โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ CRISPR 12a
Acidaminococcus sp. Cas12a PDB : 5B43
ตัวระบุ
เครื่องหมาย	แคส12เอ
อินเตอร์โปร	IPR027620
โครงสร้างโปรตีนที่มีอยู่: พีดีบี   IPR027620   อัลฟาโฟลด์ IPR027620

Cas12a ( โปรตีน12aที่เกี่ยวข้องกับCRISPRซึ่งก่อนหน้านี้คือ Cpf1 ) เป็นเอนโดนิวคลีเอส - เอ็กโซนิวคลีเอสที่ เกี่ยวข้องกับ CRISPR ประเภท V คลาส II ^{[ 1 ]}ในแบคทีเรีย เช่นF. novicida [ ^{2 ] [ 3 ] ใน}บริบทตามธรรมชาติ Cas12a จะกำหนดเป้าหมายและทำลายสารพันธุกรรมของไวรัสและองค์ประกอบทางพันธุกรรมเคลื่อนที่ จากภายนอกอื่นๆ ในสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย crRNA ประกอบด้วยบริเวณคงที่ที่ Cas12a จดจำได้ และบริเวณ "สเปเซอร์" ที่เสริมกับชิ้นส่วนของกรดนิวคลีอิกจากภายนอก (เช่น ส่วนหนึ่งของ จีโนม ของฟาจ ) ที่เคยติดเชื้อเซลล์มาก่อน^{[ 4 ]}

Cas12a แตกต่างจาก Cas9 ตรงที่มันสร้างการตัดแบบเหลื่อมใน DNA สองสาย ซึ่งแตกต่างจากปลายทู่^{[ 5 ]}มันอาศัยโมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ (PAM) ที่มี 'T-rich' (โดยทั่วไปคือ 5'-TTTV-3' โดยที่ V คือ A, C หรือ G) ซึ่งให้ไซต์ทางเลือกเมื่อเทียบกับ PAM ที่มี 'G-rich' (โดยทั่วไปคือ 5'-NGG-3') ที่ Cas9 นิยมใช้^{[ 6 ]}และมันต้องการเพียง CRISPR RNA (crRNA) สำหรับการกำหนดเป้าหมายที่มีประสิทธิภาพ ในขณะที่ Cas9 จำเป็นต้องใช้ทั้ง crRNA และtrans -activating crRNA (tracrRNA) ^{[ 7 ]}

กิจกรรมการกำหนดเป้าหมาย DNA ที่ตั้งโปรแกรมได้ของ Cas12a ทำให้เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการประยุกต์ใช้ในด้านเทคโนโลยีชีวภาพและการวิจัยทางชีววิทยา โดยการดัดแปลงลำดับสเปเซอร์ใน crRNA นักวิจัยสามารถกำหนดเป้าหมาย Cas12a ไปยังลำดับ DNA ที่เฉพาะเจาะจง ทำให้สามารถดัดแปลง DNA แบบกำหนดเป้าหมาย ได้^{[ 8 ]} Cas12a แตกต่างจากโปรตีน Cas อื่นๆ ตรงที่มี ไซต์ออกฤทธิ์ RuvC เพียงไซต์เดียว มีความชอบ โมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ 5' และมีการสร้างปลายเหนียวแทนที่จะเป็นปลายทู่ที่ไซต์ตัด ความแตกต่างเหล่านี้และอื่นๆ ทำให้เหมาะสมยิ่งขึ้นสำหรับการใช้งานบางอย่างนอกเหนือจากการวิจัยพื้นฐานแล้วระบบ CRISPR-Cas12a อาจมีการประยุกต์ใช้ในโรคทางพันธุกรรมและการขับเคลื่อนยีน^{[ 8 ]}

คุณลักษณะของ Cas12a อาจทำให้ Cas12a มีข้อได้เปรียบเหนือ Cas9 ในบริบทของการแก้ไขยีน ตัวอย่างเช่น ขนาดที่เล็กกว่าของ crRNA ของ Cas12a ทำให้เหมาะสำหรับการแก้ไขจีโนมแบบมัลติเพล็กซ์ ช่วยให้สามารถบรรจุ guide RNA จำนวนมากขึ้นลงในเวกเตอร์เดียวเมื่อเทียบกับ guide RNA เดี่ยว (sgRNA) ของ Cas9 ^{[ 9 ]}ส่วนที่ยื่นออกมา 5′ ที่เหนียวแน่นซึ่งสร้างโดย Cas12a ยังสามารถใช้สำหรับการประกอบ DNA ด้วยความจำเพาะต่อเป้าหมายที่สูงกว่าการโคลนนิ่งด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะแบบดั้งเดิม นอกจากนี้ Cas12a ยังตัด DNA ที่ตำแหน่ง 18–23 คู่เบสถัดจากไซต์ PAM คุณลักษณะนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าลำดับการจดจำยังคงอยู่ครบถ้วนหลังจากการซ่อมแซม ทำให้ Cas12a สามารถทำการตัด DNA ได้หลายรอบ ในทางกลับกัน Cas9 จะตัดเพียง 3 คู่เบสเหนือไซต์ PAM ซึ่งนำไปสู่การกลายพันธุ์แบบ indel จากเส้นทางการเชื่อมต่อปลายที่ไม่เหมือนกัน (NHEJ) ที่สามารถรบกวนลำดับการจดจำ ทำให้ป้องกันการตัดในรอบต่อๆ ไปได้ คุณสมบัติที่โดดเด่นของ Cas12a เมื่อเปรียบเทียบกับ Cas9 คือความสามารถในการคงจับกับ DNA เป้าหมายหลังจากการตัด และสามารถตัดโมเลกุล DNA สายเดี่ยวอื่นๆ ได้โดยไม่เลือกปฏิบัติ คุณสมบัตินี้เรียกว่า "การตัดแบบคอลลาเทอรัล" หรือ "การตัดแบบทรานส์" ซึ่งถูกนำมาใช้ในการพัฒนาเทคโนโลยีการวินิจฉัยต่างๆ^{[ 10 ]}

แม้ว่า Cas12a จะถูกจัดอยู่ในกลุ่มนิวคลีเอสที่เกี่ยวข้องกับ CRISPR ประเภท V คลาส II แต่ Cas12a ขาดโดเมนเอนโดนิวคลีเอส NHN ที่พบใน Cas9 และอาศัยโดเมนคล้าย RuvC ในการตัด DNA ตามลำดับ ส่งผลให้เกิดปลายที่เหลื่อมกัน^{[ 10 ]}แตกต่างจาก Cas9 Cas12a มีโดเมนคล้ายนิ้วสังกะสีที่เป็นเอกลักษณ์ ซึ่งอาจมีส่วนช่วยในการจับกับ DNA หรือความเสถียรของโครงสร้าง ข้อได้เปรียบที่สำคัญของ Cas12a เหนือ Cas9 คือกิจกรรม RNase ที่มีอยู่ในโดเมน WED ทำให้สามารถประมวลผล crRNA ต้นแบบ (pre-crRNA) เองเป็น crRNA ที่สมบูรณ์ได้^{[ 11 ]}ซึ่งช่วยขจัดความจำเป็นสำหรับ crRNA ที่กระตุ้นการทำงาน (tracrRNA) ทำให้การออกแบบ guide RNA ง่ายขึ้น และอำนวยความสะดวกในการแก้ไขแบบมัลติเพล็กซ์ผ่านการบรรจุ crRNA หลายตัวลงในเวกเตอร์เดียว

การแก้ไขจีโนมแบบมัลติเพล็กซ์เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพซึ่งช่วยให้สามารถแก้ไขยีนหลายตัวพร้อมกันได้ Cas12a มีประโยชน์อย่างยิ่งในบริบทนี้เนื่องจากคุณสมบัติที่ทำให้การใช้งานง่ายขึ้นเมื่อเทียบกับ Cas9 ^{[ 12 ]}ตัวอย่างเช่น Cas12a ต้องการเพียง CRISPR RNA (crRNA) สั้นๆ เพื่อกำหนดเป้าหมายและแก้ไขยีน^{[ 13 ]} crRNA เหล่านี้สามารถมัลติเพล็กซ์ได้อย่างง่ายดายโดยการบรรจุรวมกันในระบบนำส่งเดียว ทำให้สามารถแก้ไขตำแหน่งจีโนมหลายตำแหน่งพร้อมกันได้^{[ 14 ]}

นอกจากนี้ Cas12a และ Cas9 ยังแสดงความแตกต่างในข้อกำหนดของโมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ (PAM) โดยทั่วไปแล้ว Cas9 จะมองหาลำดับที่มี G มาก ในขณะที่ Cas12a จะกำหนดเป้าหมายลำดับที่มี T มาก ความแตกต่างนี้ขยายขอบเขตของไซต์จีโนมที่สามารถกำหนดเป้าหมายได้ ทำให้ Cas12a สามารถแก้ไขยีนในบริเวณที่ Cas9 อาจไม่มีประสิทธิภาพ เช่น บริเวณที่มี AT มากซึ่งพบได้ทั่วไปในจีโนมของพืช^{[ 15 ]}ทำให้มีความยืดหยุ่นมากขึ้นสำหรับนักวิจัย

ความสามารถของ Cas12a ในการส่ง crRNA (CRISPR RNA) ของตัวเองโดยไม่จำเป็นต้องใช้ส่วนประกอบเพิ่มเติม เช่น tracrRNA ที่จำเป็นสำหรับ Cas9 ทำให้การออกแบบและการส่ง guide RNA สำหรับการแก้ไขแบบมัลติเพล็กซ์ง่ายขึ้นไปอีก

โปรตีน Cas12a ประกอบด้วยโดเมนอัลฟา/เบตาแบบผสม โดเมนเอนโดนิวคลีเอสคล้าย RuvC (แบ่งออกเป็นสองส่วนที่ไม่ต่อเนื่องกัน RuvC-I และ RuvC-II) คล้ายกับโดเมน RuvC ของ Cas9 และโดเมนคล้ายนิ้วสังกะสี^{[ 18 ]}แตกต่างจาก Cas9 ตรงที่ Cas12a ไม่มีโดเมนเอนโดนิวคลีเอส HNH และบริเวณปลาย N ของ Cas12a ไม่มีกลีบการรับรู้แบบอัลฟาเฮลิกซ์เหมือนที่พบใน Cas9 ^{[ 17 ]}

ตำแหน่ง Cas12a เข้ารหัส โปรตีน Cas1 , Cas2และCas4ซึ่งมีความคล้ายคลึงกับประเภท I และ III มากกว่าระบบประเภท II การค้นหาในฐานข้อมูลชี้ให้เห็นถึงความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนตระกูล Cas12a ในแบคทีเรียหลายชนิด^{[ 17 ]}

นอกจากนี้ Cas12a ยังแตกต่างจาก Cas9 ตรงที่ไม่ต้องการtracrRNA (ซึ่งในระบบ CRISPR ตามธรรมชาติจะต้องจับคู่เบสกับ crRNA แยกต่างหากก่อนที่จะจับกับโปรตีน Cas) แต่จะจับกับ crRNA เพียงตัวเดียว ทั้ง Cas12a และ guide RNA มีขนาดเล็กกว่าส่วนประกอบโปรตีนและ RNA ของระบบ Cas9 โดย crRNA ของ Cas12a มีความยาวประมาณครึ่งหนึ่งของ sgRNA ที่ใช้กับ Cas9 ^{[ 19 ]}ขนาดที่ลดลงนี้ทำให้ Cas12a เหมาะสมยิ่งขึ้นสำหรับการใช้งาน เช่น การส่งยา ในร่างกายผ่านไวรัสอะดีโนแอสโซซิเอต (AAV) ซึ่งมีความจุในการบรรจุ DNA จำกัดเนื่องจากแคปซิดขนาดเล็ก

คอมเพล็กซ์ Cas12a-crRNA จะตัด DNA หรือ RNA เป้าหมายโดยการระบุโมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ (PAM) 5'-YTN-3' ^{[ 20 ]} (โดยที่ "Y" คือไพริมิดีน^{[ 21 ]}และ "N" คือนิวคลีโอเบส ใดๆ ) ซึ่งแตกต่างจาก PAM ที่อุดมไปด้วย G ที่กำหนดเป้าหมายโดย Cas9 หลังจากระบุ PAM แล้ว Cas12a จะสร้างการแตกของ DNA สองสายแบบเหนียวคล้ายปลายเหนียวที่มีนิวคลีโอไทด์ยื่นออกมา 4 หรือ 5 ตัว^{[ 18 ]}

ระบบ CRISPR-Cas12a ประกอบด้วยเอนไซม์ Cas12a และ RNA นำทางที่ค้นหาและวางตำแหน่งคอมเพล็กซ์ที่จุดที่ถูกต้องบนเกลียวคู่เพื่อตัด DNA เป้าหมาย กิจกรรมของระบบ CRISPR-Cas12a มีสามขั้นตอน: ^{[ 16 ]}

• การปรับตัว: โปรตีน Cas1 และ Cas2 ช่วยให้ชิ้นส่วน DNA ขนาดเล็กสามารถปรับตัวเข้ากับอาร์เรย์ CRISPR ได้
• การสร้าง crRNA: กระบวนการแปรรูป pre-cr-RNA เพื่อสร้าง crRNA ที่สมบูรณ์ซึ่งทำหน้าที่นำทางโปรตีน Cas
• การแทรกแซง: Cas12a จะจับกับ crRNA เพื่อสร้างคอมเพล็กซ์แบบไบนารีเพื่อระบุและตัดลำดับ DNA เป้าหมาย คอมเพล็กซ์ crRNA-Cas12a จะค้นหา dsDNA สำหรับโมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ 5' (PAM) ขนาด 3-6 nt เมื่อพบ PAM แล้ว โปรตีนจะทำให้ dsDNA เสียสภาพเฉพาะที่และค้นหาความสมบูรณ์แบบระหว่างสเปเซอร์ crRNA และโปรโตสเปเซอร์ ssDNA ความสมบูรณ์แบบที่เพียงพอจะกระตุ้นการทำงานของ RuvC และไซต์ที่ใช้งานของ RuvC จะตัดสายที่ไม่ใช่เป้าหมายแล้วจึงตัดสายเป้าหมาย ทำให้เกิดการแตกของ dsDNA แบบเหลื่อมกันโดยมีส่วนยื่น ssDNA 5' (การตัดแบบซิส) ^{[ 18 ] [ 22 ]}

Cas9 เทียบกับ Cas12a

Cas9 ต้องการ โมเลกุล RNA สอง โมเลกุลในการตัด DNA ในขณะที่ Cas12a ต้องการเพียงโมเลกุลเดียว โปรตีนเหล่านี้ยังตัด DNA ในตำแหน่งที่แตกต่างกัน ทำให้ผู้วิจัยมีตัวเลือกมากขึ้นในการเลือกไซต์การแก้ไข Cas9 ตัดทั้งสองสายในโมเลกุล DNA ในตำแหน่งเดียวกัน ทำให้เหลือปลายทู่ Cas12a ทำให้สายหนึ่งยาวกว่าอีกสายหนึ่ง ทำให้เกิดปลายเหนียว ปลายเหนียวมีคุณสมบัติที่แตกต่างจากปลายทู่ในระหว่างการเชื่อมต่อปลายที่ไม่เหมือนกันหรือการซ่อมแซม DNA ที่เหมือนกัน ซึ่งทำให้ Cas12a มีข้อได้เปรียบบางประการเมื่อพยายามแทรกยีน เมื่อเทียบกับ Cas9 ^{[ 16 ]}แม้ว่าระบบ CRISPR-Cas9 จะสามารถปิดใช้งานยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่การแทรกยีนหรือการสร้าง knock-in นั้นเป็นเรื่องท้าทาย^{[ 4 ​​]} Cas12a ขาดtracrRNAใช้ PAM ที่อุดมไปด้วย T และตัด DNA ผ่าน DSB ของ DNA ที่เหลื่อมกัน^{[ 19 ]}

โดยสรุป ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างระบบ Cas12a และ Cas9 คือ Cas12a: ^{[ 23 ]}

• สามารถจดจำ PAM ที่แตกต่างกัน ทำให้สามารถกำหนดเป้าหมายได้ในรูปแบบใหม่ๆ
• สร้างปลายเหนียวที่มีความยาว 4-5 นิวคลีโอไทด์ แทนที่จะเป็นปลายทู่ที่เกิดจาก Cas9 ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการแทรกยีนและความจำเพาะเจาะจงระหว่างNHEJหรือ HDR
• การตัดจะกำหนดเป้าหมาย DNA ที่อยู่ห่างจาก PAM และอยู่ห่างจากจุดตัดของ Cas9 มากขึ้น ทำให้เกิดความเป็นไปได้ใหม่ๆ ในการตัด DNA

คุณสมบัติ	แคส9	แคส12เอ
โครงสร้าง	ต้องใช้ RNA สองชนิด (หรือทรานสคริปต์แบบฟิวชั่น 1 ชนิด (crRNA+tracrRNA=sgRNA))	ต้องใช้ crRNA หนึ่งตัว
กลไกการตัด	การตัดปลายทู่	การตัดปลายแบบเหลื่อมกัน
พื้นที่ตัด	อยู่ใกล้กับจุดรับรู้	อยู่ห่างจากจุดรับรู้
เว็บไซต์เป้าหมาย	จี-ริช พีเอเอ็ม	พีเอเอ็มที่อุดมด้วยที

เอนโดนิวคลีเอส Cas12 น่าจะวิวัฒนาการมาจาก เอนโดนิวคลีเอส TnpBของทรานสโพซอนตระกูล IS200/IS605 ในที่สุด TnpBซึ่งยังไม่ "ถูกทำให้เชื่อง" ในระบบภูมิคุ้มกัน CRISPR นั้นสามารถทำการตัดแบบนำทางด้วย RNA โดยใช้ระบบแม่แบบOmegaRNA ได้ ^{[ 24 ]}

ปัจจัยหลายประการมีอิทธิพลต่อประสิทธิภาพและความจำเพาะของเป้าหมายเมื่อใช้ CRISPR รวมถึงการออกแบบไกด์ RNA มีการพัฒนารูปแบบการออกแบบและเครื่องมือซอฟต์แวร์ CRISPR-Cas จำนวนมาก สำหรับการออกแบบไกด์ RNA ที่เหมาะสมที่สุด ซึ่งรวมถึง SgRNA designer, CRISPR MultiTargeter, SSFinder ^{[ 25 ]}นอกจากนี้ ยังมีแอนติบอดีเชิงพาณิชย์ที่สามารถใช้ตรวจจับโปรตีน Cas12a ได้^{[ 26 ]}