันทริปโตเฟนและไทโรซีนจากการถูกคลอรีนโจมตี และการออกซิไดซ์ซิสเทอีนล่วงหน้า เขายังแนะนำให้วัดปริมาณแอมโมเนียที่เกิดขึ้นเพื่อกำหนดขอบเขตของ การไฮโดรไลซิ สของอะไมด์
การแยกและการหาปริมาณ
กรดอะมิโนสามารถแยกออกจากกันได้โดยใช้โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนจากนั้นจึงทำการดัดแปลงโครงสร้างทางเคมีเพื่อให้ตรวจจับได้ง่ายขึ้น โดยทั่วไปแล้ว กรดอะมิโนจะถูกดัดแปลงโครงสร้างทางเคมีก่อนแล้วจึงแยกออกจากกันโดยใช้HPLC แบบเฟสผกผัน
ตัวอย่างหนึ่งของโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนนั้น ได้มาจาก NTRC โดยใช้โพลีสไตรีนซัลโฟเนตเป็นเมทริกซ์ เติมกรดอะมิโนในสารละลายกรด และผ่านบัฟเฟอร์ที่มีค่า pH เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ผ่านคอลัมน์ กรดอะมิโนจะถูกชะออกมาเมื่อค่า pH ถึงจุดไอโซอิเล็กทริกของ กรดอะมิโนนั้นๆ เมื่อแยกกรดอะมิโนได้แล้ว ปริมาณของกรดอะมิโนแต่ละชนิดจะถูกกำหนดโดยการเติมรีเอเจนต์ที่จะสร้างอนุพันธ์ที่มีสี หากปริมาณกรดอะมิโนเกิน 10 นาโนโมล สามารถใช้ ไนน์ไฮดรินได้ ซึ่งจะให้สีเหลืองเมื่อทำปฏิกิริยากับโพรลีน และสีม่วงสดใสกับกรดอะมิโนอื่นๆ ความเข้มข้นของกรดอะมิโนเป็นสัดส่วนกับค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายที่ได้ สำหรับปริมาณที่น้อยมาก จนถึง 10 พิโคโมล สามารถสร้างอนุพันธ์เรืองแสงได้โดยใช้รีเอเจนต์ เช่นออร์โธฟทาลดีไฮด์ (OPA)หรือฟลูออเรสคามีน
การเตรียมอนุพันธ์ก่อนการแยกด้วยคอลัมน์อาจใช้รีเอเจนต์ Edman เพื่อสร้างอนุพันธ์ที่ตรวจจับได้ด้วยแสง UV หากต้องการความไวในการตรวจวัดที่สูงขึ้น จะใช้รีเอเจนต์ที่สร้างอนุพันธ์เรืองแสง กรดอะมิโนที่ผ่านการเตรียมอนุพันธ์แล้วจะถูกนำไปแยกด้วยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน โดยทั่วไปจะใช้คอลัมน์ซิลิกา C8 หรือ C18 และ ใช้กราเดียนต์ การชะล้าง ที่เหมาะสม กรดอะมิโนที่ถูกชะล้างออกมาจะถูกตรวจจับโดยใช้เครื่องตรวจจับ UV หรือเครื่องตรวจจับเรืองแสง และเปรียบเทียบพื้นที่ใต้กราฟกับพื้นที่ใต้กราฟของสารมาตรฐานที่ผ่านการเตรียมอนุพันธ์แล้ว เพื่อหาปริมาณกรดอะมิโนแต่ละชนิดในตัวอย่าง
การวิเคราะห์กรดอะมิโนปลายN
การระบุกรดอะมิโนที่ประกอบเป็นปลายNของ สาย เปปไท ด์นั้น มีประโยชน์สองประการ คือ เพื่อช่วยในการเรียงลำดับของชิ้นส่วนเปปไทด์แต่ละชิ้นให้เป็นสายทั้งหมด และเนื่องจากการย่อยสลายแบบเอ็ดแมน รอบแรก มักปนเปื้อนด้วยสิ่งเจือปน จึงทำให้ไม่สามารถระบุ กรดอะมิโนที่ปลาย N ได้อย่างแม่นยำ วิธี การวิเคราะห์กรดอะมิโนที่ปลาย N แบบทั่วไป มีดังต่อไปนี้:
- นำเปปไทด์ไปทำปฏิกิริยากับสารเคมีที่จะติดฉลากเฉพาะกรดอะมิโนที่ปลายสุดของเปปไทด์
- ไฮโดรไลซ์โปรตีน
- ตรวจสอบกรดอะมิโนโดยใช้วิธีโครมาโทกราฟีและเปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน
มีสารเคมีหลายชนิดที่สามารถใช้ในการติดฉลากกรดอะมิโนที่ปลายสายโซ่ สารเคมีเหล่านี้ทั้งหมดทำปฏิกิริยากับหมู่เอมีน และจะจับกับหมู่เอมีนในโซ่ข้างของกรดอะมิโน เช่น ไลซีน ด้วยเหตุนี้ จึงจำเป็นต้องระมัดระวังในการตีความโครมาโทแกรมเพื่อให้แน่ใจว่าได้เลือกจุดที่ถูกต้อง สารเคมีที่ใช้กันทั่วไปสองชนิดคือสารเคมีของแซงเกอร์ ( 1-ฟลูออโร-2,4-ไดไนโตรเบนซีน ) และอนุพันธ์ของแดนซิล เช่นแดนซิลคลอไรด์นอกจาก นี้ยังสามารถใช้ ฟีนิลไอโซไทโอไซยาเนต ซึ่งเป็นสารเคมีที่ใช้ในการย่อยสลายแบบเอ็ดแมนได้อีกด้วย หลักการเดียวกันกับที่ใช้ในการหาองค์ประกอบของกรดอะมิโน ยกเว้นว่าไม่จำเป็นต้องใช้สีย้อม เนื่องจากสารเคมีจะสร้างอนุพันธ์ที่มีสี และต้องการเพียงการวิเคราะห์เชิงคุณภาพเท่านั้น ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องแยกกรดอะมิโนออกจากคอลัมน์โครมาโทกราฟี เพียงแค่เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานก็พอ อีกประเด็นที่ควรพิจารณาคือ เนื่องจากหมู่เอมีนใดๆ จะทำปฏิกิริยากับสารที่ใช้ในการติดฉลากแล้ว จึงไม่สามารถใช้โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนได้ และควรใช้ โครมาโทกราฟี แบบแผ่นบางหรือโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูง แทน
การวิเคราะห์กรดอะมิโนปลายซี
วิธี การวิเคราะห์กรดอะมิโน ที่ปลาย C-terminus มีจำนวน น้อยกว่าวิธีการวิเคราะห์ที่ปลาย N-terminus มาก วิธีที่ใช้กันทั่วไปคือการเติมคาร์บอกซีเปปติเดสลงในสารละลายโปรตีน เก็บตัวอย่างในช่วงเวลาที่กำหนด และหากรดอะมิโนที่ปลายโดยการวิเคราะห์กราฟความเข้มข้นของกรดอะมิโนเทียบกับเวลา วิธีนี้จะมีประโยชน์มากในกรณีของพอลิเปปไทด์และปลาย N-terminus ที่ถูกปิดกั้นด้วยโปรตีน การหาลำดับกรดอะมิโนที่ปลาย C-terminus จะช่วยอย่างมากในการตรวจสอบโครงสร้างหลักของโปรตีนที่ทำนายจากลำดับดีเอ็นเอ และตรวจจับกระบวนการหลังการแปลรหัสของผลิตภัณฑ์ยีนจากลำดับโคดอนที่ทราบแล้ว
ความเสื่อมโทรมของเอ็ดมัน
ปฏิกิริยา การสลาย ตัวแบบเอ็ดแมน (Edman degradation)เป็นปฏิกิริยาที่สำคัญมากสำหรับการหาลำดับกรดอะมิโนในโปรตีน เนื่องจากช่วยให้สามารถค้นพบองค์ประกอบของกรดอะมิโนที่เรียงลำดับได้ในโปรตีน ปัจจุบันเครื่องหาลำดับกรดอะมิโนแบบเอ็ดแมนอัตโนมัติมีการใช้งานอย่างแพร่หลาย และสามารถหาลำดับกรดอะมิโนในเปปไทด์ได้ยาวถึงประมาณ 50 กรดอะมิโน แผนผังปฏิกิริยาสำหรับการหาลำดับกรดอะมิโนในโปรตีนโดยวิธีการสลายตัวแบบเอ็ดแมนมีดังต่อไปนี้ โดยจะมีการอธิบายรายละเอียดบางขั้นตอนเพิ่มเติมในภายหลัง
- ทำลายพันธะไดซัลไฟด์ ใดๆ ในโปรตีนด้วยสารรีดิวซ์เช่น2-เมอร์แคปโทเอทานอล อาจจำเป็นต้องใช้ หมู่ป้องกันเช่นกรดไอโอโดอะซิติกเพื่อป้องกันไม่ให้พันธะก่อตัวขึ้นใหม่
- แยกและทำให้บริสุทธิ์สายโซ่แต่ละสายของโปรตีนเชิงซ้อน หากมีมากกว่าหนึ่งสาย
- จงระบุองค์ประกอบของกรดอะมิโนในแต่ละสายโซ่
- ระบุกรดอะมิโนปลายสุดของแต่ละสายโซ่
- แบ่งสายโซ่แต่ละสายออกเป็นชิ้นส่วนที่มีความยาวไม่เกิน 50 กรดอะมิโน
- แยกและทำให้บริสุทธิ์ชิ้นส่วนต่างๆ
- กำหนดลำดับของแต่ละชิ้นส่วน
- ทำซ้ำโดยใช้รูปแบบการแยกชั้นที่แตกต่างกัน
- สร้างลำดับของโปรตีนโดยรวม
การย่อยเป็นชิ้นส่วนเปปไทด์
เปปไทด์ที่มีความยาวมากกว่าประมาณ 50–70 กรดอะมิโน ไม่สามารถหาลำดับกรดอะมิโนได้อย่างน่าเชื่อถือด้วยวิธี Edman degradation ด้วยเหตุนี้ จึงจำเป็นต้องย่อยสายโปรตีนยาวๆ เหล่านั้นให้เป็นชิ้นเล็กๆ ก่อน แล้วจึงหาลำดับกรดอะมิโนทีละชิ้น การย่อยทำได้โดยใช้เอนโดเปปติเดสเช่นทริปซินหรือเปปซินหรือโดยใช้สารเคมี เช่นไซยาโนเจนโบรไม ด์ เอนไซม์แต่ละชนิดจะให้รูปแบบการย่อยที่แตกต่างกัน และส่วนที่ทับซ้อนกันระหว่างชิ้นส่วนต่างๆ สามารถนำมาใช้สร้างลำดับกรดอะมิโนโดยรวมได้
ปฏิกิริยา
เปปไทด์ที่จะนำมาหาลำดับกรดอะมิโนจะถูกดูดซับลงบนพื้นผิวของแข็งพื้นผิว ที่นิยมใช้กันอย่างหนึ่ง คือใยแก้วเคลือบด้วยโพลีเบรนซึ่งเป็นพอลิเมอร์ประจุ บวก จากนั้นจะเติม สารรีเอเจนต์เอ็ดแมนฟีนิลไอโซไท โอไซยา เนต (PITC) ลงในเปปไทด์ที่ถูกดูดซับไว้ พร้อมกับสารละลายบัฟเฟอร์ที่ เป็นเบสอ่อนๆ ที่ มีไตรเมทิลอะมีน 12% สารนี้จะทำปฏิกิริยากับหมู่เอมีนของกรดอะมิโนที่ปลาย N-เทอร์มินัล
จากนั้นกรดอะมิโนปลายสุดสามารถถูกแยกออกได้อย่างเลือกสรรโดยการเติม กรด ปราศจากน้ำอนุพันธ์นั้นจะเกิดการไอโซเมอไรเซชันเพื่อให้ได้ฟีนิลไทโอไฮแดนโทอิน ที่ถูกแทนที่ ซึ่งสามารถล้างออกและระบุได้โดยวิธีโครมาโทกราฟี และสามารถทำซ้ำวงจรได้ ประสิทธิภาพของแต่ละขั้นตอนอยู่ที่ประมาณ 98% ซึ่งช่วยให้สามารถระบุกรดอะมิโนได้ประมาณ 50 ชนิดอย่างน่าเชื่อถือ
เครื่องจัดลำดับโปรตีน
เครื่องจัดลำดับโปรตีน[ 3 ]เป็นเครื่องที่ทำการย่อยสลายแบบ Edman โดยอัตโนมัติ ตัวอย่างของโปรตีนหรือเปปไทด์จะถูกตรึงไว้ในภาชนะปฏิกิริยาของเครื่องจัดลำดับโปรตีน และจะทำการย่อยสลายแบบ Edman แต่ละรอบจะปล่อยและดัดแปลงกรดอะมิโนหนึ่งตัวจาก ปลาย N ของโปรตีนหรือเปปไทด์ และอนุพันธ์ของกรดอะมิโนที่ปล่อยออกมาจะถูกระบุโดย HPLC กระบวนการจัดลำดับจะทำซ้ำสำหรับโพลีเปปไทด์ ทั้งหมด จนกว่าจะได้ลำดับที่วัดได้ทั้งหมด หรือจนกว่าจะครบจำนวนรอบที่กำหนดไว้ล่วงหน้า
การระบุโดยใช้แมสสเปกโทรเมตรี
การระบุโปรตีนคือกระบวนการกำหนดชื่อให้กับโปรตีนที่สนใจ (POI) โดยอาศัยลำดับกรดอะมิโน โดยทั่วไปแล้ว จำเป็นต้องกำหนดลำดับของโปรตีนเพียงบางส่วนจากการทดลองเพื่อระบุโปรตีนโดยอ้างอิงจากฐานข้อมูลลำดับโปรตีนที่ได้จากการถอดรหัสลำดับดีเอ็นเอของยีน การระบุลักษณะเฉพาะของโปรตีนเพิ่มเติมอาจรวมถึงการยืนยันปลาย N- และ C-terminus ที่แท้จริงของ POI การกำหนดลำดับที่แตกต่างกัน และการระบุการดัดแปลงหลังการแปลรหัสที่เกิดขึ้น
การย่อยด้วยเอนไซม์โปรตีเอส
มีการอธิบายโครงร่างทั่วไปสำหรับการระบุโปรตีน[ 4 ] [ 5 ]
- โดยทั่วไปจะแยกโปรตีนเป้าหมาย (POI) ออกมาโดยใช้SDS-PAGEหรือโครมาโทกราฟี
- POI ที่แยกออกมาอาจได้รับการดัดแปลงทางเคมีเพื่อทำให้หมู่ซิสเทอีนมีความเสถียร (เช่น การเติมหมู่ S-amidomethylation หรือการเติมหมู่ S-carboxymethylation)
- โปรตีนเป้าหมาย (POI) จะถูกย่อยด้วยเอนไซม์โปรตีเอสชนิดเฉพาะเพื่อสร้างเปปไทด์ ท ริปซินเป็นเอนไซม์โปรตีเอสที่ใช้กันมากที่สุด เพราะสามารถตัดเฉพาะที่ปลายด้าน C ของกรดอะมิโนไลซีนหรืออาร์จินีนได้ ข้อดีของทริปซิน ได้แก่ i) ความถี่ของกรดอะมิโนไลซีนและอาร์จินีนในโปรตีน ii) ความจำเพาะสูงของเอนไซม์ iii) ความเสถียรของเอนไซม์ และ iv) ความเหมาะสมของเปปไทด์ที่ได้จากทริปซินสำหรับการวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมตรี
- อาจทำการกำจัดเกลือออกจากเปปไทด์เพื่อขจัดสิ่งปนเปื้อนที่สามารถแตกตัวเป็นไอออนได้ แล้วนำไปวิเคราะห์ด้วย เครื่องแมสสเปกโทรเมตรี แบบ MALDI-TOFการวัดมวลของเปปไทด์โดยตรงอาจให้ข้อมูลเพียงพอสำหรับการระบุโปรตีน (ดูการระบุลายนิ้วมือมวลเปปไทด์ ) แต่การแตกตัวของเปปไทด์เพิ่มเติมภายในเครื่องแมสสเปกโทรเมตรีมักใช้เพื่อให้ได้ข้อมูลเกี่ยวกับลำดับของเปปไทด์ หรืออีกทางเลือกหนึ่ง อาจทำการกำจัดเกลือออกจากเปปไทด์และแยกโดยใช้HPLC แบบเฟสผกผันแล้วนำเข้าสู่เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีผ่าน แหล่งกำเนิด ESI LC-ESI-MS อาจให้ข้อมูลมากกว่า MALDI-MS สำหรับการระบุโปรตีน แต่ใช้เวลาในการทำงานของเครื่องมือมากกว่า
- ขึ้นอยู่กับชนิดของแมสสเปกโทรเมตรี การแตกตัวของไอออนเปปไทด์อาจเกิดขึ้นได้ผ่านกลไกต่างๆ เช่นการแตกตัวเนื่องจากการชน (CID) หรือการสลายตัวหลังแหล่งกำเนิด (PSD) ในแต่ละกรณี รูปแบบของไอออนที่แตกตัวของเปปไทด์จะให้ข้อมูลเกี่ยวกับลำดับของเปปไทด์นั้น
- จากนั้น ข้อมูลต่างๆ รวมถึงมวลที่วัดได้ของไอออนเปปไทด์ที่คาดการณ์ไว้และไอออนชิ้นส่วนของพวกมัน จะถูกนำไปเปรียบเทียบกับค่ามวลที่คำนวณได้จากการย่อยสลายโปรตีนและการแยกชิ้นส่วนในเชิงแนวคิด (in-silico) ของฐานข้อมูลลำดับโปรตีน การจับคู่ที่สำเร็จจะเกิดขึ้นหากคะแนนเกินเกณฑ์ที่กำหนดตามพารามิเตอร์การวิเคราะห์ แม้ว่าโปรตีนจริงจะไม่ได้อยู่ในฐานข้อมูล การจับคู่ที่ยอมรับข้อผิดพลาดได้จะช่วยให้สามารถระบุโปรตีนที่คาดการณ์ไว้ได้โดยอาศัยความคล้ายคลึงกับ โปรตีน ที่คล้ายคลึงกันมีซอฟต์แวร์หลายแพ็กเกจที่สามารถใช้ทำการวิเคราะห์นี้ได้
- โดยปกติแล้ว โปรแกรมซอฟต์แวร์จะสร้างรายงานที่แสดงรหัสประจำตัว (รหัสการเข้าถึง) ของโปรตีนแต่ละตัวที่ระบุได้ คะแนนการจับคู่ และค่าบ่งชี้ความแข็งแกร่งสัมพัทธ์ของการจับคู่ในกรณีที่มีการระบุโปรตีนหลายตัว
- โดยทั่วไปมักใช้แผนภาพของเปปไทด์ที่ตรงกันกับลำดับของโปรตีนที่ระบุ เพื่อแสดงความครอบคลุมของลำดับ (เปอร์เซ็นต์ของโปรตีนที่ตรวจพบเป็นเปปไทด์) ในกรณีที่คาดว่า POI มีขนาดเล็กกว่าโปรตีนที่ตรงกันอย่างมีนัยสำคัญ แผนภาพอาจบ่งชี้ว่า POI เป็นชิ้นส่วนปลาย N หรือปลาย C ของโปรตีนที่ระบุ
การจัดลำดับดีเอ็นเอแบบ de novo
รูปแบบการแตกตัวของเปปไทด์ช่วยให้สามารถกำหนดลำดับของเปปไทด์ได้โดยตรงด้วยวิธีการจัดลำดับแบบde novoลำดับนี้สามารถนำไปใช้เปรียบเทียบกับฐานข้อมูลลำดับโปรตีน หรือใช้ในการตรวจสอบ การดัดแปลง หลังการสังเคราะห์โปรตีนหรือการดัดแปลงทางเคมี นอกจากนี้ยังอาจให้หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับการระบุโปรตีนที่ดำเนินการตามที่กล่าวมาข้างต้น
ปลาย N และปลาย C
เปปไทด์ที่ตรงกันระหว่างการระบุโปรตีนนั้น ไม่จำเป็นต้องรวมถึงปลาย N- หรือ C-terminus ที่คาดการณ์ไว้สำหรับโปรตีนที่ตรงกันเสมอไป นี่อาจเป็นผลมาจากเปปไทด์ปลาย N- หรือ C-terminus นั้นยากต่อการระบุด้วย MS (เช่น สั้นเกินไปหรือยาวเกินไป) มีการดัดแปลงหลังการสังเคราะห์โปรตีน (เช่น การเติมหมู่แอเซทิลที่ปลาย N-terminus) หรือแตกต่างจากที่คาดการณ์ไว้จริง ๆ การดัดแปลงหลังการสังเคราะห์โปรตีนหรือปลายที่ถูกตัดทอนอาจระบุได้โดยการตรวจสอบข้อมูลอย่างละเอียด (เช่น การจัดลำดับแบบ de novo ) การย่อยซ้ำโดยใช้โปรตีเอสที่มีความจำเพาะต่างกันก็อาจเป็นประโยชน์เช่นกัน
การดัดแปลงหลังการแปล
ในขณะที่การเปรียบเทียบข้อมูล MS อย่างละเอียดกับผลการทำนายโดยอิงจากลำดับโปรตีนที่ทราบแล้ว อาจใช้เพื่อกำหนดการดัดแปลงหลังการแปลรหัสได้ วิธีการเก็บข้อมูลแบบเจาะจงเป้าหมายก็สามารถนำมาใช้ได้เช่นกัน ตัวอย่างเช่น การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์โดยเฉพาะ อาจช่วยในการระบุ ตำแหน่ง การฟอสโฟรีเลชันในโปรตีน วิธีการแยกส่วนเปปไทด์แบบอื่นในเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี เช่นETDหรือECDอาจให้ข้อมูลลำดับที่เสริมกันได้
การหาค่ามวลรวม
มวลรวมของโปรตีนคือผลรวมของมวลของกรดอะมิโนแต่ละหน่วยบวกกับมวลของโมเลกุลน้ำ และปรับค่าตามการดัดแปลงหลังการสังเคราะห์โปรตีน แม้ว่าโปรตีนจะแตกตัวเป็นไอออนได้น้อยกว่าเปปไทด์ที่ได้จากโปรตีนนั้น แต่โปรตีนในสารละลายอาจสามารถนำไปวิเคราะห์ด้วย ESI-MS และวัดมวลได้ด้วยความแม่นยำ 1 ส่วนใน 20,000 หรือดีกว่านั้น ซึ่งมักจะเพียงพอที่จะยืนยันปลายของโปรตีน (ดังนั้นมวลที่วัดได้ของโปรตีนจึงตรงกับที่คาดการณ์จากลำดับกรดอะมิโน) และอนุมานการมีอยู่หรือไม่มีอยู่ของการดัดแปลงหลังการสังเคราะห์โปรตีนหลายอย่างได้
ข้อจำกัด
การย่อยโปรตีนไม่ได้ให้ผลลัพธ์เป็นเปปไทด์ที่วิเคราะห์ได้ง่ายและครอบคลุมลำดับทั้งหมดของโปรตีนเป้าหมายเสมอไป การแตกตัวของเปปไทด์ในเครื่องแมสสเปกโทรเมตรีมักไม่ให้ไอออนที่สอดคล้องกับการแตกตัวที่พันธะเปปไทด์แต่ละพันธะ ดังนั้น ลำดับที่ได้สำหรับแต่ละเปปไทด์จึงไม่จำเป็นต้องสมบูรณ์ วิธีการแตกตัวแบบมาตรฐานไม่สามารถแยกแยะความแตกต่างระหว่างลิวซีนและไอโซลิวซีนได้ เนื่องจากเป็นไอโซเมอร์กัน
เนื่องจากการสลายตัวแบบเอ็ดแมน (Edman degradation) เกิดขึ้นจากปลาย N-terminus ของโปรตีน ดังนั้นจึงจะใช้ไม่ได้ผลหากปลาย N-terminus นั้นได้รับการดัดแปลงทางเคมี (เช่น โดยการอะเซทิเลชันหรือการสร้างกรดไพโรกลูตามิก) โดยทั่วไปแล้ว การสลายตัวแบบเอ็ดแมนไม่เหมาะสำหรับการระบุตำแหน่งของพันธะไดซัลไฟด์ นอกจากนี้ยังต้องการปริมาณเปปไทด์ 1 พิโคโมลขึ้นไปเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่สังเกตได้ ทำให้มีความไวต่ำกว่าการวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมตรี
การทำนายจากลำดับดีเอ็นเอ/อาร์เอ็นเอ
ในทางชีววิทยา โปรตีนถูกสร้างขึ้นโดยการแปลรหัสของอาร์เอ็นเอส่งสาร (mRNA) โดยลำดับของโปรตีนได้มาจากลำดับของโคดอนใน mRNA mRNA เองก็เกิดขึ้นจากการถอดรหัสของยีนและอาจมีการเปลี่ยนแปลงเพิ่มเติม กระบวนการเหล่านี้เป็นที่เข้าใจกันดีพอที่จะใช้ขั้นตอนวิธีทางคอมพิวเตอร์ในการทำนายลำดับโปรตีนจากลำดับดีเอ็นเอโดยอัตโนมัติ เช่น จากโครงการถอดรหัสดีเอ็นเอทั้งจีโนม และนำไปสู่การสร้างฐานข้อมูลขนาดใหญ่ของลำดับโปรตีน เช่นUniProtลำดับโปรตีนที่ทำนายได้เป็นทรัพยากรที่สำคัญสำหรับการระบุโปรตีนด้วยแมสสเปกโทรเมตรี
ในอดีต ลำดับโปรตีนสั้นๆ (10 ถึง 15 หน่วยย่อย) ที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วยวิธี Edman degradation จะถูกแปลงกลับเป็นลำดับดีเอ็นเอ ซึ่งสามารถใช้เป็นโพรบหรือไพรเมอร์เพื่อแยกโคลนโมเลกุลของยีนที่เกี่ยวข้องหรือดีเอ็นเอเสริม จากนั้นจึงกำหนดลำดับของดีเอ็นเอที่โคลนได้และนำมาใช้ในการอนุมานลำดับกรดอะมิโนทั้งหมดของโปรตีน
เครื่องมือชีวสารสนเทศ
มีเครื่องมือ ทางชีวสารสนเทศที่ช่วยในการตีความสเปกตรัมมวล (ดูการจัดลำดับเปปไทด์แบบ de novo ) เพื่อเปรียบเทียบหรือวิเคราะห์ลำดับโปรตีน (ดูการวิเคราะห์ลำดับ ) หรือค้นหาฐานข้อมูลโดยใช้ลำดับเปปไทด์หรือโปรตีน (ดูBLAST )
การประยุกต์ใช้ในด้านการเข้ารหัส
เมื่อไม่นานมานี้ มี การเสนอว่าความยากลำบากในการจัดลำดับโปรตีนเป็นพื้นฐานสำหรับการสร้างโปรแกรม k-time ซึ่งเป็นโปรแกรมที่ทำงานได้ k ครั้งก่อนที่จะทำลายตัวเอง การสร้างสิ่งเช่นนี้ด้วยซอฟต์แวร์เพียงอย่างเดียวเป็นไปไม่ได้ เพราะซอฟต์แวร์ทุกชนิดสามารถคัดลอกได้ไม่จำกัดจำนวนครั้ง